漁業生物環境DNA宏條形碼數據庫研究進展

摘要：利用宏條形碼技術可以對環境中的DNA物種信息進行識別，從而實現生物群落分類監測和生物多樣性的快速評估。該方法被廣泛應用于漁業生物研究領域，借助大量的DNA條形碼數據材料，數據庫可以將其按照一定的標準保存整理，整合多種數據庫形成共享平臺，實現數據的共享和交換。漁業生物環境DNA宏條形碼數據庫的構建可以為漁業生物的研究和開發提供基礎數據資料和科學依據。綜述了魚類、浮游植物、底棲動物的環境DNA宏條形碼數據庫研究進展，并對該方法應用于漁業生物研究領域的前景進行了展望。

關鍵詞：漁業生物；環境DNA宏條形碼；數據庫；研究進展

中圖分類號：S932.2" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）01-0174-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.028 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research progress on environmental DNA metabarcoding database of fishery biology

YANG Yan， LAN Yi， LIU Jia-min， WANG Qian

（College of Aquaculture/Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture， Tianjin Agricultural University， Tianjin" 300384， China）

Abstract： The use of metabarcoding technology could identify DNA species information in the environment， thereby achieving the classification monitoring of biological communities and rapid assessment of biodiversity. This method was widely used in the field of fisheries biology research. With the help of a large amount of DNA barcode data materials， databases could store and organize them according to certain standards， integrate multiple databases to form a shared platform， and achieve data sharing and exchange. The construction of a DNA metabarcoding database for fishery biological environment could provide basic data and scientific basis for the research and development of fishery biology. This article reviewed the research progress of environmental DNA metabarcoding databases for fish， phytoplankton， and benthic animals， and prospected the application of this method in the field of fisheries biology research.

Key words： fishery biology； environmental DNA metabarcoding； database； research progress

中國水域資源豐富，對人類的生存和發展具有重要意義。隨著經濟的快速發展以及氣候變化、生物入侵和人類活動等的影響，漁業生物的遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性都遭受嚴重破壞，實際漁業生物的滅絕風險可能比以前預估的更加嚴重。為了更科學地保護水生環境，促進漁業的可持續發展，有效推進科學研究的基礎性工作，需要快速、準確地監測生物多樣性。

面對豐富的生物圈，單靠傳統形態學的鑒定方法已經不能滿足研究需求。一是物種存在遺傳變異性、個體間雜交、形態相似種和隱存種等現象；二是耗時長、成本高、對漁業生物及其生境破壞程度大，無法進行長期高頻的監測；三是分類學專家稀缺，鑒定準確度受限于分類學專業知識［1］，傳統方法表現出越來越多的局限性。環境DNA宏條形碼技術的出現改變了這一現狀，其具有耗時少、成本低、采樣方便、靈敏度高、對樣本無損傷等優點［2］，逐漸成為評估生物多樣性較為可靠的補充手段，具有廣闊的應用前景。

隨著環境DNA宏條形碼技術的發展，產生了大量分散凌亂的物種分類信息，管理和共享這些信息成為阻礙該技術進一步發展的因素。構建數據庫是解決這一問題的有效方法，它可以作為存儲DNA條形碼和樣本信息的媒介，實現對未知漁業生物樣本的查詢和鑒定，為促進各地區數據共享提供有效平臺［3］。因此建立全面準確的環境DNA宏條形碼數據庫，對物種多樣性調查、漁業生物的監測與評價至關重要。

本研究對漁業生物環境DNA宏條形碼數據庫的進展進行整理，通過現有理論研究，探析數據庫構建的步驟、關鍵環節和研究現狀，結合數據庫在魚類、浮游植物、底棲動物等的應用進行分析，為后續漁業生物環境DNA宏條形碼數據庫的構建提供參考。

1 環境DNA宏條形碼數據庫的概況

1.1 環境DNA宏條形碼技術的發展及應用

環境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指可以直接從環境樣品中提取的DNA總和，環境DNA來源于代謝產物，如分泌物、唾液等，這些產物可以在水中保存數小時到數天，在沉積物中保存數十年到數百年［4］。“eDNA”這一專業術語于2000年初在微生物學家的研究中出現［5］。2005年為探究地表水污染首次將eDNA引入水生生態系統［6］，2020年Pawlowski等［7］對eDNA研究的范圍進行深入的闡述。環境DNA宏條形碼技術［8］是通過引物對eDNA進行PCR擴增，結合高通量測序技術對混合樣本中的物種組成進行分析的一種新型物種鑒定技術，可以對目標物種進行精準識別，幾十萬至幾百萬條DNA可以一次性完成快速高效測序［9］。2008年使用環境DNA宏條形碼技術探測到美國牛蛙 （Rana catesbeiana）的存在是其首次在水生生物中的應用［10］，隨后在淡水大型生物的eDNA 研究中證實該技術可以實現物種的快速鑒定［11］。通過Web of science檢索顯示，基于此技術在漁業生物研究的相關文獻數量基本呈上升趨勢，魚類是主要的研究對象，浮游植物和底棲動物的研究較少，如圖1所示。

目前，環境DNA宏條形碼技術已被證實是一種經濟有效的水生群落調查方法，是水質評價中很有前景的新興技術，在監測珍稀種和入侵種方面顯現出明顯優勢［11］。此外，該技術還用于漁業資源的有效估計［12］、種群分布［13］以及食性分析［14］等方面。

環境DNA宏條形碼技術廣泛應用于物種多樣性的監測。王月［15］在調查赤水河的魚類多樣性時發現，運用傳統方法監測到48種魚類，同期運用環境DNA宏條形碼技術監測到76種魚類，其中包含4種入侵種和珍稀種。李小闖等［16］運用顯微鏡鏡檢法和環境DNA宏條形碼技術對藍藻群落進行監測，研究表明，環境DNA宏條形碼技術可以監測到更多物種，更能準確揭示群落的結構和組成，能反映不同季節和不同富營養化程度水體之間的差異。Hajibabaei等［17］于2011年首次證明宏條形碼技術可應用于底棲動物的監測，結果顯示該技術對水質敏感昆蟲EPT類群的監測尤為靈敏［18］。在漁業生物資源的調查中，運用傳統方法很難進行準確評估，尤其是瀕危物種的估計，研究顯示環境DNA濃度與魚類相對豐度呈顯著正相關［12］，因此利用環境DNA宏條形碼技術可以更完整、高效地評估漁業資源。在種群分布研究領域，基于該技術得出美國芝加哥河流中鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Hypophthalmichthys nobilis）的擴散范圍超出了傳統方法所研究的區域［13］，對早期入侵物種具有識別作用。另外，基于此技術設計特異性引物來監測不同魚類腸道中的餌料成分［14］，可以分析魚類的食性。

1.2 DNA條形碼數據庫構建的步驟

以中國漁業生物DNA條形碼信息平臺（http：//www.fishery-barcode.cn）［19］與中國底棲動物條形碼數據庫（http：//10.11.16.27：8888/benthosEDNAPlatform/index/homePage）［20］的構建為例，總結數據庫構建的步驟。

構建數據庫首先要確定物種的目標基因以完成后續的物種鑒定。在底棲動物數據庫中選取COI完成數據的比對工作，在漁業生物DNA條形碼信息平臺中貝類選取COI和ITS， 藻類選取ITS和rbcL并完成數據的比對工作。獲得的條形碼數據收錄進兩個子庫，一是標準庫，該庫的數據經過驗證，物種信息準確；二是參考庫，該庫的數據來源于GenBank、BOLD數據庫，未經過驗證，對中國特有物種收錄較少，可作為參考數據。

信息平臺由表現層、訪問層和數據庫層三部分組成。表現層的功能是實現數據的開放共享，如圖2所示。訪問層有兩種方式，一是網頁訪問，為用戶提供完備的物種信息查詢和檢索功能；二是客戶端訪問，使用方便快捷，可隨時隨地查詢物種信息。數據庫層具體信息如圖 3所示，3個數據庫以物種的拉丁名為外鍵聯系在一起，形成“物種-標本-DNA條形碼”的對應關系［19］，以此實現三者的相互關聯。

構建數據庫的最終目標是實現物種鑒定。用戶可以通過輸入物種名在線檢索物種，獲得該物種的樣本信息和圖像信息［20］，也可以通過粘貼未知物種的DNA條形碼，在標準庫和參考庫中同時進行鑒定，經過BLAST比對獲得按相似度排列的分子鑒定結果。

1.3 DNA條形碼數據庫構建的關鍵環節

1.3.1 最優目標基因的選擇 對于環境DNA宏條形碼數據庫中目標基因的選擇，通用性和適用性是最需解決的問題，因為該技術的準確性和有效性在很大程度上取決于PCR擴增中引物的選擇。目前學者對同一類物種采用不同的基因開展研究，導致各自建立的數據庫不統一，數據無法共享。

目前尚未確定一種適用于魚類環境DNA宏條形碼分析的通用性較廣的引物。陳治等［21］于2022年構建海南島淡水魚類參考數據庫時發現，當對通用性的要求不是特別嚴格時，COI是最優目標基因，其次是16S rRNA、12S rRNA。劉軍等［22］對千島湖48種魚類DNA進行擴增后比較發現，16S rRNA和COI通用性較好，但16S rRNA更適合作為魚類研究的目標基因。Zhang等［23］比較了23對魚類通用引物，得出12S rRNA優于16S rRNA。Xiong等［24］的研究表明，大多數通用引物對是為某一特定類別的魚類設計的，例如軟骨魚類或長尾魚類等。

用于浮游生物環境DNA宏條形碼最優目標基因的選擇也存在不一致情況。Bombin等［25］在對墨西哥北部灣濱海藻類的多樣性研究中使用23S rRNA；郭婷等［26］發現使用18S rRNA對鄱陽湖真核浮游植物多樣性研究的效果最佳；胡愈炘等［27］在2021年對丹江口水庫浮游生物多樣性及群落特征分析中分別使用18S rRNA和16S rRNA對樣品進行擴增，結果顯示有97%的相似度。

陳凱等［28］在對水生生物eDNA數據庫構建的研究中發現，當前不同類群使用的目標基因不同且資源較分散。其中，魚類以COI和12S rRNA為代表，浮游動物以COI和18S rRNA為代表，水生植物以ITS為代表，除藍藻外的浮游植物以rbcL、COI和18S rRNA為代表，高等植物以線粒體基因、葉綠體基因和ITS為代表。

鑒于每個物種都有多種條形碼序列，不同類型條形碼的序列長度和保守性都存在差異，鑒定的準確性和解析度也不相同，對于哪種基因在特異性、辨別力和可重復性等方面表現最佳的研究仍在推進。

1.3.2 種間差異閾值 評價DNA條形碼可行性的關鍵標準是種間遺傳距離和種內遺傳距離的差異，Hebert等［29］于2003年提出種內遺傳距離不大于2%，種間平均遺傳距離大于種內平均遺傳距離的10倍以上，大量文獻中不同物種的研究結果基本符合此標準。但是當研究區域和物種不同時，相同目標基因下的種間差異閾值可能存在差異，這種不穩定性不能準確體現物種間的進化關系，這可能是影響數據庫被廣泛應用的重要因素。賀楊等［30］利用環境DNA宏條形碼技術對三峽庫區魚類多樣性進行研究，結果顯示魚類種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的19.11倍。朱書禮等［31］在對珠江中下游魚類多樣性研究時發現，魚類種間平均遺傳距離是種內平均遺傳距離的23.65倍。陳治等［21］研究了海南島淡水魚類的3種條形碼閾值及判定的準確率，表明環境DNA宏條形碼由于受擴增子長度的限制，種間差異閾值可能都比較小，同時受魚類自身遺傳特性的限制，此技術從源頭上就難以對魚類進行100%的區分。

1.3.3 DNA條形碼的鑒定 大部分條形碼信息缺少專家鑒定，上傳條形碼數據的科研工作者專業素質存在差異，造成部分信息鑒定和標記錯誤。科研人員應確保入庫條形碼序列與形態學物種鑒定結果保持一致，并注意將同一物種下的各項信息及時匯總整理，有利于物種的整合鑒定。

1.4 數據庫構建的研究現狀

構建DNA宏條形碼數據庫是規范管理DNA條形碼和實現數據共享的有效方法，可以促進分類學科的發展，也可以對漁業生物鑒定的標準化起到促進作用，研究表明數據庫的大小和質量直接決定了鑒定的可靠性和精準性［32］。2007年國際生命條形碼協會建立了國際上第一個DNA條形碼數據系統BOLD，收錄了動物、植物、真菌等26.7萬個物種，566.5萬條序列［19］。中國的GSA于2015年上線，它是國內首個被國際期刊認可的組學數據發布平臺，后期發展的NGDC于2019年獲批成立，其數據量增長快且數據的可用性、標準化均與國際接軌。2011年，中國建立了中國重要漁業生物DNA條形碼信息平臺，截至2023年8月，該數據庫包含了魚類、甲殼類、藻類等60 215個標本的45 579條序列［19］。此外，中國還建立了中國漁業生物DNA條形碼信息平臺、中國檢疫性有害生物DNA條形碼鑒定系統等。

截至2013年10月，BOLD已收錄了近17.75萬條輻鰭魚綱魚類的DNA條形碼序列信息，其中收錄最多的類群是鱸形目（Perciformes），其次是鯉形目（Cypriniformes）與鲇形目（Siluriformes）［33］。中國參與構建的魚類環境DNA宏條形碼數據庫主要有水庫漁業數據庫、漁業科學數據共享平臺、漁業科學數據庫、水產種質資源信息系統以及全球9個國際機構管理的FishBase。其中FishBase是魚類數據庫中規模最大、開發最廣、被訪問最頻繁的魚類數據庫［34］。

浮游植物在NCBI數據庫中物種覆蓋率不高，張宛宛［35］在對太湖流域常見藻類進行測序后，與NCBI進行比對分析，獲得常見藻類ITS條形碼95種，表明已獲得序列與NCBI中已有序列具有較高的同源性，但是其中藍藻門（Cyanophyta）鑒別到種的信息較少，說明仍有大部分浮游植物的種屬序列尚未錄入NCBI數據庫。

中國底棲動物條形碼數據庫的發展較慢。GenBank和BOLD等公共數據庫收錄的數據在地理分布和物種覆蓋度等方面不均衡，導致中國特有的底棲動物種類很少被收錄。因此，在2019年11月召開的中國底棲動物條形碼數據庫研討會上確定構建中國首個具有自主知識產權的底棲動物條形碼數據庫［20］，現已完成昆蟲綱（Insecta）、寡毛綱（Oligochaeta）、軟甲綱（Malacostraca）等合計400多種的條形碼測序工作，收錄1 000多條條形碼序列。中國海洋大學于2020年發布了國際首個軟體動物綜合基因組數據庫MolluscDB［36］，是迄今物種覆蓋度較廣、組學資源較豐富的軟體動物基因組學分析平臺。2022年構建的中國淡水大型底棲無脊椎動物條形碼數據庫已收錄800多個底棲動物物種、1 100多條條形碼序列，其中水生昆蟲數量最多，端足目（Amphipoda）、寡毛綱（Oligochaeta）等物種類群的數據仍有欠缺［20］。

2 環境DNA宏條形碼數據庫的應用

全面準確的數據庫有助于漁業生物在物種鑒定、遺傳變異、群落動態、資源保護等方面的發展。不夠完善的數據庫可導致50%以上的宏條形碼無法確定其具體的物種信息［32］，因此需要不斷加強數據采集力度和完善應用體系。

2.1 魚類環境DNA宏條形碼數據庫的應用

魚類DNA條形碼最常用的標記是COI，Ward等［37］用COI成功區分了澳大利亞、北大西洋大陸架地區的不同物種。柳淑芳等［38］、李鵬飛等［39］、楊凡［40］基于COI在石首魚科（Sciaenidae）、東海帶魚（Trichiurus lepturus）、中國鰈形目（Pleuronectiformes）等類群的分類鑒定中取得了較好的成效。徐春燕等［41］基于COI對福建省近海區域的仔稚魚DNA條形碼進行分析，獲得基因序列73條，鑒定物種26種，隸屬于7目22科25屬，說明COI可以實現仔稚魚物種的鑒定，較多鑒定到種的水平。曲欣宇等［3］構建的黃、渤海魚類DNA條形碼數據庫中涵蓋了300多種魚類的DNA條形碼資源，目前此平臺只支持COI的檢索，現已應用于相關水域的魚類生產中，確保物種甄別的準確性。

不是所有魚類都可以用COI鑒定，Kruck等［42］發現鱚屬（Sillago）的兩個近緣種需要使用多基因條形碼才能進行準確鑒定，易發生種間雜交現象的某些特定魚類、雜交個體及其雙親也需要利用多基因條形碼鑒定。因此，在未來使用多基因條形碼技術鑒別魚類的某些類群可能是更有效的方法。

2.2 浮游植物環境DNA宏條形碼數據庫的應用

浮游植物DNA條形碼的研究已在硅藻、綠藻、甲藻、藍藻等物種中開展，使用的基因有ITS、rbcL、COI等，這些基因各有優勢，目前尚未發現適合藻類鑒定的統一條形碼基因。

硅藻是海洋浮游植物中生物量最高的類群之一，目前認為rbcL測序效率較高，適合作為硅藻的首選條形碼基因［43］。對于使用雙基因條形碼技術鑒別硅藻，Macgillivary等［44］在對比ITS、18S rRNA和rbcL后認為將rbcL與5.8S+ITS2區域搭配使用效果最佳。

綠藻在已有的藻類基因序列數據中所占的比例較小，使用的基因包括COI、rbcL、tufA、ITS等，目前認為tufA擴增效率高、種間差異大、很少有內含子，適合作為綠藻分類鑒定的基因［45］。

在真核生物中，甲藻有龐大的核基因組，大部分基因在細胞核內，線粒體中基因較少，所以在物種鑒定時要避免某些條形碼基因多態性對測序分析、引物設計及多樣性評估帶來的干擾［33］。經過嘗試認為ITS和28S rRNA更適合作為甲藻鑒定的條形碼基因，Stern等［46］運用ITS對甲藻中的78個物種進行鑒別，可以有效區分絕大多數物種，但需要同其他條形碼基因輔助使用。Raho等［47］在鑒別鰭藻屬（Dinophysis）時發現，相較于ITS和COB，COI雖然表現出較強的種間差異性，但無法有效區分所有的物種。

在藍藻多樣性的研究中，16S rRNA被認為是最優基因，有高度保守性區域和高度變異性區域，可同時反映物種間的差異及親緣關系［48］。GenBank數據庫中藍藻16S rRNA序列呈指數趨勢增加，提升了藍藻鑒定的精確度［49］。

為了向用戶提供更加準確的藻類分類鑒定、生物多樣性評估的信息平臺，未來數據庫會錄入更多的藻類DNA條形碼信息。

2.3 底棲動物環境DNA宏條形碼數據庫的應用

海綿動物被認為是最原始的后生動物類群，初步預測已被描述的物種僅有53.3%［50］。由于海綿動物形態結構高度相似，采用傳統方法難以準確鑒別，因此它是最早建立全球性條形碼計劃的無脊椎動物類群。研究顯示，COI下游的I3-M11區［51］和ITS區［52］適合作為海綿動物的條形碼標記基因。

原生動物結構簡單，但種類繁多、數量龐大、分布較廣。Santoferrara等［53］在沙殼纖毛蟲目（Tintinnida）的物種鑒定中，比較了18S rRNA、18S rRNA高變異區V4、18S rRNA高變異區V9及28S rRNA 4個片段，結果顯示28S rRNA有效鑒別出86%的形態類型，具有明顯的優勢。此外，COI能準確區分纖毛蟲屬（Tetrahymen）的不同類群，適合作為纖毛蟲類標準條形碼基因［54］。卞小宇等［55］構建的污水環境原生動物數據庫，收錄原生動物702種，涉及32目88科284屬，對每個階元的原生動物都有主要的形態特征描述，為污水環境中原生動物的鑒定及分析做出重要貢獻。

軟體動物是動物界的第二大類群，DNA條形碼技術在腹足綱（Gastropoda）、頭足綱（Cephalopoda）、雙殼綱（Lamellibranchia）中應用較廣泛，但在單板綱（Aplacophora）、多板綱（Polyplacophora）及無板綱（Aplacophora）中的應用較少［33］。目前主要使用COI，結合16S rRNA和ITS等輔助基因鑒別軟體動物類群。Liu等［56］在研究櫛江珧（Atrina pectinate）群體的隱存種及個體間雜交時，運用ITS和COI基因分別發現了5個和6個明顯分化的支系，還在同一個體中發現多種ITS序列，對研究其雜交現狀提供了重要依據。

甲殼動物DNA條形碼的研究較完善，目前鑒定該類群較理想的基因是COI ［33］，在鑒定加拿大多種蝦類［57］以及橈足類時結果較好。對于某些甲殼動物而言，完成物種的準確鑒定需要使用多基因，例如結合COI和16S rRNA片段成功鑒定出香港海域的口足目（Stomatopoda）物種［58］。

總體來說，底棲動物的DNA條形碼研究工作已在物種鑒定、隱種甄別等方面展開［33］，但現有底棲動物類群條形碼數據仍存在存儲混亂、信息零散以及數據庫之間難以建立聯系等問題。

3 展望

雖然，環境DNA宏條形碼數據庫的構建正在從根本上改變生物評估的方式，但仍存在以下問題需要進一步完善。①數據共享存在障礙。當前用于物種鑒定的數據庫分類標準并不統一，導致數據的存儲和共享過程存在障礙。②條形碼信息存在鑒定和標記錯誤。條形碼信息缺少專家鑒定或未及時更新都會導致這種錯誤。③測序錯誤。在數據獲得階段由于樣本污染等原因導致最終得到的序列并不是目標物種序列。④序列沖突。多個物種的條形碼序列相同，導致無法對這些物種進行有效區分。條形碼針對的目標物種范圍越廣，出現這一問題的可能性就越高。⑤物種覆蓋度不高。各地區物種多樣性存在差異，對條形碼研究的投入也不相同，公共數據庫對于特有種、少見種和地理亞種收集較少。⑥構建數據庫過程費時費力。自建數據庫完全覆蓋高通量測序結果的情況尚未出現，可見構建全面準確的數據庫難度較大。⑦存在假陽性問題。采樣工具清洗不到位、實驗室受到污染、引物通用性不高或者樣本中含有PCR抑制劑均可能使試驗結果存在假陽性［2］。

未來，數據庫的構建將趨于系統、準確、完善。第一，為實現數據庫資源共享，需統一分子標記，并篩選出適用性最好的目標基因來充實數據庫；第二，不僅著眼于熱門類群數據庫的構建，對易忽視類群、形態鑒定困難類群的條形碼信息也要加大采集力度；第三，要積極構建本土自主的數據庫，鑒于水產遺傳育種、水產品安全保障、水產藥物開發等方面的社會需求日益增長，構建數據庫必須有一定的針對性和兼顧性；第四，要加強全球資源共享。未來，中國將不斷促進國內外各地區的數據共享和合作交流，在開展物種種質資源研究和生物多樣性保護工作中發揮更大作用。隨著測序技術的不斷進步，條形碼技術也將向著更加高通量、智能化的方向發展，隨著新方法和新技術的應用，環境DNA宏條形碼數據庫會在生物多樣性保護和生態學研究方面引領新的方向，促進全球生物物種條形碼信息數字化時代的到來。

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