基于16S rDNA分析腹瀉型腸易激綜合征菌群特征

[摘要]"目的"研究腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant"irritable"bowel"syndrome，IBS-D）人群與健康人群腸道菌群特征及其差異，為IBS-D的基礎(chǔ)研究提供臨床依據(jù)。方法"選取2023年1月至2024年6月溫州市人民醫(yī)院收治的IBS-D患者32例為IBS-D組，選取同一時(shí)期33名健康者為對(duì)照組。對(duì)糞便進(jìn)行菌群的16S"rDNA"檢測(cè)，對(duì)DNA進(jìn)行定量分析菌群多樣性。結(jié)果"IBS-D組患者較對(duì)照組的多樣性明顯減少，在門(mén)水平比較，IBS-D組患者較對(duì)照組變形菌門(mén)相對(duì)豐度升高；在屬水平比較，IBS-D組患者的大腸桿菌–志賀菌屬、克雷伯菌屬相對(duì)豐度升高。結(jié)論"IBS-D患者腸道菌群多樣性減少，變形菌門(mén)是IBS-D的潛在致病菌。

[關(guān)鍵詞]"腸道菌群；腹瀉型；腸易激綜合征；16S核糖體DNA基因測(cè)序

[中圖分類(lèi)號(hào)]"R574""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.05.012

Characterization"of"microbiota"in"diarrhea-predominant"irritable"bowel"syndrome"based"on"16S"rDNA"detection

SONG"Caiyun，"LAN"Qiaoli，"LIN"Xiaoxiao，"WENG"Xuejian，"ZHENG"Endian

Department"of"Gastroenterology，"Wenzhou"People’s"Hospital，"the"Wenzhou"Third"Clinical"Institute"Affiliated"to"Wenzhou"Medical"University，"Wenzhou"325000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"study"the"characteristics"of"intestinal"flora"between"diarrhea-predominant"irritable"bowel"syndrome"（IBS-D）"and"healthy"population，"and"to"provide"a"clinical"basis"for"the"basic"research"of"IBS-D."Methods"A"total"of"32"IBS-D"patients"admitted"to"Wenzhou"People’s"Hospital，"the"Wenzhou"Third"Clinical"Institute"Affiliated"to"Wenzhou"Medical"University"from"January"2023"to"June"2024"were"selected"as"IBS-D"group，"and"33"healthy"during"the"same"period"as"control"group."Cluster"diversity"was"determined"by"16S"rDNA"of"clusters"in"feces"and"quantification"of"DNA."Results"The"diversity"of"IBS-D"group"decreased"significantly"than"control"group，"and"the"relative"abundance"of"proteobacteria"increased"in"the"IBS-D"group，"and"the"relative"abundance"of"E.coli-Shigella"and"Klebsiella"increased"in"the"IBS-D"group."Conclusion"Intestinal"microbiota"diversity"in"IBS-D"patients"reduced"and"proteobacteria"is"the"potential"pathogen"of"IBS-D.

[Key"words]"Gut"microbiota;"Diarrhea-predominant;"Irritable"bowel"syndrome;"16S"ribosomal"DNA"gene"sequencing

腸易激綜合征（irritable"bowel"syndrome，IBS）是一種功能性腸病，以腹痛伴排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鳌BS發(fā)病率越來(lái)越多，最常見(jiàn)類(lèi)型是腹瀉型IBS（diarrhea-predominant"IBS，IBS-D）。IBS發(fā)病可能與下列因素相關(guān)：胃腸動(dòng)力學(xué)異常、內(nèi)臟高敏感性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)腸道刺激的感知異常和腦–腸軸調(diào)節(jié)異常、腸道感染、精神心理障礙、腸道微生態(tài)失衡等。腸道微生態(tài)指腸道內(nèi)的共生生態(tài)群落，其中細(xì)菌數(shù)量龐大，腸道菌群超過(guò)1000多個(gè)物種[1]。IBS存在不同程度腸道菌群失調(diào)，其中IBS-D最嚴(yán)重[2]。IBS-D發(fā)病與腸道菌群失調(diào)相關(guān)，但究竟是哪些菌株作用，尚無(wú)定論[3]。目前16S"rDNA"測(cè)序技術(shù)在微生物研究中應(yīng)用成熟，可從DNA層面更準(zhǔn)確反映腸道菌群特征。本研究用16S"rDNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)IBS-D及健康人群腸道糞便菌群的特點(diǎn)，找出可能的致病菌，分析其可能機(jī)制，為IBS-D研究提供參考。

1""對(duì)象與方法

1.1""研究對(duì)象

選取2023年1月至2024年6月溫州市人民醫(yī)院收治的IBS-D患者32例為IBS-D組，男23例，女9例，年齡（42.62±9.12）歲；選取同一時(shí)期33名健康者為對(duì)照組，男21例，女12例，年齡（43.30±9.53）歲。IBS-D組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～60歲，性別不限；②參照IBS-D診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]且近3個(gè)月內(nèi)每周平均至少發(fā)作1d。IBS-D患者的糞便至少25%為糊狀便或水樣便且硬便lt;25%；③胃腸鏡檢查未發(fā)現(xiàn)明顯器質(zhì)性病變。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～60歲，性別不限；②身體無(wú)重大基礎(chǔ)疾病，近1個(gè)月未服用益生菌、抗生素等藥物；③胃腸鏡檢查未見(jiàn)明顯器質(zhì)性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月服用抗生素、益生菌、激素等影響菌群藥物者；②既往有胃腸、心腦、肺、肝、腎等重大基礎(chǔ)疾病者；③既往有腹部手術(shù)史。兩組患者的一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，具有可比性。受試者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)溫州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：倫審KY-"202411-018號(hào)）。

1.2""檢測(cè)方法

收集受試者糞便進(jìn)行菌群16S"rDNA檢測(cè)。收集糞便流程：囑受試者收集未污染的新鮮糞便后立即放入收集管中（至少約1g），將標(biāo)本立即保存于–80℃冰箱，最后送檢糞便菌群測(cè)序。對(duì)菌群DNA進(jìn)行定量。細(xì)菌16S"rDNA"V3-V4區(qū)DNA序列的高通量測(cè)序。獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接和過(guò)濾，進(jìn)行alpha多樣性分析和beta多樣性分析。采用"SILVA和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋?zhuān)?duì)各層級(jí)物種在各樣本中的豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間差異比較采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，采用R軟件進(jìn)行alpha多樣性分析，采用PCoA分析、NMSD分析使用Bray-curtis距離算法檢驗(yàn)兩組間菌群結(jié)構(gòu)的相似性。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""兩組菌群多樣性比較

IBS-D組患者的Shannon指數(shù)為4.769±1.311，健康對(duì)照組為5.099±0.870，IBS-D組患者的Simpson指數(shù)為0.849±0.135，健康對(duì)照組為0.904±0.068；IBS-D組患者的Chao1指數(shù)為342.864±153.426，健康對(duì)照組為373.827±161.024。IBS-D組患者的菌群多樣性各項(xiàng)指數(shù)低于健康組（Plt;0.05）。

2.2""兩組菌群微生物組成、差異分析

在門(mén)水平，IBS-D組相對(duì)豐度排名前5的依次為厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為44.007%、34.630%、9.527%、9.432%、1.350%。健康組相對(duì)豐度排名前5的依次為厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為66.083%、17.774%、7.584%、4.094%、2.753%。IBS-D組患者的變形菌門(mén)相對(duì)豐度較健康組升高，厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)降低。在屬水平，IBS-D組相對(duì)豐度排名前5的菌群為大腸桿菌–志賀菌屬、克雷伯菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬，相對(duì)豐度分別為24.190%、7.388%、5.790%、4.847%、3.710%。健康組相對(duì)豐度排名前5的菌群為雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、活潑瘤胃球菌屬、大腸桿菌–志賀菌屬、科林斯菌，相對(duì)豐度分別為8.358%、8.263%、6.982%、4.610%、4.515%。上述菌屬在兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌屬為大腸桿菌–志賀菌屬、克雷伯菌屬、鏈球菌屬，其中IBS-D組豐度大腸桿菌–志賀菌屬、克雷伯菌屬相對(duì)較健康組有所升高，鏈球菌屬相對(duì)豐度有所降低。兩組間顯著性差異分析，屬水平中有意義的菌屬有40余種。布勞特菌屬、丹毒梭菌屬豐度在IBS-D組較健康組降低，見(jiàn)圖1。

2.3""差異菌群分析

運(yùn)用LEfSe分析（設(shè)置LDAgt;4，Plt;0.05）IBS-D組患者共有6種差異菌群，均歸為變形菌門(mén)。健康組共有13種差異菌群，其中10種歸于厚壁菌門(mén)，3種歸于放線菌門(mén)。從屬水平來(lái)看，IBS-D組包括大腸桿菌–志賀菌屬、克雷伯菌屬；健康組包括鏈球菌屬、布勞特菌屬、丹毒梭菌屬。預(yù)測(cè)模型分析，IBS-D組的潛在致病菌相對(duì)豐度較健康組上升，變形菌門(mén)是IBS-D的潛在致病菌。

3""討論

中國(guó)IBS以IBS-D為主，男性患者多見(jiàn)[4]。人體腸道菌群短時(shí)間趨于穩(wěn)定，長(zhǎng)期不斷變化，腸道菌群可參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)，抵御病原體感染[7]。當(dāng)腸道受到各種因素影響時(shí)，細(xì)菌功能和組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，被稱(chēng)為腸道菌群失調(diào)[5-6]。腸道菌群失調(diào)可能與以下因素相關(guān)：①腸道原發(fā)疾病：如腸道感染、小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)綜合征等。②全身性疾病；③其他：如抗生素相關(guān)性腹瀉、放化療治療等。腸道菌群失調(diào)與多種疾病相關(guān)，如消化道疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、代謝性和精神性疾病等，與IBS-D的發(fā)病有關(guān)[8]。腸道菌群失調(diào)可促進(jìn)炎癥性疾病的易感，菌群多樣性降低[9]。

本研究IBS-D患者菌群多樣性降低。腸道黏膜能量的主要來(lái)源是丁酸。丁酸有抗炎及維持腸黏膜功能穩(wěn)定的作用，厚壁菌門(mén)的一些菌屬可產(chǎn)生丁酸[10]。厚壁菌門(mén)是腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，參與能量物質(zhì)代謝，抑制腸道炎癥反應(yīng)[11]。放線菌門(mén)是革蘭陽(yáng)性菌，對(duì)維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，為腸道共生菌，具有代表性的是雙歧桿菌，被廣泛作為益生菌治療疾病。本研究中IBS-D患者的厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度較健康者降低，維持腸道功能穩(wěn)定的菌群減少。變形菌門(mén)可致炎癥因子產(chǎn)生、釋放，激活炎癥反應(yīng)，誘發(fā)多種疾病[11]。本研究表明變形菌門(mén)是IBS-D的潛在致病菌。IBS-D患者擬桿菌屬豐度上調(diào)，雙歧桿菌屬豐度減少。大腸桿菌和擬桿菌可控制機(jī)體新陳代謝、調(diào)節(jié)維生素水平。雙歧桿菌有抗感染和增加腸道黏膜屏障、免疫調(diào)節(jié)功能。炎癥反應(yīng)可活化免疫系統(tǒng)，進(jìn)一步加重腸道炎癥反應(yīng)[12-15]。研究表明腸道致病菌增加和益生菌減少可導(dǎo)致腸道黏膜通透性改變，發(fā)生慢性炎癥性疾病[15-16]。

本研究表明IBS-D患者的鏈球菌屬豐度有所降低，克雷伯菌屬相對(duì)豐度升高。克雷伯氏菌屬作為條件致病菌，當(dāng)腸道內(nèi)環(huán)境平衡被打破時(shí)，可成為致病菌。本文推測(cè)克雷伯氏菌屬會(huì)改變IBS-D腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致IBS-D出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，需要進(jìn)一步增加樣本量去研究。綜上，IBS-D患者腸道菌群多樣性減少，存在腸道菌群失調(diào)，變形菌門(mén)是IBS-D患者的潛在致病菌。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–09–15）

（修回日期：2024–12–25）