茶樹ICE基因家族鑒定及CsICE43克隆和低溫表達分析

摘要：近年來全球極端低溫天氣頻發，嚴重影響了茶樹的產量和品質。ICE（Inducer of CBF expression）基因家族主要參與植物的低溫脅迫響應，但在茶樹領域中的相關研究還不夠全面。本研究從茶樹基因組中鑒定出51個茶樹CsICEs基因，對其理化性質、基因結構和啟動子順式作用元件展開生物信息學分析。茶樹CsICEs基因的啟動子區域富含光響應、植物激素、生長發育及非生物脅迫相關順式作用元件，其可能參與多種逆境脅迫響應。轉錄組分析和RT-qPCR驗證結果發現，低溫下CsICE43基因的表達量上升了4.24倍，其可能與茶樹低溫響應相關。以茶樹品種‘保靖黃金茶1號’的cDNA為模板，克隆獲得了CsICE43基因，其在不同組織中的表達模式存在差異，在頂芽和嫩葉中特異性高表達。蛋白氨基酸序列和系統進化樹分析表明，CsICE43基因包含與ICE家族其他成員一致的S-rich、bHLH、ACT等保守結構域，且與毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）的親緣關系較近。在STRING在線網站中以擬南芥AtICEs為模型，推測茶樹CsICE43蛋白與HOS1、MYB15、DREB1/2存在潛在的互作關系。亞細胞定位試驗表明CsICE43定位于細胞核，與跨膜結構分析結果一致。綜上所述，本研究發現CsICE43基因可能與茶樹低溫響應關聯，為深入挖掘其基因功能與抗寒分子機理提供了一定的理論基礎。

關鍵詞：茶樹；ICE基因家族；抗寒；生物信息學；表達分析

中圖分類號：S571.1；S435.711" " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " "文章編號：1000-369X（2025）01-0043-18

Identification of Tea ICE Gene Family and Cloning and Expression Analysis of CsICE43 under Low-temperature

ZHU Qian， SHAO Chenyu， ZHOU Biao， LIU Shuoqian， LIU Zhonghua， TIAN Na*

National Engineering Research Center for the Utilization of Plant Functional Components， Key Laboratory of Tea Science， Ministry of Education， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract： In recent years， extreme low-temperature weather has frequently occurred worldwide， significantly affecting the yield and quality of tea plants. The ICE （Inducer of CBF expression） gene family plays a crucial role in the low-temperature stress response of plants. However， research specifically focused on tea plants is still limited. This study identified 51 ICE genes from the tea genome and performed a bioinformatics analysis to examine their physical and chemical properties， gene structure， and promoter cis-acting elements. The promoter regions of the CsICE genes are rich in cis-acting elements related to light response， plant hormones， growth and development， and abiotic stress， suggesting their involvement in various stress responses. Transcriptome analysis and RT-qPCR verification indicate that the expression of the CsICE43 increased 4.24 folds under low-temperature conditions， highlighting its potential role in the low-temperature response of tea plants. To further investigate this， the cDNA of tea cultivar‘Baojing Golden Tea No. 1’ was used as a template to clone the CsICE43 gene. Its expression varied across tissues， with exceptionally high levels observed in terminal buds and young leaves. Further amino acid sequence and phylogenetic tree analysis indicate that the CsICE43 gene contains conserved domains such as S-rich， bHLH， and ACT， which are consistent with other members of the ICE family. It is closely related to Actinidia eriantha. The STRING online database utilized Arabidopsis thaliana AtICEs to hypothesize potential interactions between CsICE proteins and HOS1， MYB15， and DREB1/2. Subcellular localization experiments demonstrate that CsICE43 is located in the nucleus， which is consistent with the findings from the transmembrane structure analysis. In summary， this study suggests that the CsICE43 gene may be associated with the low-temperature response in tea plants， providing a theoretical foundation for further exploration of its gene function and the molecular mechanisms underlying cold resistance.

Keywords： Camellia sinensis， ICE gene family， cold resistance， bioinformatics， expression analysis

茶樹［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］是世界范圍內廣泛種植的重要經濟作物[1]。然而，近年來全球氣候變化引起了多種極端天氣，特別是低溫，對茶樹的生長發育和品質產生不利影響[2]。茶樹春季和越冬期遭受低溫冷害、凍害已經成為制約我國茶產業發展的重要問題[3]。因此研究茶樹的抗寒機理對提高茶樹的抗寒性，以及選育茶樹抗寒性新品種都具有重要意義。

當植物面臨低溫脅迫時，存在于體內的大量轉錄因子會激活一系列基因的表達，從而增強對低溫脅迫的耐受性[4]。目前，研究者已經在植物中挖掘到了3個主要的冷響應基因：C-重復結合因子（CBFs）、CBF表達誘導因子（ICE）和冷誘導基因（CORs）。CBF信號調控途徑是目前植物對低溫反應機制中研究最為透徹的途徑，即ICE-CBF-COR轉錄級聯。ICE基因屬于螺旋-環-螺旋（bHLH）轉錄因子家族，含有高度保守的bHLH結構域。它位于CBF冷響應通路上游，能夠誘導CBF基因的表達，從而提高植物的低溫耐受能力[5]。COR基因是由冷脅迫調節的一類基因，能在某些特定的條件（低溫、短日照等）下被激活以響應多種冷調節蛋白，進而提高植物對低溫脅迫的耐受性[6]。COR基因啟動子區域中含有與脅迫相關的脫水響應元件（DRE）[7]和低溫響應元件（CRT）[8]。當植物感受低溫時，CBF上游的ICE轉錄因子表達量會增加，促進CBF與COR基因啟動子區的DRE/CRT順式作用元件特異性結合，激活COR基因的表達，從而提高植物的抗寒性[9]。Gilmour等[10]和Chinnusamy等[11]的研究表明，常溫條件下ICE并無表達，但當植物遭遇低溫時，ICE基因開始被活化、被磷酸化修飾或結合其他蛋白，產生的ICE蛋白可與DREB啟動子上的MYC順式元件結合，啟動其表達，調控下游RD29A基因的表達，從而提高擬南芥的抗寒性。ICE基因在植物抵御低溫脅迫中發揮著重要的作用。目前已經在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）[12]和龍眼（Dimocarpus longan）[13]等多個植物物種中鑒定出ICE基因，研究表明龍眼DlICE1的過表達增加了轉基因煙草的耐寒性[13]。過表達水稻OsICE1同時提高了擬南芥的耐寒性[14]、耐旱性和光合作用效率[15]。

在茶樹中，品質好、抗性強的茶樹品種資源是茶葉高產優質的前提。因此，研究茶樹CsICEs基因家族如何調控茶樹在低溫脅迫下的生長發育具有重要意義。目前，茶樹抗寒機理研究在生理和分子等方面取得了一定進展。Li等[16]從茶樹中分離出一個新的冷調節基因CsCOR1，發現在轉基因煙草中過表達茶樹CsCOR1明顯提高了轉基因煙草對鹽和干旱脅迫的耐受性。Wang等[17]發現CsCBF1蛋白具有與擬南芥RD29A[7]啟動子中DRE/CRT順式元件結合的能力。Ding等[18]發現在低溫（4、﹣5 ℃）脅迫下CsICE1的表達量顯著升高。Gilmour等[10]推測ICE除了可以調控CBF的轉錄，可能還調控其他與低溫相關基因的表達。本研究利用全基因組鑒定方法對茶樹CsICEs基因家族進行分析，結合轉錄組數據和RT-qPCR驗證，篩選到CsICE43基因。對其進行同源克隆以及生物信息學分析，為茶樹ICE基因參與響應低溫脅迫提供了理論依據，旨在為進一步分析其在低溫脅迫中的功能提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

本研究以來自湖南省茶葉研究所高橋基地（113°08′ E，28°20′ N）的一年生茶樹幼苗‘保靖黃金茶1號’為試驗材料。將植株放置在通風透氣的透明溫室中適應生長1個月。選取生長良好且長勢一致的茶樹放入低溫培養箱中進行低溫處理（LT，晝夜溫度0 ℃/4 ℃，光照16 h，光照強度10 000 lx，黑暗8 h，3 d）和恢復常溫（R，25 ℃恢復3 d），并設置對照組（CK，25 ℃，光照16 h，光照強度10 000 lx，黑暗8 h）。分別取CK、LT和R 3組植株的一芽二葉在液氮中冷凍，并在﹣80 ℃下保存以供進一步分析。設置3個生物學重復。對生長良好且長勢一致的茶樹的不同器官進行取樣（頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、莖、花、果、根），置于液氮中冷凍后保存于﹣80℃冰箱，用于后續組織表達量分析。

1.2 RNA提取和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析

茶樹葉片總RNA提取采用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation試劑盒（Vazyme，中國）。使用Evo M-MLV反轉錄試劑預混液（Agbio，中國）從總RNA中合成用于RT-qPCR的第一條鏈cDNA。使用BYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒（Agbio，中國）在QuantStudio 3定量PCR儀（Thermo fisher scientific，USA）進行RT-qPCR。反應體系總體積20 μL，包含10 μL 2X SYBR Green Pro Tag HS Premix，上、下游引物各0.4 μL，1 μL cDNA模板，RNase free water補足到20 μL。反應程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。設置3個生物學重復，以β-actin為內參基因，采用 法計算基因的相對表達量[19]。使用National Center for Biotechnology Information（NCBI）設計引物（表1）。

1.3 茶樹CsICEs基因家族成員鑒定

茶樹蛋白質序列從TPIA（http：//tpia. teaplants.

cn/index.html）下載，并構建本地數據庫。從Pfam數據庫下載bHLH結構域對應的隱馬爾可夫模型文件（PF00010），使用TBtools軟件中的本地工具Simple HMM Search在蛋白數據庫中查找相似序列，設置E≤1×10-20，獲得候選基因家族成員。擬南芥AtICEs蛋白序列從TAIR（https：//www.arabidopsis.org）下載，并以此為問詢序列，利用NCBI Blast和SMART[20]對已鑒定的ICE結構特性全面分析，最終獲得茶樹ICE基因家族成員信息。

1.4 茶樹CsICEs基因家族蛋白質理化性質和亞細胞定位預測

使用ExPASy網站（http：//web.expasy.org/protparam）預測茶樹CsICEs基因家族蛋白理化性質。利用SoftBerry ProtComp 9.0網站（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）預測茶樹CsICEs蛋白的亞細胞定位。

1.5 茶樹CsICEs基因家族結構和順式元件分析

從TPIA下載gff3文件，提取基因信息，在GSDS網站上繪制茶樹CsICEs基因結構（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）。利用MEME在線網站（http：//meme-suite.org/tools/meme）對CsICEs蛋白序列中的保守基序展開分析，利用TBtools軟件分析內含子、外顯子、染色體位置信息并可視化繪圖。利用PlantCARE網站對CsICEs基因家族成員轉錄起始位點上游2 000 bp的啟動子區域進行順式作用元件分析，對其結果篩選排序后利用Tbtools軟件中Simple Bio Sequence Viewer模塊進行可視化。

1.6 轉錄組測序

前期研究采集了低溫處理（與本研究相同處理參數）0、2 d和恢復5 d的茶樹葉片樣品，送至武漢邁維代謝生物科技股份有限公司進行轉錄組測序。植物樣本采用乙醇沉淀法和CTAB-PBIOZOL進行提取后，使用Qubit熒光定量儀和Qsep400高通量生物片段分析儀對總RNA進行鑒定和定量。隨后進行文庫構建與質量檢查，合格后進行上機測序。數據分析使用fastp對原始數據進行過濾，主要去除帶接頭（adapter）的reads：當任一測序reads中N含量超過該reads堿基數的10%時，去除此paired reads；當任一測序reads中含有的低質量（Q≤20）堿基數超過該條reads堿基數的50%時，去除此paired reads。后續所有分析均是基于clean reads，獲得有效的clean reads并比對到參考基因組（http：//tpia.teaplants.cn/download.html）。基于前期轉錄組數據，本研究深入開展一系列茶樹抗寒分析。

1.7 茶樹CsICE43的跨膜結構、蛋白結構分析和互作蛋白分析

采用在線軟件TMHMM Server v. 2.0（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）對CsICE43的跨膜結構進行分析；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和Swiss-Model在線網站（http：//www.swissmodel. expasy.org）分別對茶樹CsICE43蛋白的二級結構和三級結構進行預測。以擬南芥AtICEs蛋白為模型，利用STRING在線網站（https：//string-db.org/cgi）預測CsICEs蛋白潛在的互作關系。

1.8 茶樹CsICE43氨基酸序列比對和系統進化樹構建

利用Clustal X工具對茶樹CsICE43蛋白序列和多個植物物種的ICE蛋白序列進行比對，然后用Gene Doc軟件進行編輯。采用Clustw 2.0和MEGA 4.0軟件對NCBI公共數據庫中已鑒定的多個ICE-like蛋白的編碼區全長氨基酸序列構建系統進化樹。系統發育樹構建采用鄰接法重復1 000次。

1.9 亞細胞定位分析

將CsICE43的全長編碼序列插入到融合了GFP的載體pEAQ-GFP中，形成pEAQ-CsICE43-GFP構建體。將其轉入GV3101根癌農桿菌中，并將攜帶綠色熒光蛋白的構建體的農桿菌菌株（菌株的OD600值為0.6～0.8）注射煙草。在25 ℃弱光條件下處理12 h，將其轉移至正常光照條件下處理48 h，使用Axio Scope.A1正置式熒光顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）檢測GFP信號。引物見表1。

1.10 數據統計與分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0（IBM，美國）進行相關性分析，Student’t檢驗，以及Duncan’多重比較，Plt;0.05表示顯著性。數據采用平均值±標準差（Mean±SD）表示，3次及以上重復。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美國）進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsICEs基因家族成員鑒定結果

基于隱馬爾可夫模型及擬南芥AtICEs同源序列比對，對茶樹舒茶早基因組進行Blast檢索，并結合TBtools軟件，共鑒定得到51個CsICEs家族成員。根據其染色體位置命名為CsICE1～CsICE51（表2）。CsICEs基因家族成員的蛋白理化性質差異較大，其編碼129～741個氨基酸，相對分子量（Mw）在15.02～81.02 kDa，理論等電點（pI）為4.75～10.16。其中理論等電點小于7的ICE數量超過一半，說明CsICEs大多為酸性蛋白。51個CsICEs蛋白不穩定指數為40.65～92.87，說明茶樹中所有的ICEs較為不穩定。CsICEs蛋白的脂肪指數為53.72～99.28，CsICEs蛋白親水性指數為﹣0.895～﹣0.278，這說明CsICEs均為親水蛋白。通過亞細胞定位預測顯示51個CsICEs蛋白均定位在細胞核上，為核蛋白。

2.2 茶樹CsICEs基因結構分析

為了更好地了解CsICEs基因家族的進化和結構多樣性，分別對茶樹CsICEs基因家族的保守基序、結構域和基因結構的進化關系進行分析。通過在線工具MEME對51個CsICEs家族蛋白保守基序進行分析，結果顯示（圖1A，圖1B），51個茶樹CsICEs總共鑒定到10個保守基序。根據同一家族中的保守基序的分布，可以將該家族劃分為兩亞組：第Ⅰ組所有成員的基序數量為1～3個，少數成員只含有基序1；第Ⅱ組成員基序分布較為相似，大部分成員都含有基序1～6和基序10，少數成員只含有基序1～3和基序6，如CsICE21，而CsICE15、CsICE34只含有基序1、基序2和基序6，CsICE37只含有基序1和基序6。同一亞組中密切相關的成員具有相對一致的基序組成，這意味著它們可能具有相似的功能。不同亞族的CsICEs蛋白保守基序有些許差別，這可能與不同亞族之間的功能差異有關，體現了CsICEs基因的相似性和多樣性。

基因結構分析結果顯示（圖1C），各個成員間外顯子個數及基因長度差異較大。內含子相位（Intron phase）表示內含子位于密碼子不同堿基后的位置情況，51個CsICEs成員中只有CsICE44存在phase0、phase1和phase2，少部分成員存在phase0、和phase2，其余含有內含子的家族成員內含子相位均為phase0。

2.3 茶樹CsICEs基因家族啟動子區順式作用元件分析

利用在線網站PlantCARE對茶樹CsICEs基因家族成員基因翻譯起始位點上游2 000 bp啟動子順式作用元件進行分析，結果顯示，茶樹CsICEs基因家族啟動子區域包含豐富的順式作用元件（圖2）。根據功能注釋可將這些順式作用元件分為4類：（1）光響應元件表明CsICEs

基因家族成員可能受光誘導；（2）與脫落酸（Abscisic acid，ABA）、生長素（Indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（Gibberellins，GA）和茉莉酸甲酯（Methyljasmonate，MeJA）等激素相關反應或調節元件，由ABA響應（ABRE）、IAA響應（AuxRR-core）、GA響應（P-box）和MeJA響應（CGTCA-motif）等應答元件組成，說明CsICEs基因家族成員表達可能受多種植物激素調控；（3）由響應低溫脅迫、干旱及厭氧誘導等非生物脅迫響應元件組成，包括低溫反應（LTR）、響應干旱誘導（MBS）和厭氧誘導反應（ARE）等元件，提示CsICEs基因可能參與調控多種逆境響應；（4）與植物生長發育相關元件，包括胚乳表達相關元件和分生組織表達響應元件等。上述結果表明，CsICEs基因可能參與多種逆境響應，并在茶樹的生長發育中起重要作用。

2.4 茶樹低溫轉錄組分析與基因篩選

前期研究對低溫處理下0、2 d和恢復5 d（R5d）的茶樹葉片進行了轉錄組測序，結果發現每個堿基位置的測序錯誤率都低于0.5%，符合質檢要求（圖3）。GC含量分布分析表明G和C堿基及A和T堿基含量在每個測序循環上均相等，且整個測序過程穩定不變（圖4）。但由于隨機引物擴增偏差等原因，測序得到的每個read前6～7個堿基有較大的波動，這種波動屬于正常情況。同時，測序得到的原始測序序列，含有帶接頭的、低質量的reads。為了保證分析質量，必須對raw reads進行過濾，得到clean reads，后續分析都基于clean reads（圖5）。測序結果符合質檢要求后，本研究對轉錄組中51個CsICEs基因表達量進行了聚類熱圖分析（圖6A）。結果將所有CsICEs基因分為了6大類，如CsICE5、CsICE11和CsICE43等的共性是在低溫下表達量顯著上升，在恢復常溫后降低。而CsICE4、CsICE7和CsICE8等表達量在低溫下顯著降低。因此，本研究選取了在低溫下表達量上升的CsICEs基因，在CK組、LT組和R組中進行了RT-qPCR驗證（圖6B）。結果均符合轉錄組測序結果，其中CsICE43的表達量上升倍數最高，因此本研究聚焦該基因進行下一步的深入探究。

2.5 茶樹CsICE43基因克隆及RT-qPCR驗證

基于轉錄組數據以及RT-qPCR驗證分析，根據GenBank數據庫中登錄的CsICE43基因（XM_028201366.1）設計特異性引物，以‘保靖黃金茶1號’茶樹cDNA為模板進行PCR擴增。CsICE43基因PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到清晰的陽性條帶（圖7A）。回收目的條帶并將其與T載體連接，轉化大腸桿菌，菌落PCR驗證后送樣測序，經比對，測序序列與目標序列結果一致，條帶長度為576 bp。

為明確ICE基因家族在茶樹低溫脅迫下的轉錄水平，本研究采用RT-qPCR對CsICE43進行檢測。結果顯示，與對照組（CK）相比，低溫處理后CsICE43的表達明顯被誘導，其表達量顯著上升（圖7B）（Plt;0.001）。

2.6 茶樹CsICE43基因表達特性分析

RT-qPCR分析結果顯示（圖8），CsICE43基因在‘保靖黃金茶1號’各器官表達模式上存在差異。CsICE43在頂芽和嫩葉的相對表達量顯著高于其他器官，而在花中的相對表達量最低，這一發現表明CsICE43可能在茶樹的頂芽和嫩葉中發揮重要作用。與此同時，低溫脅迫下茶樹的嫩葉和頂部枝葉比老葉更易受到損傷。因此，可以推測CsICE43基因在嫩葉中的高度表達可能與茶樹對低溫脅迫的響應和適應性密切相關，特別是在保護嫩葉免受低溫傷害方面可能起著關鍵作用。這種基因表達模式強調了對CsICE43在茶樹抗寒性中作用進一步研究的重要性，以期通過遺傳改良提高茶樹的耐寒能力。

2.7 茶樹CsICE43蛋白跨膜結構分析

跨膜結構分析表明（圖9），CsICE43蛋白各氨基酸位點處于膜外的概率極接近1，可信度較高。這表明CsICE43蛋白整條多肽鏈位于細胞膜外，不存在跨膜區，屬于非跨膜蛋白。

2.8 茶樹CsICE43蛋白二、三級結構分析

SOPMA預測結果顯示CsICE43蛋白包含4種二級結構形式，其中無規則卷曲占61.17%，是最主要的二級結構。其次α-螺旋、延伸鏈和β-轉角分別占26.89%、8.71%和3.22%，不存在β-折疊（圖10A）。以匹配度最高的中國軟毛獼猴桃A0A2R6QG68.1模型為模板建模，得到蛋白三級結構模型（圖10B），相似度高達81.7%，分數較高，說明建模結果可信度較高。且CsICE43蛋白質三級結構多由無規則卷曲和α-螺旋構成，這也與二級結構預測的結果相符。

2.9 茶樹CsICE43蛋白氨基酸序列和系統發育分析

為了進一步研究茶樹CsICE43蛋白的進化關系，利用DNAMAN將CsICE43蛋白與其他植物物種的ICE蛋白進行比對，發現CsICE43蛋白序列與其他植物蛋白序列高度同源。CsICE43蛋白在N端和C端分別含有1個保守的富含絲氨酸（S-rich）結構域和ACT-like結構域，以及保守的bHLH和NLS結構域，與ICE家族其他成員一致（圖11A）。使用MEGA 4.0軟件進行系統進化樹構建，結果表明，茶樹CsICE43與毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）親緣關系最近，與檀香（Santalum album）親緣關系最遠（圖11B）。

2.10 茶樹CsICE43互作蛋白分析

利用STRING在線網站，以擬南芥AtICEs為參考，進行茶樹CsICE43潛在的互作蛋白預測，根據系統發育關系將二者進行對應。結果發現，茶樹CsICE43蛋白與擬南芥低溫響應基因1編碼蛋白（High expression of osmotically responsive gene 1，HOS1）、MYB15、DREB1/2存在潛在的互作關系（圖12）。

2.11 茶樹CsICE43基因的亞細胞定位分析

為了驗證CsICE43基因的亞細胞定位情況，在煙草中短暫表達pEAQ-CsICE43-GFP，以pEAQ-GFP作為對照。通過熒光顯微鏡檢測熒光信號，結果發現在陽性對照中整個細胞都能觀察到綠色熒光，而導入pEAQ-CsICE43-GFP融合質粒農桿菌的煙草只在細胞核中檢測到綠色熒光信號（圖13），說明CsICE43基因定位于細胞核中，屬于核蛋白。

3 討論

茶樹作為一種多年生常綠木本植物，對溫度變化極為敏感，尤其是低溫環境對其生長有著顯著影響[21]。近年來，“倒春寒”等惡劣氣候頻發，茶樹新梢的抗寒能力對保障春茶產量顯得尤為重要[22]。茶樹抗寒機理研究一直是茶樹研究領域的重要部分。近年來，隨著茶樹抗寒分子機理研究的深入，已成功鑒定和證明了抗寒性受幾個主效基因控制，其中主要包括ICE1、CBF/DREB基因家族和COR基因家族等[23]。本研究采用全基因組鑒定的方法從茶樹基因組數據庫中鑒定出51個茶樹ICEs基因家族成員，它們大多數為酸性蛋白，且所有蛋白均屬于不穩定的親水蛋白（表2）。51個茶樹ICEs基因分布在14條染色體上。CsICEs基因家族成員蛋白劃分為2個亞家族，亞家族成員間保守結構域排列較為相似，與已報道的研究結果相一致[24]。研究表明，植物可通過激活水

楊酸（SA）[25]、脫落酸[26]和茉莉酸[27]信號聯級網絡，介導ICE轉錄因子來調節植物對生物和非生物脅迫的響應機制及發育進程。本研究對已鑒定出的51個CsICEs基因的順式元件進行分析發現，其主要包括光響應元件，ABA、IAA等激素相關反應或調節元件，低溫脅迫、干旱及厭氧誘導等非生物脅迫響應元件，與植物生長發育相關元件（圖2）。表明CsICEs基因家族可能參與光響應、植物激素以及非生物脅迫應答等多種生物學過程。這與Wang等[28]的研究結果一致。以上這些結果在一定程度上驗證了CsICEs基因挖掘的準確性，也為揭示CsICEs基因在茶樹生長發育和抵抗外界脅迫中的作用機理研究提供理論參考。

本研究通過轉錄組數據以及RT-qPCR驗證數據分析發現，在低溫下表達量上升的CsICEs基因中，CsICE43基因的相對表達量上升倍數最高（圖3～圖6），從而聚焦到CsICE43基因。CsICE43基因在不同組織中的表達模式發現其在茶樹頂芽、嫩葉中的表達量最高（圖8）。已有研究報道發現，茶樹在低溫脅迫下，CsICE基因在葉中的表達量最高，是根、莖、果中表達量的4倍。特別是在4 ℃低溫處理下，CsICE基因表達量顯著增加[29]，這與本研究結果一致。與此同時，研究發現低溫脅迫下茶樹的嫩葉和頂部枝葉比老葉更易受到損傷，推測茶樹葉片中ICE基因的顯著表達與茶樹在低溫脅迫下的響應密切相關[21]。本研究還發現CsICE43屬于非跨膜蛋白（圖9），其結構主要由無規則卷曲和α-螺旋構成（圖10）。同時通過氨基酸多序列比對發現CsICE43蛋白含有典型的bHLH、S-rich、NLS和ACT-like結構域（圖11A），與已報道的其他雙子葉植物ICE蛋白結構一致[24]。此外，有研究表明[30]，茶樹CsICE1基因C末端的bHLH結構域和拉鏈區域對于靶向下游基因啟動子具有重要意義。綜上可見，CsICE43蛋白具有符合ICE蛋白的結構特征，表明其可能在茶樹中作為轉錄激活因子發揮作用，并調控非生物脅迫相關基因的表達。系統進化樹分析表明，CsICE43基因與毛花獼猴桃親緣關系較近（圖11B），同時，亞細胞定位結果顯示CsICE43定位于細胞核上（圖13）。這一結果與尹盈等[29]在茶樹中的研究結果一致，證明CsICE43基因主要在細胞核中發揮作用。綜上所述，ICE基因在很大程度上參與了植物對非生物脅迫的響應調控，是植物抗逆性的關鍵調控因子之一。

本研究首先對誘導茶樹耐寒性的ICE基因家族進行了蛋白理化性質、基因結構以及順式作用元件分析，揭示了CsICEs基因家族成員在響應低溫脅迫及其他逆境中的潛在作用，以及在茶樹生長發育中的重要性。基于轉錄組數據以及RT-qPCR分析驗證，篩選到CsICE43基因，并對其進行組織表達特異性、蛋白結構、氨基酸序列比對、系統進化樹以及互作蛋白預測等分析，進一步證實了ICE基因參與植物對低溫脅迫響應的調控。同時通過亞細胞定位試驗發現CsICE43基因定位于細胞核中，為進一步探究該基因在低溫脅迫中的功能奠定基礎。

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