煙草品種遵煙6號和K326的多酚氧化酶基因編輯研究

摘要：采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，分別對煙草（Nicotiana tabacum L.）品種遵煙6號和K326的多酚氧化酶（PPO）家族基因成員LOC107810501進行靶向敲除。結果表明，LOC107810501基因被敲除后，在煙草的陽性編輯單株中未檢測到該基因的表達，同時LOC107821546、LOC107786520、LOC107773093、LOC107787563、LOC107805360基因的相對表達量均明顯下降。研究獲得了低PPO活性的煙草T0突變單株，T1世代測序檢測證明突變性狀可以穩定遺傳。

關鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum L.）品種；多酚氧化酶；基因編輯；遵煙6號；K326

中圖分類號：TS272；Q134；S763.3" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2025）01-0181-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.01.029 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on polyphenol oxidase gene editing of tobacco varieties Zunyan 6 and K326

WANG Jun1， SUN Xiao-qiong2， PAN Deng-hua1，YANG An-hua1，XU De-ze2，YIN De-suo2

（1.Zunyi Branch Company，Guizhou Tobacco Company， Zunyi" 563000， Guizhou， China；2.Institute of Food Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan" 430064， Hubei， China）

Abstract： Using CRISPR/Cas9 gene editing technology， the polyphenol oxidase （PPO） family gene member LOC107810501 of tobacco（Nicotiana tabacum L.） varieties Zunyan 6 and K326 was targeted and knocked out. The results showed that after knocking out the LOC107810501 gene， no expression of this gene was detected in the positive edited plants of tobacco. At the same time， the relative expression levels of LOC107821546， LOC107786520，LOC107773093， LOC107787563， and LOC107805360 genes were significantly reduced. The study obtained T0 mutant plants of tobacco with low PPO activity， and T1 generation sequencing confirmed that the mutant trait could be stably inherited.

Key words： tobacco（Nicotiana tabacum L.）；variety； polyphenol oxidase； gene editing； Zunyan 6； K326

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是影響煙葉品質的重要因素［1］。PPO是一種含銅離子的氧化酶，在植物組織發育過程中產生并貯存在葉綠體中。在煙葉烘烤過程中，當細胞膜結構破壞時，酚類物質被釋放出來，并與葉綠體中的PPO結合，被氧化為醌類物質，醌類物質活性較強，繼續與其他醌類、氨基酸以及蛋白質結合形成色素，使煙葉褐化，顏色變深，影響外觀品質，導致煙葉等級下降，降低煙葉的經濟價值［2］。同時由于煙葉失去了作為香氣成分前體物質的多酚類化合物，導致煙葉吸食品質降低［3］。因此，煙葉中過強的PPO活性不利于優質煙葉的形成，選育PPO活性弱的品種是煙草品質改良育種的重要途徑。普通煙草（Nicotiana tabacum L.）是四倍體作物，煙草PPO基因以家族基因形式存在于煙草基因組中，家族基因間可能存在表達互補，并且這些PPO基因家族還存在翻譯和表達的可變剪切現象［4］。煙草PPO基因作用機理較復雜，增加了利用遺傳方法培養低PPO活性煙草品種的難度。基因編輯技術可以實現對DNA序列的靶向編輯，達到對目標序列的堿基替換和片段插入［5］。基因編輯技術的出現為創造煙草PPO基因突變、選育低活性PPO煙草品種提供了可能。姚恒等［6］利用CRISPR/Cas9技術敲除煙草PPO基因NtPPO1，獲得了目標基因表達顯著下降的突變體。Zhang等［7］采用引導編輯（Prime editing）工具修復了栽培煙草基因組中失活的冷杉醇合成酶基因NtCPS2，獲得了能合成冷杉醇的煙草品種。

針對煙草品種遵煙6號和K326上部煙葉耐烤性不佳，容易出現煙葉褐化的問題，本研究通過轉錄組測序分析，對不同煙草品種的PPO家族基因表達量進行分析，目的是篩選鑒定主效的PPO基因，并進行基因敲除驗證，為創造低PPO活性的煙草突變體、選育耐烤性優良的煙草品種提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型煙草品種為遵煙6號、K326，取中上部煙葉作為檢測材料；DH5α大腸桿菌與EHA105感受態細胞由上海唯地生物技術有限公司提供；pCRISPR/Cas9由馬里蘭大學戚益平博士實驗室惠贈；引物合成與測序由武漢天一華煜基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 煙草PPO家族基因的序列分析 用關鍵詞Nicotiana tabacum polyphenol oxidase在NCBI數據庫中搜索煙草PPO基因組序列和mRNA（cDNA）序列。利用PCR儀擴增基因組序列，進行克隆和測序，確認遵煙6號和K326中對應的PPO基因序列和表達序列。根據表達序列設計實時熒光PCR擴增引物，利用高保真PCR酶進行擴增，得到PPO基因的表達數據。

1.2.2 葉片總RNA提取和熒光定量PCR分析

1）RNA提取。采用Trizol［8］法提取總RNA，采用NanoDrop 2000型分光光度計（Thermo Scientific，USA）測定濃度及OD260 nm/OD280 nm，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

2）逆轉錄。利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMIX for qPCR試劑盒將待測RNA逆轉錄成cDNA。反轉錄體系：總RNA 0.5 μg；5×TransScript All-in-one SuperMix for qPCR 2 μL，gDNA Remover 0.5 μL，Nuclease-free H2O補充至10 μL。反應程序：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。逆轉錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O，儲存在-20 ℃冰箱備用。

3）熒光定量PCR。利用PerfectStartTM Green qPCR SuperMix試劑盒在LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進行反應。反應體系：2×PerfectStartTM Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L Forward primer 0.2 μL，10 μmol/L Reverse prime 0.2 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free H2O 3.6 μL。PCR反應程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個循環；72 ℃ 5 s。循環結束后利用熔解曲線檢測產物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每攝氏度采集5次熒光信號。每個樣品重復檢測3次。采用 2-??Ct 法計算基因的相對表達量。

1.2.3 載體設計 采用雙靶點策略，在目標基因的第一外顯子（Exon）區域設計第一個靶點（編碼鏈NGG上游），在第二外顯子的編碼區域設計第二個靶點（反義鏈NGG位點上游）。合成2個靶點引物后，連接至Entry clone，通過GateWay方法組裝Destination clone，熱激法轉化大腸桿菌，菌落PCR篩選陽性克隆并測序驗證。

1.2.4 遺傳轉化和陽性植株檢測 采用葉盤法進行煙草的遺傳轉化。通過培養煙草無菌苗、外植體葉盤的預培養、農桿菌介導的遺傳轉化、篩選培養、抗性組織再生等過程獲得轉化再生的植株。T0世代陽性單株自交收種后，T1世代單株種成株行并進行單株T-DNA序列檢測和靶位點測序。

陽性再生芽在抗性篩選培養基上生長，NPTII標記基因的特異引物為NPTII-F68：5′-ACTGGG CACAACAGACAATCG-3′，NPTII-R356：5′-GCATC AGCCATGATGGATACTTT-3′。

2 結果與分析

2.1 煙草PPO基因家族組成

查詢GeneBank的Nicotiana tabacum polyphenol oxidase數據，發現煙草共有15個PPO家族基因，這些基因分布在基因組的不同位置（表1），并且序列差異較大（圖1），同時發現有些PPO基因還存在轉錄和翻譯的可變剪切，例如基因LOC107789348、LOC107805360和LOC107811292（圖2），這說明栽培煙草PPO基因的表達網絡較復雜。

2.2 煙草PPO基因的表達差異

根據15個煙草PPO家族基因的RNA序列設計熒光PCR檢測引物，其中8個PPO基因能在K326和遵煙6號中檢測到擴增產物（表2）；將煙草Actin基因作為內參，分別檢測野生型遵煙6號和K326的相對表達量，發現不同PPO基因表達量存在較大差異（表3）。

2.3 靶向基因選擇和靶點設計

通過比較不同煙草品種PPO基因的表達數據，發現相同PPO基因在不同品種間存在顯著表達差異。遵煙6號PPO基因家族中LOC107811292、LOC107821546、LOC107787563、LOC107810501基因表達量較高，是PPO活性的主要決定基因。而在K326 PPO基因家族中，除LOC107786520、LOC107773093基因相對表達量高于遵煙6號外，其他基因均低于遵煙6號。以中間表達水平的LOC107810501基因作為遵煙6號PPO基因敲除的候選基因，采用雙靶點策略，篩選靶點，設計CRISPR/Cas9系統的打靶序列（表4）。

2.4 煙草T-DNA的檢測和靶點測序分析

利用T-DNA攜帶的抗性基因NPTII特異引物對T1世代的煙草植株進行轉基因成分檢測（圖3），選擇無T-DNA的單株進行靶點測序（圖4）。以遵煙6號為例，靶點測序（圖5）顯示，陽性編輯遵煙6號的2個靶位點之間發生了多個堿基的刪除、替換和插入，對靶點序列發生編輯的單株進行PPO基因檢測。

2.5 煙草T1單株的PPO基因表達檢測

提取煙草陽性編輯單株總RNA，對8個PPO基因進行熒光PCR表達檢測，由表5可知，LOC107810501基因被敲除后，煙草中未檢測到該基因的表達。在遵煙6號和K326的編輯后代中，未進行打靶編輯的PPO基因（LOC107821546、LOC107786520、LOC107773093、LOC107787563、LOC107805360）相對表達量明顯下降（圖6、圖7）。這說明煙草PPO家族基因可能存在協同表達或者表達通路的關聯。

3 小結

煙草PPO基因和茄科其他植物類似，存在家族基因協同表達現象，因此對其活性水平進行精準的控制和改良有一定難度。同時，PPO可以將多酚類物質氧化成醌類物質，改變植物組織的生化特性，有助于抵抗病菌侵染和昆蟲取食，對于植物的抗病蟲有一定的作用，因此，將PPO活性控制在合理水平是較穩妥的育種改良方案［9］。本研究在檢測、分析了野生型煙草品種遵煙6號和K326的PPO家族基因表達水平后，沒有選擇表達量最高的PPO基因進行敲除，也是考慮PPO活性水平急劇下降后可能帶來的負向效應。不同品種的PPO家族基因可能對PPO活性貢獻存在品種間差異，這表明在采用基因敲除技術進行品種改良時，需要根據具體品種的PPO家族基因表達活性特征來制定特定的基因編輯方案。

參考文獻：

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