基于葉綠體基因組的八角楓屬及近緣屬植物系統發育分析

摘要：為明確八角楓（Alangium chinense （Lour.） Harms）葉綠體基因組的結構特點及系統發育關系，通過Illumina高通量測序技術對八角楓葉綠體基因組進行測序，并進行組裝、注釋和結構分析。利用mVISTA和Geneious軟件對八角楓、毛八角楓、高山八角楓、八角楓MG524996和八角楓NC044840葉綠體基因組進行同源比對和共線性分析，采用MEGA 11軟件構建植物系統發育樹。結果表明，八角楓完整的葉綠體基因組全長156 672 bp，呈雙鏈環狀結構，GC占37.69%；葉綠體基因組共有130個編碼基因，包括81個蛋白質編碼基因（PCGs）、38個tRNA轉運基因、8個rRNA基因和3個假基因，其在葉綠體基因組序列中占比分別為62.31%、29.23%、6.15%和2.31%。同源比對和共線性分析發現，5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）葉綠體基因組間具有高度相似性和共線性。系統發育分析表明，八角楓與高山八角楓親緣關系最為接近，暗示他們在進化上具有共線性，推測該八角楓為新亞種。

關鍵詞：葉綠體基因組；八角楓屬；近緣屬植物；系統發育

中圖分類號：R931" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）01-0168-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.027 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis of systemic development in the genus Alangium chinense and its related genera plants based on chloroplast genome

YANG Yu-xia1， LI Jing-ting 1， LI Ying1，SU Chen2，3，YAN Rui1，WEI Ze-chang1

（1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering， Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou" 730070， China；

2. Henan Key Laboratory of Eco-economic Woody Plant Germplasm Innovation and Utilization， Pingdingshan University， Pingdingshan" 467000， Henan，China； 3. College of Resource Environment and Tourism， Capital Normal University，Beijing" 100048，China）

Abstract： In order to clarify the structural characteristics and phylogenetic relationships of the chloroplast genome of Alangium chinense （Lour.） Harms， Illumina high-throughput sequencing technology was used to sequence the chloroplast genome of Alangium chinense， followed by assembly， annotation， and structural analysis. Using mVISTA and Geneous software， homologous alignment and collinearity analysis were performed on the chloroplast genome of Alangium chinense， Alangium kurzii Craib， Alangium alpinum， Alangium chinense MG524996， and Alangium chinense NC044840. A plant phylogenetic tree was constructed using MEGA 11 software. The results showed that the complete chloroplast genome of Alangium chinense was 156 672 bp in length， with a double-stranded circular structure and a GC proportion of 37.69%；the chloroplast genome consists of 130 coding genes， including 81 protein coding genes （PCGs）， 38 tRNA transport genes， 8 rRNA genes， and 3 pseudogenes， accounting for 62.31%， 29.23%， 6.15%， and 2.31% of the chloroplast genome sequence， respectively. Through homology comparison and collinearity analysis， it was found that the chloroplast genome of five plants （Alangium chinense and four other plants in the Alangium chinense genus） exhibited high similarity and collinearity.Phylogenetic analysis indicated that Alangium chinense was most closely related Alangium alpinum， suggesting their collinearity in evolution. It was speculated that Alangium chinense was a new subspecies.

Key words： chloroplast genome； Alangium chinense genus； related genera plants； systemic development

葉綠體是一種半自主細胞器，具有遺傳信息的表達系統，其染色體不受核基因的影響，主要由母系遺傳決定［1］。高等植物的葉綠體DNA是一種具有雙鏈式的封閉環形結構，其長度隨著物種的不同而變化，它是繼核基因之后的第二大基因組。由于其遺傳信息豐富、相對分子質量低、結構簡單、進化速率適中、突變率低、遺傳穩定性好，常用于物種鑒定、物種演化、物種親本分析、分子系譜地理［2］推斷、物種來源等方面的研究［3］。此外，葉綠體基因組信息還被廣泛用于不同種類植物的基因組學和植物系統發育方面研究［4］。

大多數植物葉綠體基因組都具有很強的保守性。全葉綠體基因組測序顯示，葉綠體基因組包含倒位重復區（IRA和IRB）、 小單拷貝（SSC）和大單拷貝（LSC）［5，6］。在漫長的演化中，葉綠體的基因結構會出現某些變異［7］，如DNA片段的重疊和倒位等，然而并非全部的葉綠體都包含IR，例如少量的低等植物裸藻沒有IR，豌豆則沒有IR和DR，并且rRNA僅有1個拷貝［8］。

八角楓（Alangium chinense （Lour.） Harms）為八角楓科八角楓屬植物，是貴州的一種特色植物以及常用的苗藥，具有祛風除濕、舒筋活絡、散瘀止痛等功效。八角楓具有較好的抗炎鎮痛藥理活性，在涉及炎癥等疾病的治療中有較好的發展前景和應用價值［9］。

本研究采用Illumina Hiseq 2000高通量測序技術，完成八角楓屬及近緣種屬葉綠體基因組測序、拼接和注釋以及基因組重復序列的結構分析和物理圖譜繪制，并構建系統進化樹。旨在進一步了解八角楓的葉綠體基因結構，為八角楓屬新物種的鑒定、種質資源的保護、藥用價值、系統進化、功能基因分析等方面提供分子基礎資料［10］。

1 材料與方法

1.1 材料

八角楓樣本取自湖北省隨州市廣水市大貴寺國家級森林公園的三潭風景區（海拔908 m，31°45′01″N，113°46′33″E）。

1.2 葉綠體基因組測序及拼接

DNA樣本在北京源宜基因科技股份有限公司檢測，使用Illumina Hiseq 2000高通量測序平臺進行雙端測序。首先使用 SOAPdenovo 2.01［11］組裝序列，然后將組裝好的長序列與近緣物種的葉綠體參考基因組進行比較，利用BLAT36程序［12］確定等位基因序列之間的相對位置。根據等位基因的相對位置進行拼接，糾正裝配錯誤，從而獲得葉綠體基因組的全尺寸框架圖。使用 GapCloser 1.12 程序用高質量的短序列填補等位基因序列中的空白，通過單代測序完成和確認剩余的空白和可疑區域，從而獲得最終的葉綠體基因組序列。

1.3 葉綠體基因組序列注釋、提交和物理圖譜繪制

先用CpGAVAS［13］對八角楓葉綠體基因組進行主要注釋，再使用DOGMA［14］（http：//dogma.ccbb.utexas.edu/） 進行輔助注釋。根據注釋結果使用Organellar Genome DRAW［15］（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制葉綠體基因組圖譜。

1.4 葉綠體基因組重復序列分析

使用REPuter分析八角楓的長重復序列，Hamming distance、Maximum computed P repeats、Minimal repeat size的參數分別設置為3、5 000、30［16］。使用MISA［17］對葉綠體基因組中的單序列重復序列（SSR）進行分析，閾值和核苷酸參數分別設置為1、2、3、4、5、6和8、4、4、3、3、3，最小SSR間距為100 bp。

1.5 八角楓屬種間葉綠體基因組同源比對及共線性分析

從NCBI數據庫中獲取八角楓屬4種植物（表1）的葉綠體基因組序列，與八角楓進行基因組同源比對。首先利用在線工具CPGAVAS2對八角楓的葉綠體基因組序列進行注釋，然后利用mVISTA在線軟件進行同源比對，選擇Shuffle-LAGAN（全局比對）模式，以八角楓為參考基因組，將葉綠體基因組序列（fasta格式）及注釋文件上傳進行比對。

利用Geneious 2023.2.1軟件基于Mauve多重基因組比對法將八角楓與從NCBI數據庫中獲取的4種八角楓屬植物葉綠體基因組進行共線性分析。

1.6 系統進化分析

采用MEGA 11軟件，選取與八角楓科親緣關系較相近的藍果樹科、桃金娘科、菱角科、瑞香科、胡頹子科等26種植物，使用鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 葉綠體基因組測序、組裝、注釋

八角楓葉綠體基因組測序原始數據為1.854 G，raw reads為12.280 M，過濾后得到1.501 G（占80.9%）的有效數據和10.220 M（占83.2%）的clean reads，這些reads平均長度為146.8 bp。其基因組為156 672 bp的雙鏈環狀結構，包括1個IR（25 950 bp，IRA和IRB）、1個SSC（18 593 bp）和1個LSC（87 179 bp）（圖1）。

八角楓葉綠體基因組中共有130個編碼基因，其中含有81個蛋白編碼基因（PCGs），在葉綠體所有基因序列中占62.31%，其次，有38個tRNA轉運基因 （29.23%）、8個rRNA基因 （6.15%）和3個假基因（2.31%） 。

2.2 八角楓葉綠體基因組功能及分類

根據基因功能不同將八角楓葉綠體基因分為遺傳系統基因、光合作用基因、功能未知基因和其他基因。每種功能有著不同的基因，這些基因大多與生物合成有關。在這些基因中發現了9個PCG基因（rps12、 rps7、 rpl2、 rpl23、 ndhB、 ycf2、 ycf68、 ycf15、 ycf1），8個tRNA基因（trnH-GUG、 trnI-CAU、 trnL-CAA、 trnI-GAU、 trnV-GAC、 trnA-UGC、 trnR-ACG、 trnN-GUU），4個rRNA基因（rrn4.5、 rrn5、 rrn16、 rrn23）（表2）。

2.3 葉綠體基因組重復序列分析

利用REPuter軟件分析八角楓的長重復序列，發現其含有正向重復序列（Forward repeats sequence，FR）、反 向 重 復序列（Reverse repeats sequence，RR）及回文重復序列（Palindrome repeats sequence，PR）。八角楓葉綠體的基因組共鑒定到64個長重復序列，其中正向重復序列有30個（30～35 bp有15個、36～41 bp有4個、42～47 bp有 5個、 54～59 bp有2個、60～65 bp有4個）；反向重復序列有2個（30～395 bp）；回文重復序列有32個（30～4 349 bp有31個，21 631～25 950 bp有1個）。

簡單重復序列（SSR）具有位點多態性，可開發為分子標記進行物種鑒定。通過MISA對八角楓葉綠體基因組進行分析，發現存在5種類型的120個SSRs，其中單核苷酸82個、二核苷酸27個、三核苷酸6個、四核苷酸4個、五核苷酸1個。

2.4 八角楓及其他4種八角楓屬植物種間葉綠體基因組同源比對

利用mVISTA軟件的 Shuffle-LAGAN 模式，將本研究中注釋的八角楓葉綠體基因組作為葉綠體基因組同源性分析的參考。結果（圖2）表明，5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）葉綠體基因組的基因組成和序列順序高度保守，但在petN-psbD、rps4-trnF、petA-psbJ、clpP-psbB基因區間內以及ycf1、ycf2、rrn16等基因編碼區內存在顯著差異。

2.5 八角楓及其他4種八角楓屬植物葉綠體基因組共線性分析

利用Geneious軟件對八角楓、毛八角楓、高山八角楓、八角楓MG524996和八角楓NC044840的葉綠體基因組序列進行序列重組及共線性分析。Mauve多基因組分析結果（圖3）顯示，5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）的葉綠體基因組具有2個局部共線區（LCBs），不存在大片段的重排或倒置，基因組間具有高度相似性和共線性。

2.6 系統發育分析

因為八角楓科僅有1個八角楓屬，所以本研究選取了與八角楓科親緣關系相近的藍果樹科、桃金娘科、菱角科、瑞香科、胡頹子科等26種植物的葉綠體基因組序列。以胡頹子科胡頹子屬的木半夏和沙棗為外類群，利用鄰接法構建系統發育樹。結果（圖4）顯示，各科的物種都聚成一支；在系統發育樹上，27種植物可以劃分為3條主要分支。與胡頹子科胡頹子屬植物（Elaeagnus multiflora、Elaeagnus glabra、Elaeagnus angustifolia）相區別，包括八角楓在內的八角楓科、藍果樹科等24種植物聚成獨立的一支，其支持率均為100%。在此基礎上，又將其分為3個二級分支，其中，瑞香科和其屬下的狼毒屬、瑞香屬、沉香屬等幾個屬（包括Stellera chamaejasme、Daphne genkwa、Daphne retusa、Aquilaria yunnanensis、Aquilaria sinensis）組成了一個獨立的系統，支持率均為100%。

八角楓與八角楓MG524996、高山八角楓、毛八角楓、八角楓NC044840聚為一小支，支持率均為100%，其中八角楓與高山八角楓是親緣關系最近的姐妹類群，推測它們之間存在著共同的演化關系。

3 討論

八角楓作為貴州的特色植物及常用的苗藥，在散瘀止痛、炎癥治療中具有廣闊的發展前景和應用價值。本研究對八角楓葉綠體基因組進行測序、組裝、注釋及分析，結果表明，其基因結構為雙鏈共價閉合環狀分子，葉綠體基因組的長度為156 672 bp，共編碼130個基因，包括81個蛋白質編碼基因（PCGs）、38個tRNA轉運基因、8個rRNA基因和3個假基因，其在葉綠體基因組序列中占比分別為62.31%、29.23%、6.15%和2.31%，蛋白質編碼基因的數量最多，且其GC含量為37.69%，與楊小英等［16］的研究結果相似。通過REPuter軟件對八角楓葉綠體基因組序列分析發現，共有64個長重復序列（正向重復序列、反向重復序列、回文重復序列所占的比例分別為46.9%、3.1%、50.0%），其結果與稀花八角楓和伏毛八角楓相似［15］。

SSR位點通常被用于物種鑒定，通過MISA檢測出5種類型共120個SSRs，其中單核苷酸82個、二核苷酸27個、三核苷酸6個、四核苷酸4個、五核苷酸1個。五核苷酸的類型為CAAGA；單核苷酸中以A/T居多，分別為29、50個，分析結果與植物葉綠體基因組SSR序列組成規律一致［18］。同源比對結果表明，八角楓、毛八角楓、高山八角楓、八角楓MG524996和八角楓NC044840葉綠體基因組的基因組成和序列順序高度保守，但在petN-psbD、rps4-trnF、petA-psbJ、clpP-psbB基因區間內以及ycf1、ycf2、rrn16等基因編碼區內存在顯著差異。共線性分析表明，" " "5種植物（八角楓、其他4種八角楓屬植物）的葉綠體基因組具有2個局部共線區（LCBs），不存在大片段的重排或倒置，基因組間具有高度相似性和共線性。

通過比較八角楓科及相近科27個相似植物物種（如八角楓、毛八角楓和高山八角楓）的全葉綠體基因組序列，構建系統發育樹，結果顯示八角楓和高山八角楓的親緣關系最為密切，表明這兩個物種之間存在共同的進化關系。同源比對、共線性分析和系統進化樹分析結果均表明，本試驗所研究八角楓與NCBI中已存在的八角楓屬八角楓不同亞種葉綠體基因組間存在顯著差異，推測其為八角楓屬八角楓的不同亞種。本研究結果既揭示了八角楓屬及八角楓科近緣屬各物種之間的系統進化關系，同時又為八角楓屬新物種鑒定、種質資源保護、八角楓藥用價值、功能基因分析等提供了分子依據。

參考文獻：

［1］ ZHOU Y， NIE J， XIAO L， et al. Comparative chloroplast genome analysis of rhubarb botanical origins and the development of specific identification markers［J］. Molecules， 2018， 23（11）： 2811.

［2］ 宋維才. 植物葉綠體基因組生物信息分析方法的系統性整合和應用［D］. 山東青島： 青島科技大學， 2023.

［3］ 畢毓芳， 溫 星， 潘雁紅， 等. 葉綠體DNA條形碼在林木中的應用及研究進展［J］. 分子植物育種， 2020， 18（16）： 5444-5452.

［4］ 王 飛，趙文植， 董章宏，等. 絲蘭屬6種植物葉綠體基因組特征分析［J］. 植物研究， 2023， 43（1）： 109-119.

［5］ 范李強， 胡 歡， 鄭洪蕾， 等. 響葉楊（楊屬）葉綠體基因組測序與比較分析［J］. 四川大學學報（自然科學版）， 2018， 55（1）： 165-171.

［6］ 趙志常，高愛平，黃建峰，等. 黃皮葉綠體基因組測序與分析［J］. 安徽農業科學， 2019， 47（11）： 115-118.

［7］ 楊嘉鵬， 朱紫樂， 范雅娟， 等. 三種石豆蘭屬藥用植物的葉綠體基因組比較分析及其在物種鑒定中的意義［J］. 藥學學報， 2020， 55（11）： 2736-2745.

［8］ 左瑞華， 蔣 平， 孫傳伯， 等. 基于全基因組從頭測序技術鹽膚木葉綠體基因組的測序分析［J］.生物工程學報， 2020， 36（4）： 772-781.

［9］ 張譯敏， 廖秀玲， 王雪妮， 等. 八角楓藥理和毒理作用的研究現狀［J］. 中國臨床藥理學雜志， 2019， 35（19）： 2476-2478.

［10］ 汪 雨，唐 露，邵士成，等.兩種珍稀白蝶蘭屬（蘭科）葉綠體基因組比較分析［J］.廣西植物，44（1）：43-55.

［11］ LUO R， LIU B， XIE Y， et al. SOAPdenovo2： An empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler［J］. Gigascience， 2012， 1（1）： 18.

［12］ KENT W J. BLAT—The BLAST-like alignment tool［J］. Genome Res， 2002， 12（4）： 656-664.

［13］ LIU C，SHI L，ZHU Y， et al. CpGAVAS， an integrated web server for the annotation， visualization， analysis， and GenBank submission of completely sequenced chloroplast genome sequences［J］. BMC genomics， 2012， 13： 715.

［14］ WYMAN S K， JANSEN R K， BOORE J L. Automatic annotation of organellar genomes with DOGMA［J］. Bioinformatics， 2003， 20：3252-3255.

［15］ LOHSE M，DRECHSEL O， KAHLAU S， et al. Organellar genome DRAW—A suite of tools for generating physical maps of plastid and mitochondrial genomes visualizing expression data sets［J］. Nucleic acids research， 2013， 41： 575-581.

［16］ 楊小英，劉 暢，曾憲法，等. 八角楓及其亞種葉綠體基因組序列結構及系統發育分析［J］. 藥學學報，2022，57（10）：3229-3239.

［17］ 陳彩慧， 余小玲， 符 潮，等. 毛葉樟葉綠體全基因組序列特征與系統發育［J］. 分子植物育種， 2023， 21（24）： 8066-8074.

［18］ 樓天靈，袁莉霞，張國芳，等. 鐵皮石斛葉綠體基因組特征與系統發育分析［J］. 種子， 2022， 41（8）： 35-41.