全氟辛酸和五價砷聯合暴露對普通小球藻生理生化的影響

摘要：水環境中砷（As）和全氟辛酸（PFOA）的毒性及其高檢出率和逐年增高的濃度已引起人們的高度重視。探究全氟辛酸和砷聯合暴露對水生生物的毒性作用，為全氟化合物和重金屬在水生生態系統的聯合風險評估提供理論基礎。以普通小球藻為受試生物，研究不同濃度PFOA+As5+（0、0.1、0.5、1、1.2和1.5 TU）對普通小球藻的生長、葉綠素（Chl）含量、初級代謝產物、抗氧化酶活性和形態結構的影響。結果表明，在96 h脅迫時，各處理組對普通小球藻的生長均有抑制作用，其中1.5 TU處理組抑制率最高，為63.6%，96 h-IC50為1.104 TU（PFOA和As5+濃度分別為154.28和1.06 mg/L），聯合作用模式為部分相加作用，生態風險增加；藻細胞T-Chl、Chl-a、Chl-a/b、總蛋白（TP）、胞內多糖含量均隨暴露濃度的增加呈顯著下降趨勢，Chl-b無明顯變化。而胞外多糖和中性脂質呈顯著上升；細胞膜通透性、活性氧自由基（ROS）和丙二醛（MDA）含量顯著上升，線粒體膜電位（MMP）顯著下降；聯合脅迫下，藻細胞總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和三磷酸腺苷酶（ATPase）活性顯著下降，而總巰基（-SH）和還原型谷胱甘肽（GSH）活性顯著上升；TEM和SEM結果表明，聯合脅迫會破壞藻細胞的內部結構和外部形態；藻細胞對PFOA和As5+的吸收降解并不顯著，但在實際環境濃度長期暴露下，藻細胞對其吸收降解和生物富集還有待進一步研究。

關鍵詞：砷；全氟辛酸；普通小球藻；聯合毒性；抗氧化酶；超微結構

中圖分類號：S932.4" " " " 文獻標志碼：A" " " " 文章編號：1674-3075（2025）02-0223-12

全氟化合物（perfluoroalkyl substances，PFASs）是一類與碳原子相連的氫原子被氟原子完全取代或部分取代的脂肪烴類化合物，具有高電負性、強碳氟鍵和化學穩定性等特殊性質，被廣泛應用于制造醫療設備、半導體涂層和滅火泡沫等（Zhang et al，2021）。全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）作為使用最為廣泛的PFASs之一，為PFASs污染中主要部分，且具有極強的環境持久性和生物放大性（Li et al，2020a）。PFOA在2009年被列為《斯德哥爾摩公約》的持久性有機污染物，在2020年被中國列入《優先控制化學品名錄》（中華人民共和國生態環境部，2020）。目前，PFOA在包括水環境中的不同環境介質均被檢測出（Liu et al，2018），表現出明顯的遠距離遷移和全球性。美國法倫海軍航空站附近的水域中檢測到高達6.57 mg/L的PFOA（Schultz，2004）。我國錢塘江（杭州段）和千島湖（新安江水庫）PFOA濃度范圍分別為0.59～538 ng/L和0.52～3.61 ng/L（張明等，2015；2020）。長江上游重慶段和下游黃浦江表層水中PFOA濃度分別為61.93和139.6 ng/L（Sun et al，2017；杜國勇等，2019），甚至海洋和偏遠地區也有監測數據（Li et al，2018）。

水生態系統中重金屬污染是一個全球性的威脅（Zhou et al，2020）。砷（Arsenic，As）在水環境中主要以As5+和As3+形式存在，其中As5+的穩定性和環境含量均高于As3+，具有難降解和致畸致癌等特性（Byeon et al，2021），主要來源為電鍍、采礦和精煉等過程排放的工業廢水。工業化地區的河流和排放廢水中As濃度可高達5 mg/L（Wang et al，2013），緊鄰砷礦的水庫中As含量高達1.001 mg/L（張蒙等，2022），準噶爾盆地監測到地下水As濃度高達887.0 μg/L（雷米等，2024）。隨著河流流淌，污染物最終匯入海洋，特別是河口和沿海水域。例如，長江口表層水和沉積物中As平均濃度為1.948 μg/L和14.815 mg/kg，As有明顯的富集趨勢（張建坤等，2020）。水環境中As和PFOA的高檢出率和遞增的濃度水平已引起人們的重視。

浮游植物（微藻）是水生態系統的初級生產者，也是食物鏈中富集環境污染物的起點，具有體積小，世代時間短和對環境敏感等特點，被廣泛應用于水環境安全評價和環境毒性檢測（Lin et al，2020）。研究表明，As和PFOA對水生生物的發育、代謝、免疫、神經和生殖等均表現出較明顯的毒性效應（馮政等，2010；Xu et al，2013；Wang et al，2021a），但是大多側重于單因素毒性研究。然而，在自然條件下，水生生物可能同時暴露在多種污染物下，如重金屬和持久性有機污染物（孟娣等，2018）。最近的研究也越來越關注不同污染物對水生生物的聯合作用，如微塑料和鉛對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）（Wang et al，2021b）、抗生素馬度米星銨和銅對鯽（Carassius auratus）（高修歌等，2021）、銀和二氧化鈦納米顆粒對大型蚤（Daphnia magna）（Galhano et al，2020）。目前關于PFASs和重金屬對水生生物的聯合毒性影響信息較少，尤其是對藻類影響的研究。因此，本試驗以普通小球藻（Chlorella vulgaris）為受試生物，研究PFOA和As5+聯合暴露對其生長、光合作用、初級代謝產物、生理生化功能和形態結構的影響，闡明二者對普通小球藻的交互影響，進一步探討PFASs和重金屬對水生生物的聯合毒性機理，揭示水環境中PFASs和重金屬相關的暴露風險，進而有助于實現水域生態系統的可持續發展和利用。

1" "材料與方法

1.1" "試驗材料

普通小球藻（Chlorella vulgaris，FACHB-8）購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫（FACHB-Collection）。全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）購自上海麥克林生化科技有限公司，純度gt;96%。As5+標準品（1 000 mg/L）購自北京墨壇質檢科技股份有限公司。

1.2" "藻種培養

在溫度25 ℃，光照12 h/暗12 h，光照2 000～8 000 lx的人工光照培養箱（GZX-250BSH-Ⅲ，中國上海新廟醫療器械制造公司）進行培養，直到藻細胞達到對數生長期后再進一步培養，培養基為BG11。藻類在靜態培養箱中生長，培養物每天固定時間人工搖動3～4次，以防止藻細胞附著在培養容器上。在顯微鏡下檢查其正常形態，以對數生長期的藻類為試驗對象。

1.3" "試驗濃度設置

試驗方法參照淡水生物水質基準推導技術指南（HJ 831—2022），微藻是靜態暴露方式。單一急性試驗結果表明PFOA和As5+對普通小球藻的96 h-IC50分別為279.5和1.93 mg/L（李立杰等，2022），以0.5×IC50（PFOA）+0.5×IC50（As5+）=1 TU（毒性單位），聯合暴露試驗濃度（表1）設置為0（CK）、0.1、0.5、1、1.2和1.5 TU，每個處理組3個平行，接種初始藻密度1×106個/mL，培養藻液體積為100 mL，急性試驗暴露周期為96 h。急性毒性試驗重點在于觀察藻細胞對污染物出現的毒性反應，并為后續慢性毒性試驗提供設計基礎，所以本試驗設置濃度與環境濃度相比較高。試驗結束時測定生理生化指標。其他試驗條件同1.2。

1.4" "聯合毒性評價

本試驗分別用毒性單位法（TU）、相加指數法（AI）和混合毒性指數法（MTI）對聯合毒性進行評價。具體公式如下（Wang et al，2019）：

UT，i=Ci /CI，50i ①

UT=[Σ]UT，i ②

UT，0=UT/max（UT，i） ③

式中：UT為混合污染物中各組分毒性單位之和；UT，i為混合污染物中i組分的毒性單位，UT，0為混合污染物中各組分毒性單位之和與max（UT，i）混合污染物中i組分毒性單位最大值的比值；Ci為混合污染物i的半致死濃度，CI，50i為污染物i單獨作用時的半致死濃度，單位均為mg/L。（1）毒性單位法（TU）：若UTgt;UT，0，呈拮抗作用；若UTlt;1，呈協同作用；若UT=UT，0，為獨立作用；若UT，0gt;UTgt;1，呈部分相加作用。（2）相加指數法（AI）：當UT≤1.0時，IA=（1/UT）－1；當UT≥1.0時，IA =1－UT，若IAgt;0，呈大于相加作用，若IAlt;0，呈小于相加作用，若IA=0，呈等于相加作用。（3）混合毒性指數法（MTI）：IMT=1－lgUT/lg（UT，0），若IMTlt;0，呈拮抗作用，若IMT=0，獨立作用；若0lt;IMTlt;1，部分相加作用；若IMT=1，濃度相加作用；若IMTgt;1，協同作用。

1.5" "藻密度的測定

通過血球計數板進行藻細胞計數，并在波長680 nm下測定藻液吸光度，建立不同藻細胞濃度和光密度之間的線性關系，如下：

Y=137.88X-5.3629（R2=0.9999） ④

每24 h在680 nm處檢測藻液吸光度值。通過藻密度繪制生長曲線并計算抑制率I（%）（Liu et al，2022）。

[Ι=ACK?AXΑCK×100]% ⑤

式中：ACK指對照組的藻密度，AX指試驗組的藻密度，單位均為個/mL。

1.6" "生理生化指標的測定

1.6.1" "光合色素" "各濃度組取5 mL藻液，使用熱乙醇法提取，在649 nm和665 nm測定吸光度值，并依據公式進行計算（Li et al，2020a）：

C（Chl-a）=13.95×A665-6.88×A649 ⑥

C（Chl-b）=24.96×A649-7.32×A665 ⑦

C（T-Chl）=18.08×A649+6.63×A665 ⑧

式中：C（Chl-a）、C（Chl-b）和C（T-Chl）分別為Chl-a、Chl-b和總葉綠素的濃度，單位均為mg/L；A665、A649分別為藻液在665 nm和649 nm的吸光度。

1.6.2" "初級代謝產物" "多糖含量用蒽酮-硫酸方法定量。總蛋白含量（TP，A045-4-2）用南京建成生物工程研究所相應的試劑盒進行測定。微藻的脂質含量是用尼羅紅（0.1 mg/mL，DMSO）熒光法檢測，結果顯示為每106個細胞的熒光強度（Luo et al，2021）。

1.6.3" "氧化損傷指標" "ROS試劑盒（A001-2，南京建成生物工程研究所）中描述的二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針測定ROS的產生。羅丹明123（Rh123）熒光染料檢測線粒體膜電位（MMP），細胞膜通透性水平用二乙酸熒光素（fluorescein diacetate）染色法測定（Liu et al，2018），結果顯示為每106個細胞的熒光強度。

1.6.4" "抗氧酶活性" "取50 mL藻液，藻泥真空低溫干燥，使用組織細胞破碎儀破碎，破碎后加入1 mL PBS混勻，低溫離心上清液為粗酶液。總抗氧化能力（T-AOC，A015-2-1）、總超氧化物歧化酶（T-SOD，A001-3-2）、三磷酸腺苷酶（ATPase，A070-1-2）、還原型谷胱甘肽（GSH，A006-2-1）、總巰基（-SH，A063-4-1）和丙二醛（MDA，A003-2-2）含量用南京建成生物工程研究所相應的試劑盒進行測定。

1.7" "細胞形態和超微結構分析

96 h時，各處理組收集5 mL藻細胞，在掃描電鏡和透射電鏡觀察、拍照和分析。藻細胞固定后清洗，在真空低溫干燥機中脫水6 h，再噴金45 s，使用掃描電鏡（SEM，TESCAN VEGA 3）觀察拍照。藻細胞固定清洗，依次乙醇梯度脫水，最后滲透、包埋、切片和染色，使用透射電子顯微鏡（TEM，日立，HT7800）下進行微觀結構分析（Liu et al，2022）。

1.8" "暴露液濃度的測定

試驗開始和結束時，分別測定PFOA和As的濃度。As濃度使用電感耦合等離子質譜儀（PeKinElmer，NexION 1000/2000 Series）測定。PFOA濃度使用高分辨飛行時間液質聯用儀（AB，TripleTOF 5600+）測定，試驗方法參考《水質 17種全氟化合物的測定 高效液相色譜串聯質譜法》（DB 32/T 4004—2021）。

1.9" "綜合生物標志物響應指數（IBR）

計算每種生物標志物在各站位的平均值（Xi）以及所有站點該種生物標志物的總平均值（m）和標準差（s），然后將該標志物Xi值進行標準化處理：

Yi=（Xi-m）/s" " " " " " " " " " " ⑨

式中：Yi為標準化處理后的值。如果標志物與污染物呈正相關，則令Z=Yi，反之則Z=-Yi。各站位每種標志物的得分為：

Ai=Z+[min]" " " " " " " " " " " " ⑩

式中：[min]是Z中最小值的絕對值。將每種生物標志物的Ai以星狀圖中輻射線的長度表示，那么該站位的綜合生物標志物相應指數IBR值則通過計算星狀圖上圖形的面積（相鄰生物標志物的輻射線所圍出的三角形的面積之和）獲得，計算方法如下：

[IBR=1nBi ]" " " " " " " " " " ?

[Bi=SiSisinα2]" " " " " " " " " " ?

[α=2πn]" " " " " " " " " " " " " ?

式中：Bi為第i條和第（i+1）條輻射線所圍成的三角形面積；Si和Si+1為星狀圖中順時針方向連續2個得分；α為相鄰兩條輻射線之間的夾角；n為生物標志物的種數（Chen et al，2022）。

1.10" "數據分析

數據用平均值±標準差（mean±SD）表示。采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2" "結果與分析

2.1" "普通小球藻藻密度

藻密度隨暴露時間的延長和濃度的增加均顯著下降，在96 h時，0.1、0.5、1、1.2和1.5 TU處理組抑制率分別為3.5%、5.0%、49.8%、56.3%和63.6%。通過非線性曲線—最小二乘法對普通小球藻96 h時生長抑制率進行擬合，得到擬合效應曲線（圖1），PFOA和As5+聯合脅迫對普通小球藻的96 h-IC50為1.104 TU，PFOA和As5+濃度分別為154.28和1.06 mg/L。并采用毒性單位法（TU）、添加指數法（AI）和混合毒性指數法（MTI）評價PFOA和As5+聯合暴露的作用模式，均顯示出部分相加毒性效應（表2）。

2.2" "普通小球藻葉綠素（Chl）含量

由圖2可知，PFOA和As5+聯合脅迫導致葉綠素含量顯著下降。與對照組相比，1.2和1.5 TU處理組T-Chl含量顯著下降，分別降低31.5%和42.3%。1、1.2和1.5 TU處理組Chl-a含量分別降低25.6%、44.1%和63.8%，Chl-a/b呈相同趨勢，而各處理組Chl-b含量無顯著性差異。

2.3" "普通小球藻初級代謝產物

總蛋白和胞內多糖含量隨聯合脅迫濃度的增加而逐漸下降（圖3a，3b）。1、1.2和1.5 TU處理組與對照組相比總蛋白含量顯著降低，分別下降32.0%、17.7%和50.9%，同時胞內多糖也分別下降19.2%、26.0%和21.8%。而胞外多糖含量呈顯著上升，1、1.2和1.5 TU處理組與對照組相比分別增加到1.6、1.6和1.8倍。中性脂質含量隨暴露濃度的增加呈上升趨勢（圖3c），1.2和1.5 TU處理組中性脂質含量顯著高于對照組，而各處理組極性脂質與對照組相比均不顯著。

2.4" "普通小球藻的氧化損傷

ROS和MDA含量隨暴露濃度的增加而逐漸增加，1、1.2和1.5 TU處理組ROS含量為對照組的3.6、2.7和8.2倍，1.5 TU處理組MDA含量為對照組的1.7倍（圖4a）。細胞膜通透性熒光強度隨暴露濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，0.1～1.2 TU處理組與對照組相比沒有顯著性差異，而1.5 TU處理組與對照組相比顯著降低（圖4b）。藻細胞MMP水平隨暴露濃度的增加呈顯著下降的趨勢，0.1～1.5 TU處理組與對照組相比分別降低16.8%～43.3%（圖4b）。

2.5" "普通小球藻抗氧化系統

隨著暴露濃度的增加，藻細胞T-AOC、T-SOD、CAT和ATPase含量與對照組相比均呈現出顯著抑制作用（圖5），1、1.2和1.5 TU處理組T-AOC含量分別下降36.7%、13.4%和82.5%，CAT含量呈相同趨勢，分別下降30.8%、50.4%和67.0%。0.1～1.5 TU處理組T-SOD和ATP含量分別下降5.6%～56.5%和27.0%～51.7%。而藻細胞-SH和GSH含量隨暴露濃度的增加而顯著增加，1.5 TU處理組-SH和GSH含量分別是對照組的2.1倍。

2.6" "綜合生物標記物響應指數（IBR）

對各處理組普通小球藻的抗氧化能力（T-SOD、CAT、GSH、T-AOC、ATP、-SH和MDA）、T-Chl含量和總蛋白含量進行標準化處理，隨暴露濃度的增加，IBR指數逐漸升高，1.5 TU處理組的IBR最高為18.2（圖6）。表明隨脅迫濃度的增加，普通小球藻所受的影響越大，生態風險增加。

2.7" "生理生化指標之間的相關系數

如表3所示，ROS分別與MDA和GSH呈顯著正相關，分別與T-Chl、TP、T-AOC、T-SOD、ATP和CAT呈顯著負相關。T-Chl、TP、T-AOC、T-SOD、ATP和CAT相互呈顯著正相關。

2.8" "普通小球藻對PFOA和As的吸收和降解

由表4所示，96 h暴露后，暴露濃度與初始濃度無顯著性差異，藻細胞對PFOA和As的濃度均沒有顯著性影響。

2.9" "PFOA和As5+聯合脅迫對藻細胞的結構損傷

掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）對藻類細胞的表面形態和內部結構進行觀察，如圖7所示。對照組細胞外部形態和內部結構完整（圖7a，7c），觀察到明顯的蛋白質核被緊密的橢圓形淀粉鞘包圍，從蛋白質核到葉綠體類囊體清晰可見。葉綠體和類囊體片層清晰、連續、折疊整齊，幾乎平行排列。而1.5 TU處理組藻細胞外部形態部分溶解破裂變形，細胞間隔模糊。內部結構蛋白核和淀粉鞘消失，葉綠體和類囊體片層結構減少，排列疏松。淀粉粒和脂滴增多（圖7b，7d）。

3" "討論

3.1" "聯合脅迫對藻細胞生長的影響

在本研究中，不同濃度PFOA和As5+聯合脅迫下，普通小球藻的生長均表現出抑制作用，聯合脅迫對普通小球藻的96 h-IC50為1.104 TU，PFOA和As5+濃度分別為154.28和1.06 mg/L，作用模式為部分相加作用。IBR顯示二者聯合的生態風險增加。Li等（2021）研究表明，與單一脅迫相比，有色金屬浮選試劑丁基黃原鹽酸和鎳復合污染對蛋白核小球藻生長抑制更為顯著。Lu等（2015）研究表明銅和金霉素聯合暴露對蛋白核小球藻有部分相加作用。本試驗結果與前人結果一致，二元混合物毒性增強。根據毒性機理，As5+在結構上與磷酸鹽類似，可取代生化反應中的磷酸，使氧化磷酸化過程解偶聯，干擾細胞的能量代謝，抑制參與細胞代謝的主要巰基酶的活性（Byeon et al，2021）。PFOA會與細胞表面的疏水位點結合，對細胞膜功能造成損傷，從而刺激細胞內ROS的產生，引起其他生物大分子的脂質過氧化損傷（Xu et al，2022）。盡管這2種污染物的作用靶點不同，但PFOA可能通過有機配體與砷離子發生絡合或螯合作用，從而形成毒性更強的化合物。

葉綠素（Chl）是藻細胞進行光合作用的物質基礎，其中Chl-a和Chl-b作為Chl合成的主要產物，其含量可以衡量藻細胞的生長狀況和受脅迫程度。Chl-a/b值越高，越有利于CO2轉化為光合產物（Liu et al，2018）。在本研究中，隨著聯合脅迫濃度的增加，Chl-a/b、T-Chl和Chl-a含量顯著下降。這可能是聯合脅迫最先抑制葉綠素a的合成，捕光能力減弱，導致藻細胞體內T-Chl的含量不斷減少，光合作用機能遭到嚴重破壞（Wu et al，2019），減弱的光合作用可能會影響藻細胞的能量儲備（Luo et al，2021）。在本研究中，藻細胞的胞內多糖和總蛋白含量顯著下降，最高下降21.8%和50.9%，而胞外多糖和中性脂質顯著上升。相關分析表明T-Chl與總蛋白呈顯著正相關。表明光合作用的減弱導致碳水化合物和蛋白質代謝合成途徑受到抑制，反而增加細胞脂質的合成途徑，這與王珊等（2014）研究結果相一致。而藻細胞胞外多糖顯著增加，可能是聯合脅迫導致藻細胞的結構受損，胞內多糖分泌到細胞外，促進細胞形成防御性的群體，提高其在脅迫環境下的抗性（Liu et al，2022）。

糖、脂質和蛋白質3大營養物質最終通過線粒體內膜上的電子傳遞鏈轉運電子生成ATP。因此，正常的線粒體膜電位（MMP）是維持線粒體進行氧化磷酸化和產生ATP的先決條件，膜電位的穩定有利于維持細胞的正常生理功能（Liu et al，2018）。在本研究中，聯合脅迫下，各處理組MMP水平均顯著下降，與ATP含量呈一致性。表明在聯合脅迫下，藻細胞受到凋亡誘導后MMP的變化導致線粒體供能機制障礙，呼吸鏈與氧化鏈酸化且失去偶聯，下調ATP產生水平，最后使線粒體外膜破碎，導致細胞凋亡（魏國芹等，2020）。相關分析表明，ROS水平分別與ATP、T-Chl和TP含量呈顯著負相關。由此可見，藻細胞的生長受到抑制與氧化應激密切相關。

3.2" "聯合脅迫對藻細胞抗氧化體系的影響

ROS水平超過防御機制范圍，細胞處于氧化脅迫狀態，引起脂質過氧化、酶失活和細胞結構損傷等。在藻類中，ROS主要是在葉綠體和質膜的電子傳遞活動中產生（Wang et al，2021c）。在本研究中，1、1.2和1.5 TU處理組ROS含量顯著增加。表明聯合脅迫造成的光合作用損傷，從而引起電子積累，并與分子氧反應生成ROS。之前的研究表明As5+和PFOA單一脅迫下藻細胞ROS含量顯著增加。表明藻細胞內ROS的產生可能是PFOA、As5+和PFOA+As5+的毒性機制之一。

作為對ROS水平升高的響應，藻細胞體內T-AOC、T-SOD、CAT、GSH和-SH（活性巰基）等活性酶相互協同，形成抗氧化防御體系，以此減少或攔截ROS的產生（Wang et al，2019）。在As5+脅迫下，普通小球藻的T-SOD和T-AOC均顯著增加（李立杰等，2022）；而在PFOA脅迫下，呈先上升后下降的趨勢（Xu et al，2013）。在本研究中，PFOA和As5+聯合脅迫導致藻細胞T-AOC、T-SOD和CAT含量顯著降低。ROS水平分別與T-AOC、T-SOD和CAT呈顯著負相關。表明PFOA和As5+聯合暴露與單一暴露相比毒性增強，藻細胞產生過量的ROS損害機體，抑制抗氧化酶的活性。而GSH和-SH活性顯著增強，ROS水平與GSH呈顯著正相關。推測藻細胞GSH活性升高是為了消除多余的ROS并維持其平衡。而-SH含量的增加，可以促進GSH的活性，從而提供更多的底物，并能穩定含巰基的酶和防止其他輔因子受氧化損傷，以緩解污染物脅迫。這在其他研究中也報道了類似的結果（Liu et al，2021）。

盡管GSH和-SH對污染物脅迫產生響應，但仍然不足以完全清除過量的ROS，從而導致脂質過氧化的產生。MDA是脂質過氧化的最終產物之一，用來衡量細胞的氧化損傷程度（Wang et al，2017）。在本研究中，MDA含量隨暴露濃度的增加而顯著增加，其中1.5 TU處理組最為顯著，是對照組的1.7倍。MDA含量與ROS水平呈顯著正相關。綜上結果表明，PFOA和As5+混合物通過引起藻細胞氧化應激和膜脂質過氧作用來影響其生長。細胞膜熒光強度越強表示細胞代謝活性越強，細胞膜受損越小（馮政等，2010）。在本研究中，1.5 TU處理組細胞膜熒光強度與對照組相比顯著降低，細胞膜受損嚴重，證明脂質過氧化損傷加劇，并進一步損害細胞形態和結構。

3.3" "聯合脅迫對藻細胞形態和超微結構的影響

葉綠體的數量和結構變化直接反映光合作用能力，其中類囊體是光合反應的場所（Be?ková et al，2017）。TEM結果表明，1.5 TU處理組藻細胞類囊體和葉綠體結構明顯減少，蛋白核和淀粉鞘已經消失。這主要是類囊體膜中富含不飽和脂肪酸，容易受到過量ROS的攻擊，脂質過氧化程度不斷加深，嚴重影響藻細胞自身的正常生長以及代謝活動（Zhang et al，2020），這與Chl的結果呈一致性。SEM結果表明，1.5 TU處理組藻細胞部分溶解破裂，表明聯合脅迫引起細胞內部結構的改變，從而影響到細胞形態的變化，進一步證明聯合脅迫對細胞膜的損傷。在前人的研究中也觀察到了類似的現象，例如殺菌劑氟咯菌腈會引起微藻細胞形態和細胞膜通透性的變化（Liu et al，2022）。聯合脅迫后，藻細胞脂滴和淀粉粒數量增多，脂滴是細胞內中性脂質的主要儲存場所這與上述試驗結果中性脂質的增加呈一致性，表明PFOA和As5+聯合脅迫在一定程度上促進了細胞儲備物質的合成和積累，以供細胞適應更加惡劣的環境條件（Liu et al，2019）。

3.4" "藻細胞對污染物的吸收

聯合暴露后As濃度與初始濃度無顯著性差異。可能是：（1）As5+通過磷酸鹽轉運蛋白進入細胞，因此，暴露液中磷酸鹽的有無以及磷酸鹽與As5+的比例關系均會影響藻細胞對As5+的吸收（于清男等，2020）；（2）暴露后As可能包含多種價態和化學形態，藻細胞吸收As5+后，經過一系列代謝活動向其他組織轉運與再分配，轉化為As3+、二甲基砷（DMA）和一甲基砷（MMA）等，并通過一些途徑外排至暴露液（陳雙雙等，2022）。銅綠微囊藻長期暴露于As5+和As3+后，As形態分析表明As5+是暴露液的優勢形態，占總As的78%～93%，且As5+在暴露期間保持相對穩定（Wang et al，2013）。在本研究中，PFOA暴露后濃度與初始濃度無顯著性差異。可能與PFOA是一種疏水陰離子化合物有關，其疏水性對吸附有吸引力，但陰離子官能團與帶負電荷的藻細胞之間的靜電作用不利于吸附。因此，藻細胞對PFOA的吸附是疏水作用和靜電作用的競爭，結果最終以排斥作用為主（Hu et al，2020）。在聯合脅迫下，可能是：（1）PFOA和As5+相互競爭結合微藻表面上的配基部位（Bayo，2012）；（2）PFOA憑借較強的疏水疏油等特性，改變細胞膜結構功能，從而影響藻細胞對其他污染物的攝取（Qu et al，2016）；（3）PFOA由于其表面活性和弱電負性，可以優先與胞外聚合物相互作用，通過促進藻細胞聚集和增加胞外聚合物的產生，減少As5+進入藻細胞（Chen et al，2020）。

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（責任編輯" "熊美華" "崔莎莎）

Effects of Combined Exposure of Perfluorooctanoic Acid and As（V） on the Growth， Physiology and Biochemistry of Chlorella Vulgaris

LI Lijie1，2， YU Jiani1，2， MA Yonghua1，2， LIAO Mulan1，2， GE Heng1，2， TAN Fengxia1，2， CHAI Yi1，3

（1. Engineering Research Center for Wetland Ecology and Agricultural Utilization， Ministry of Education， Yangtze University， Jingzhou" "434025， P.R. China;

2. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou" "434025， P.R. China;

3. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou" "434025， P.R. China）

Abstract：In this study， Chlorella vulgaris was selected as the test organism， and we explored the toxic effects of combined exposure to perfluorooctanoic acid （PFOA） and arsenic （As） on C. vulgaris， focusing on growth， chlorophyll （Chl） content， primary metabolites， antioxidant enzyme activities and morphology. Five concentrations of PFOA+As（V） [0.1， 0.5， 1， 1.2 and 1.5 Toxic Unit （TU）] and a control group were set for the acute toxicity test， with each treatment in triplicate， an initial C. vulgaris density of 1×106 cells/mL and an exposure period of 96h. At the end of the test， the physiochemical parameters of C. vulgaris for each treatment were determined. All PFOA+As（V） treatments inhibited C. vulgaris growth， with the highest decrease （63.6%） at the highest dose （1.5 TU）， and the 96h half-maximum inhibitory concentration （IC50） was 1.104 TU， with PFOA and As（V） concentrations of 154.28 mg/L and 1.06 mg/L. The combined action mode was a partial additivity， which increased the ecological risk. With increased exposure concentration， the contents of total Chl， Chl-a， Chl-a/b， total protein （TP） and intracellular polysaccharide all decreased significantly， while the content of Chl-b did not significantly change. The extracellular polysaccharide and neutral lipid increased significantly. Photosynthesis was inhibited， resulting in a significant increase of cell membrane permeability， reactive oxide species （ROS） and malondialdehyde （MDA）， and a significant decrease in mitochondrial membrane potential （MMP）. Under the combined toxic stress， the antioxidant system of algal cells was disordered， and the activities of total antioxidant capacity （T-AOC）， total superoxide dismutase （T-SOD）， catalase （CAT） and adenosine triphosphate （ATP） significantly decreased， while the activities of sulfhydryl （-SH） and glutathione （GSH） significantly increased. Transmission electron microscope （TEM） and scanning electron microscope （SEM） results show that combined stress destroyed both the internal structure and external morphology of algal cells. The uptake and degradation of PFOA and As（V） by algal cells were not significant， but the uptake， degradation and bioenrichment of PFOA and As（V） by algal cells under long-term exposure to actual environmental concentrations need further study. This study provides a theoretical framework for the combined risk assessment of PFASs and heavy metals in aquatic ecosystems.

Key words： arsenic; perfluorooctanoic acid; Chlorella vulgaris; combined toxicity; antioxidant enzyme; ultrastructure

基金項目：長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心開放基金（KFT202006）。

作者簡介：李立杰，2000年生，男，碩士研究生，研究方向水生態毒理學。E-mail：648581458@qq.com

通信作者：柴毅，女，博士。E-mail：chaiyi123456@126.com