神經嵴細胞在顱骨缺損修復中的研究進展

【摘要】 神經嵴細胞（NCCs）是脊椎動物早期發育過程中從神經管背緣發育而來的一組獨特的細胞，具有很強的增殖能力。顱骨缺損修復組織工程是神經外科重要方向，隨著NCCs的研究，為利用NCCs進行顱骨缺損修復帶來了新思路。本文概述了NCCs在顱骨缺損修復中的效果及相關成骨機制，同時探討其用于顱骨缺損修復的應用前景，旨在為NCCs在顱骨缺損修復的研究及應用提供一定的理論依據。

【關鍵詞】 神經嵴細胞；顱骨；缺損修復；成骨分化

【中圖分類號】 R651" 【文獻標志碼】 A" 【文章編號】 1672-7770（2025）01-0106-04

Research progress of neural crest cells in repairing skull defect

Abstract： Neural crest cells（NCCs） are a unique group of cells that develop from the dorsal margin of the neural tube during the early development of vertebrates and possess a strong proliferative ability. Tissue engineering for cranial defect repair is an important direction in neurosurgery. With the research on NCCs， new ideas have been brought about for the use of NCCs in cranial defect repair. This article outlines the effects of NCCs in cranial defect repair and the related osteogenic mechanisms. Meanwhile， it explores the application prospects of their use in cranial defect repair， aiming to provide certain theoretical bases for the research and application of NCCs in cranial defect repair.

Key words： neural crest cell; skull; defect repair; osteogenic differentiation

顱骨作為腦組織最直接的保護屏障，若出現缺損不及時修補會因體位、情緒和負壓等導致腦組織在顱內移動，從而造成腦穿通性畸形、癲癇發作和腦變性萎縮等傷害，因此盡早修補顱骨缺損可以減少腦組織的損害。研究表明，臨床一直沿用的治療顱骨缺損的方式包括自身顱骨回填、自體骨和異體骨移植、鈦網等材料修補。自身顱骨的回填方式需要將手術取下的顱骨置于腹部，給患者造成極大的生活障礙，自體骨的移植對于較大的缺損卻無法實施，異體骨以及鈦網的植入可能會引起免疫排斥反應導致修補的失敗。干細胞的骨再生和骨組織工程技術是顱骨修復和重建領域的一種尖端技術［1］。神經嵴細胞（neural crest cells，NCCs）是脊椎動物早期發育過程中從神經管背緣發育而來的一組獨特的細胞，作為一種去分化狀態的干細胞大量存在于臍帶血和成體動物組織當中，廣泛遷移到大多數組織和器官中，并產生多種分化的細胞類型［2］；它們為干細胞的骨再生和骨組織工程提供了一個具有治療前景的儲備庫，因此NCCs在顱骨修復領域中成為越來越熱門的研究對象。

1 NCCs的特點及表面標志

1.1 NCCs的特點 神經嵴（NC）是脊椎動物胚胎中的獨特結構，脊椎動物體內幾乎沒有一個器官或組織是NCCs不貢獻的。NCCs具有很強的增殖能力和多向分化的潛能，有助于全身多種細胞類型和組織的構成，如神經、骨骼、腎上腺和甲狀腺的內分泌細胞及結締組織等［3］。NCCs具有與巨噬細胞相似的吞噬作用，可在白細胞介素-1β介導下，吞噬細胞碎片形成PI（3）P+和Lamp1+的吞噬體［4］。NCCs還可以分泌細胞因子、趨化因子、營養活性因子等［5］。因此，由于這種多能性，它被稱為第四胚層。

1.2 NCCs的表面標志 NCCs與其他干細胞一樣，表面標志物存在多種。經過對NCCs的生物標志物廣泛的研究，排除了因傳代原因表面標志的降低以及相對高水平的血管內皮細胞標志物CD31，造血干/祖細胞標志物CD34、CD133和間充質干細胞標志物CD13、CD73，確定了幾個關鍵的標志物，分別為p75/CD271、HNK1/CD57、a4/CD49d，其中p75神經營養因子受體（p75NTR）也稱為低親和力神經生長因子和CD271，被公認為NCC的穩健標志物［6］。

2 NCCs成骨分化的影響因素

目前已經證明，有多種多樣的相互作用信號、轉錄因子和下游效應器決定NCCs的命運、遷移和分化。NCCs在一定的影響因素下，可轉換成為成骨細胞，為治療骨相關的疾病提供前提，尤其是在顱骨的缺損修復方面。誘導NCCs成骨的相關通路很多，其中轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、Wnt、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、河馬信號（Hippo-Yap）、血小板生長因子（platelet growth factor，PGDF）、刺猬信號（Hedgehog，Hh）被認為是調節NCCs成骨分化的重要信號通路。

2.1 TGFβ TGF信號傳導調節組織間相互作用，以控制器官發生和組織穩態，其在NCCs來源的骨的增殖和分化中起著至關重要的作用。TGFβ是通過TGFβⅡ型受體和TGFβⅠ型受體（又名Alk5）形成的異構體復合物誘導細胞內Smad（Smad2/3），以調節顱骨發育過程。 NCCs中Tgfbr2的缺失會導致非典型TGFβ信號被激活，而典型TGFβ信號傳導受到損害，造成顱骨畸形［7］，TGFβ激活激酶1（TGFβ activate kinase 1，Tak1）的缺失，導致Tak1缺陷突變體顯示圓形顱骨，上頜骨、下頜骨發育不良以及不同程度的腭裂發生。

2.2 FGF FGF主要通過FGF受體1 （FGF receptor 1，Fgfr1）與Fgfr2調節NCCs。抑制轉錄因子Bcl11b和同源蛋白基因1（EN1）是Fgfr2的調節因子。Bcl11b主要在顱縫間充質中表達。在NCCs中，敲除Bcl11b會使顱骨礦化增強以及成骨細胞過早分化［8］。

2.3 WNT和BMP 目前發現兩種WNT的抑制劑，Tcf7l1（Wnt靶基因的轉錄抑制因子）和Dkk1。Tcf7l1的條件失活導致前神經外胚層中Wnt/β-連環蛋白信號傳導的異常激活及NCCs的轉化，而Dkk1通過抑制Wnt/β-連環蛋白信號傳導可造成胚胎的前部區域缺乏NCCs［9］。Bmp4-Msx1通路和Osr2可通過對抑制Wnt拮抗劑的分泌，使Dkk2和Sfrp2得以表達，避免顱骨發育異常［10］。另外在體外單純使用Bmp4處理NCCs后，NCCs骨相關基因的水平增加，其能夠產生更多骨細胞［11］。

2.4 Hippo-Yap Hippo-Yap通路是一種保守的基礎通路，在調節細胞增殖、存活和分化方面起關鍵作用，對于正常的NCCs發育是必不可少的。Hippo-Yap通路可調節胚胎中BAF到NC的遷移中發揮作用。Hippo激酶Lats1/2通過抑制下游復合物的形成促進NCCs的增殖和存活［12］。FoxO6是Hippo-Yap傳導的激活劑，在小鼠發育的后期，FoxO6在顱骨組織中特異性表達，引導顱骨的擴張［13］。

2.5 PGDF PGDF包括四個配體（PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D）和兩個酪氨酸激酶受體（PDGFRα和β）。PDGFRα和β調節胚胎發生期間的顱骨發育，兩種信號傳導共同降低時，顱面部間充質的增殖顯著降低。Mo等［14］的研究發現，PDGFRα在NCCs遷移中起主要作用，而PDGFRβ主要有助于妊娠中期顱面部間充質的增殖。PDGFRα可以激活三種主要的信號傳導途徑，磷脂酶C-γ（phospholipase C-γ，PLC-γ）途徑最為重要。PDGFRα信號通過激活PLC-γ途徑刺激NCCs引起骨細胞的增殖加強，成骨細胞礦化加速［15］。

2.6 Hh信號 在過去的二十年中，已經確定了Hh信號在顱骨形成中的關鍵功能。Hh信號通路的組成包括多種配體，其中刺猬配體（聲波刺猬 ［SHh］、印度刺猬 ［IHh］ 和沙漠刺猬 ［DHh］）在顱面形態發生中發揮重要作用，Shh向NCCs發出信號，避免異常的NCCs發育和畸形的顱底［16］。Shh上調NCCs中的Osx表達，增加NCCs衍生細胞的產生，并間接上調破骨細胞活性，導致更多的骨吸收和更少的骨強度［17］。

3 NCCs在顱骨缺損修復中的作用

顱骨缺損后自身骨或剛性材料均有局限性，而應用干細胞搭載支架來修補顱骨缺損修復有廣闊前景，NCCs的高成骨、低成脂、同源兼容、細胞吞噬、組織及神經修復性的作用突出，可能成為理想選擇。

3.1 NCCs的提取及分離

3.1.1 NCCs的提取方法 NCCs從神經管中分離并遷移到顴弓，在顴弓處顯示出骨骼和軟骨獨有的特征，因此有一種方法是通過手術直接從胚胎中獲取顴弓，使用該方法進行實驗，需要經過通過動物保護機構和使用委員會批準［18］。而另一種方法是通過誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），從中提取NCCs。iPSCs可從胎兒的臍帶血中獲得，通過誘導iPSCs使其轉變為NCCs，不但不會引起醫學倫理，而且取之不盡、用之不竭［19］。

3.1.2 NCCs的分離 通過顴弓來獲取NCCs，需要用細胞解離酶（TrypLE）對其進行處理，在100×g轉速下離心5 min，去掉上清液后，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），繼續用相同的轉速和時間反復處理3～4次，最后獲得CNCs［18］。另外，通過誘導iPSCs轉變為NCCs，可直接獲得NCCs。兩種方式都需要通過迭代培養，獲取貼壁生長的NCCs。

3.2 高成骨和低脂肪化作用 目前采用的干細胞大多選用脂肪干細胞和骨髓干細胞，而現在研究的NCCs在顱骨的修復中表現出了高于其他干細胞的高成骨和低脂肪化能力。Xu等［20］的研究進一步證實，雖然脂肪干細胞和骨髓干細胞具有相似的形態和細胞表面標志物，但他們的分化潛能受到其來源組織的高度影響，并通過重要轉錄因子的DNA甲基化等表觀遺傳調控；因此，與脂肪干細胞相比，骨髓干細胞具有更強的成骨能力，脂肪分化潛力較低。Srinivasan等［21］的研究發現，無論是在二維培養中還是在PCL-Tcp支架中，NCCs在早期成骨細胞階段維持增殖時間更長，并在傳代后仍保持高增殖能力；NCCs還能分泌促進宿主成骨細胞增殖和分化的因子，這些因素導致NCCs相對于骨髓干細胞具有更好的增殖能力，并顯示出良好的成骨和成軟骨分化能力，但成脂分化較低。NCCs在顱骨缺損處形成骨化中心以及表現為低凋亡率和高成骨能力，使修補能達到更好效果［22］。

3.3 同源兼容作用 顱骨架的主要部分及其干細胞起源于NCCs，包括額葉和頂間部分以及矢狀顱縫。Glaeser等［19］采用骨髓干細胞和NCCs同時對顱骨缺損處進行修補實驗，發現隨著植入時間的增長，NCCs比骨髓干細胞的存活率高，存活時間長。置入的NCCs與缺損邊緣之間相比于骨髓干細胞，呈現出高連接密度（骨橋接連接緊密）和少量的纖維化。NCCs修補顱骨缺損后表現出較高的生物力學性，不但修補處的骨厚度增加，而且缺損處骨與周圍顱骨連接緊密，從而能抵抗更強的外力對腦組織帶來的傷害。

3.4 適用于外傷導致的顱骨缺損修復 外傷導致的顱骨缺損常常伴隨著無菌性炎癥，面部皮膚受損，腦挫傷等情況。NCCs具有吞噬作用，在損傷發生后，吞噬功能的水平顯著增加，在吞噬損傷和死亡的細胞后，形成PI（3）P和Lamp1吞噬體［4］。這種吞噬性能夠有效地減少無菌性炎癥的發生，從而大大增加缺損修復的成功率。NCCs在顱面部參與組織再生，兩棲動物肢體再生的研究［2324］也證明了這一點。NCCs與其他種類干細胞最大的不同在于，當周圍神經受到損傷時，可以遷移到損傷處，與損傷處的組織相互融合建立聯系，通過激活施萬細胞釋放多種因子修復周圍受損的神經［25］。NCC自身也會產生和分泌多種神經營養因子，來促進受損的神經突生長和周圍神經再生［5］。

4 總 結

綜上所述，在目前研究的干細胞中，NCCs顯得尤為突出。NCC參與幾乎所有脊椎動物器官和組織形成。相比于目前修復所用的干細胞，NCCs所具有的吞噬功能可以降低周圍壞死物質引起的炎癥反應。NCCs的低死亡率和高成活率，為缺損處所需的細胞數量提供保證，NCCs的自我更新能力優越，增加修復區域的成功率。此外，NCCs還能激活神經膠質細胞，分泌和釋放營養和修復因子，修復周圍受損的神經。相比于間充質干細胞，采用NCCs進行修復與顱骨缺損的邊緣結合更加緊密，抵抗外力對顱腦的損傷的作用更強。這使修復的區域與自身成為一個整體，這是其他干細胞所不能辦到的。隨著臍帶血的存貯和利用率的不斷提高，獲取NCCs變得更加便捷、高效。目前，利用NCCs進行修補雖然只停留在動物實驗階段，但缺損修復取得了重大的成果。隨著科研人員對NCCs不斷深入研究，脊椎動物實驗的不斷改進和完善，NCCs將會為未來臨床顱骨缺損修復帶來新的高效治療途徑。

［參 "考 ""文 ""獻］

［1］ Holly D，Klein M，Mazreku M，et al.Stem cells and their derivatives-implications for alveolar bone regeneration：a comprehensive review［J］.Int J Mol Sci，2021，22（21）：11746.

［2］ Ji Y，Hao HY，Reynolds K，et al.Wnt signaling in neural crest ontogenesis and oncogenesis［J］.Cells，2019，8（10）：1173.

［3］ Soto J，Ding XL，Wang AJ，et al.Neural crest-like stem cells for tissue regeneration［J］.Stem Cells Transl Med，2021，10（5）：681693.

［4］ Zhu YL，Crowley SC，Latimer AJ，et al.Migratory neural crest cells phagocytose dead cells in the developing nervous system［J］.Cell，2019，179（1）：7489.e10.

［5］ Jones I，Novikova LN，Novikov LN，et al.Regenerative effects of human embryonic stem cell-derived neural crest cells for treatment of peripheral nerve injury［J］.J Tissue Eng Regen Med，2018，12（4）：e2099e2109.

［6］ Al-Bakri Z，Ishige-Wada M，Fukuda N，et al.Isolation and characterization of neural crest-like progenitor cells in human umbilical cord blood［J］.Regen Ther，2020，15：5363.

［7］ Ho TV，Iwata J，Ho HA，et al.Integration of comprehensive 3D microCT and signaling analysis reveals differential regulatory mechanisms of craniofacial bone development［J］.Dev Biol，2015，400（2）：180190.

［8］ Daher MT，Bausero P，Agbulut O，et al.Bcl11b/Ctip2 in skin，tooth，and craniofacial system［J］.Front Cell Dev Biol，2020，8：581674.

［9］ Bley IA，Zwick A，Hans MC，et al.DKK1 inhibits canonical Wnt signaling in human papillomavirus-positive penile cancer cells［J］.Transl Oncol，2022，15（1）：101267.

［10］Huang Z，Yang RH，Li RY，et al.Mesenchymal Mycn participates in odontoblastic lineage commitment by regulating Krüppel-like Factor 4 （Klf4） in mice［J］.Stem Cell Res Ther，2022，13（1）：78.

［11］Liao JG，Huang YP，Wang Q，et al.Gene regulatory network from cranial neural crest cells to osteoblast differentiation and calvarial bone development［J］.Cell Mol Life Sci，2022，79（3）：158.

［12］Zhao XL，Le TP，Erhardt S，et al.Hippo-Yap pathway orchestrates neural crest ontogenesis［J］.Front Cell Dev Biol，2021，9：706623.

［13］Zhang L，Zhang Y，Zhou M，et al.Role and mechanism underlying FoxO6 in skeletal muscle in vitro and in vivo［J］.Int J Mol Med，2021，48（1）：143.

［14］Mo JL，Long R，Fantauzzo KA.Pdgfra and Pdgfrb genetically interact in the murine neural crest cell lineage to regulate migration and proliferation［J］.Front Physiol，2020，11：588901.

［15］Moenning A，Jger R，Egert A，et al.Sustained platelet-derived growth factor receptor alpha signaling in osteoblasts results in craniosynostosis by overactivating the phospholipase C-gamma pathway［J］.Mol Cell Biol，2009，29（3）：881891.

［16］Sun MR，Chung HM，Matsuk V，et al.Sonic hedgehog signaling in cranial neural crest cells regulates microvascular morphogenesis in facial development［J］.Front Cell Dev Biol，2020，8：590539.

［17］Yang J，Andre P，Ye L，et al.The Hedgehog signalling pathway in bone formation［J］.Int J Oral Sci，2015，7（2）：7379.

［18］Ueharu H，Yang JW，Komatsu Y，et al.Isolation and culture of cranial neural crest cells from the first branchial arch of mice［J］.Bio Protoc，2022，12（7）：e4371.

［19］Glaeser JD，Behrens P，Stefanovic T，et al.Neural crest-derived mesenchymal progenitor cells enhance cranial allograft integration［J］.Stem Cells Transl Med，2021，10（5）：797809.

［20］Xu LL，Liu YM，Sun YX，et al.Tissue source determines the differentiation potentials of mesenchymal stem cells：a comparative study of human mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue［J］.Stem Cell Res Ther，2017，8（1）：275.

［21］Srinivasan A，Teo N，Poon KJ，et al.Comparative craniofacial bone regeneration capacities of mesenchymal stem cells derived from human neural crest stem cells and bone marrow［J］.ACS Biomater Sci Eng，2021，7（1）：207221.

［22］Senarath-Yapa K，Li SL，Meyer NP，et al.Integration of multiple signaling pathways determines differences in the osteogenic potential and tissue regeneration of neural crest-derived and mesoderm-derived calvarial bones［J］.Int J Mol Sci，2013，14（3）：59785997.

［23］Zurkirchen L，Sommer L.Quo vadis：tracing the fate of neural crest cells［J］.Curr Opin Neurobiol，2017，47：1623.

［24］Parfejevs V，Antunes AT，Sommer L.Injury and stress responses of adult neural crest-derived cells［J］.Dev Biol，2018，444（Suppl 1）：S356S365.

［25］Jourdeuil K，Taneyhill LA.The gap junction protein connexin 43 controls multiple aspects of cranial neural crest cell development［J］.J Cell Sci，2020，133（4）：jcs235440.