基于全長轉錄組數據的中國圓田螺微衛星特征分析與標記篩選

摘要：通過高通量測序開發中國圓田螺多態性SSR標記，為田螺的種質利用及良種選育提供技術支撐。基于PacBio’s SMRT測序獲得中國圓田螺全長轉錄組數據，查找基因組微衛星（SSR）位點并分析其特征，共識別到8 058個SSR位點，1～6個核苷酸重復SSR均存在，其中二核苷酸重復SSR數量最多（4 647，57.67%），其次為三核苷酸重復SSR（1 274，15.81%）。在二核苷酸重復基元中以AC/GT的重復數最多，占總SSR位點數的34.82%。隨機選擇合成192對引物篩選獲得22對多態性SSR引物，并使用這些標記對廣西圓田螺群體進行遺傳多樣性分析。結果表明，有22個SSR標記擴增產物穩定，22個SSR標記共檢測到102個等位基因，平均等位基因數（Na）為4.636，觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）均值分別為0.286和0.589，多態性信息含量（PIC）為0.247～0.844。在22個SSR位點中，高度多態性位點（PICgt;0.50）有13個，中度多態性位點（0.25lt;PIC≤0.50）有8個，說明中國圓田螺群體遺傳多樣性較豐富。利用PacBio’s SMRT測序技術開發中國圓田螺SSR標記不僅效率高，而且適用于中國圓田螺的資源評估。

關鍵詞：中國圓田螺；轉錄組；微衛星；多態性標記

中圖分類號：S932.4" " " " 文獻標志碼：A" " " " 文章編號：1674-3075（2025）02-0235-08

中國圓田螺（Cipangopaludina chinensis），隸屬于腹足綱（Gastropoda）、田螺科（Viviparidae）、圓田螺屬（Cipangopaludina），是我國養殖最廣的經濟淡水螺類（周康奇等，2021）。因其肉質鮮美，營養價值高，并具有一定的藥用價值，被消費者和養殖戶所喜愛，年消耗近百萬噸（陳李婷等，2019）。同時，田螺還是青魚、水蛭、中華絨毛蟹等重要經濟水產動物的天然餌料，在生態系統中發揮著重要的生態功能，具有重要的經濟價值和生態效益（Xiong et al，2017；Zhou et al，2022b）。近年來，我國田螺養殖均是未經過科學選育和評估的原生種群，長期采用“養繁一體”的養殖模式，導致近親繁殖嚴重，種質退化明顯，產量不穩定等問題逐漸突出。因此，加強田螺養殖過程中對群體多樣性的科學評估，對于田螺養殖產業可持續健康發展尤為重要。但目前國內外學者對中國圓田螺的研究主要集中在形態特征（葉苗等，2017；李哲等，2022）、營養成分（周康奇等，2021；羅輝等，2022）、生物活性（Xiong et al，2020；Zhao et al，2022；周康奇等，2023）和養殖技術（吳林，2020；楊軍等，2022）等方面，而對其微衛星標記的開發和遺傳多樣性的研究仍較為薄弱，因此，有必要對中國圓田螺開展群體遺傳學研究，以便為今后對該物種資源的挖掘利用和良種評估奠定基礎。

微衛星（microsatellite）又稱為簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR），是指以1～6個核苷酸經多次重復單位組成的簡單多次串聯重復序列（陳鴻祿，2022）。其具有分布廣泛、共顯性遺傳、多態性高、檢測方便等特點（周康奇等，2020；常浩文等，2023），現已廣泛應用于方斑東風螺（Babylonia lutosa）（梁園等，2022）、梨形環棱螺（Bellamya purificata）（金武等，2022；Yuan et al，2024）和釘螺（Oncomelania hupensis）（丁煥，2018）等腹足類種群遺傳多樣性和遺傳結構方面的研究工作。然而，目前有關中國圓田螺SSR位點的開發與特征分析的相關報道仍較少。因此，本研究利用第三代PacBio’s SMRT測序技術獲取中國圓田螺全長轉錄組數據，開發中國圓田螺多態性SSR分子標記，并分析其特征和標記篩選，以期為田螺的種質資源保護利用、人工養殖和良種選育提供科學數據。

1" "材料與方法

1.1" "RNA提取

實驗材料為1個中國圓田螺個體（體重20.30 g，殼高46.05 mm，殼寬33.27 mm），采自廣西柳州里高鎮谷之韻稻螺養殖示范基地，采集腹足、腸、肝胰臟、鰓、性腺、食道、血液、唇8個組織樣品，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存。通過Trizol法提取以上組織的總RNA，用Agilent 2100生物分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Nanodrop顯微分光光度計（Thermo Fisher）測定RNA的純度和濃度。

1.2" "文庫構建及RNA測序

利用PacBio’s SMRT測序技術進行中國圓田螺轉錄組測序。首先，用Oligo（dT）磁珠法富集mRNA，再將mRNA通過Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit反轉錄為cDNA，利用PCR反應生成雙鏈cDNA，構建SMRTbell文庫。其次，通過PacBio Sequel II測序平臺對構建的文庫進行測序，獲得約57 G的原始轉錄數據，利用Minimap2將相似的FLNC reads進行層級聚類，獲取一致性序列后用Quiver算法進行校正，并用軟件cd-hit-v4.6.7去冗余。最后，共獲得26 312條Unigene序列，總長度為67 680 460 bp，平均長度為2 572 bp，N50的長度為2 904 bp，GC含量為42.59%（Zhou et al，2022a）。

1.3" "SSR位點搜索及引物設計

利用MISA軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/ misa.html）對26 312條Unigene進行SSR位點搜索，搜索程序為單堿基重復次數≥10，二堿基重復次數≥6，三、 四、五、六堿基重復次數≥5，復合微衛星位點之間最大間隔堿基數為100 bp。用Primer 5（Version 2.4.0） 軟件對SSR位點前后的序列進行引物設計，使用M13通用接頭序列（TGTAAAACGACGGCCAGT）在上游引物5’方向進行修飾，并合成帶不同熒光基團的M13接頭序列。

1.4" "SSR位點驗證及多態性篩選

利用10個不同地理中國圓田螺群體對SSR位點進行驗證和多態性篩選，其中10個群體分別來自廣西境內珠江流域的那坡、融安、融水、大寺、興安、都安、梧州、全州、賀州和雙定，每個群體30個個體。從這10個中國圓田螺群體300個個體中，分別取20 mg新鮮腹足肌肉，采用磁珠法基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取基因組DNA，經紫外分析儀（BIO-RAD，Gel DocTM XR+）和1%凝膠瓊脂電泳檢測合格后，-20 ℃冰箱保存。PCR反應體系總體積為15 μL，包含2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，Mix primer 2.0 μL，DNA模板1 μL和ddH2O 4.5 μL。擴增程序為96 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，62～52 ℃ Touch down梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3.0 μL熒光PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后，再經DNA測序儀ABI 3 730 xl進行熒光電泳檢測，并使用軟件GeneMarker V2.2.0對原始數據進行條帶分型。

1.5" "數據分析

使用GeneMarker軟件分析57對引物擴增結果，并使用GenAIex軟件對擴增出3個等位基因以上的位點進行平均等位基因數（Na），平均觀測雜合度（Ho），平均期望雜合度（He）計算。運用Cervus軟件計算各個位點的多態信息含量指數值（PIC）。

2" "結果與分析

2.1" "中國圓田螺SSR位點數量及分布

通過MISA軟件對中國圓田螺轉錄組的所有Unigene進行檢索，共在5 294條Unigene中找到8 058個SSR位點，其發生頻率（含有SSR的Unigene數量占總Unigene數量的比例）為20.12%，其中復合型SSR位點有1 606個，占總SSR位點的19.93%。SSR位點的出現頻率（SSR位點數量占總Unigene數量的比例）為30.62%，其中3 658條Unigene序列僅包含單個SSR位點，占比69.10%，此外，有1 636條Unigene序列包含1個以上SSR位點，占比30.90%（表1）。

2.2" "中國圓田螺SSR重復類型及特征

中國圓田螺轉錄組SSR重復類型較為豐富，1～6個核苷酸重復SSR均存在，但對不同核苷酸重復類型，所含SSR位點數量存在一定差異（表2）。其中，二核苷酸重復序列數量最多（4 647，57.67%），其次是三核苷酸（1 274，15.81%）、四核苷酸（1 239，15.37%）和單核苷酸重復序列（816，10.13%），五核苷酸和六核苷酸重復序列所占比例很小，分別只有0.48%和0.53%（表2）。

在中國圓田螺SSR序列的重復單元中，單核苷酸重復單元以（A/T）n為主，其SSR位點數為673，占總SSR位點數的8.35%，在單核苷酸重復單元中占比82.48%；二核苷酸重復單元以（AC/GT）n為主，其SSR位點數為2 806，占總SSR位點數的34.82%，在二核苷酸重復單元中占比60.38%；三核苷酸重復單元以（ATC/ATG）n為主，其SSR位點數為357，占總SSR位點數的4.43%，在三核苷酸重復單元中占比28.02%；四核苷酸重復序列有3種重復單元，以（AGAT/ATCT）n為主，其SSR位點數為313，占總SSR位點數的3.88%，在四核苷酸重復單元中占比25.26%（圖1）。

在中國圓田螺轉錄組微衛星位點中，4～7次重復的微衛星位點數量最多。此外，除了單核苷酸重復單元以16～19次重復為主外，二、三、四、五和六核苷酸重復單元均以4～7次重復為主，且4～7次重復在二核苷酸重復單元上分布的微衛星位點數量最多（圖2）。

2.3" "中國圓田螺SSR位點篩選及群體遺傳多樣性分析

隨機挑選出均勻分布的192對引物，以10個不同地理中國圓田螺群體混合DNA為模板進行PCR擴增，經熒光毛細管電泳檢測其擴增結果（圖3），初步篩選57對可能存在多態性的引物，利用廣西10個中國圓田螺群體對這57對引物進行多態性驗證，最終篩選到22對SSR引物具有多態性和穩定性。

利用這22對多態性SSR引物檢測廣西中國圓田螺群體的遺傳多樣性，共獲得102個等位基因，等位基因數為3～10個，平均等位基因數為4.636；觀測雜合度為0～0.600，平均值為0.286；期望雜合度為0.265～0.860，平均值為0.589；各位點PIC為0.247～0.844，平均值為0.547，其中有13個位點的總體PIC大于0.50，屬于高度多態位點，8個位點的PIC為0.25～0.50，屬于中度多態性，只有CMS028位點的PIC小于0.25，屬于低度多態性（表3）。

3" "討論

3.1" "中國圓田螺轉錄組SSR分布

近年來，隨著高通量測序技術的不斷發展，利用轉錄組測序技術挖掘SSR多態性位點已較為常見，與傳統方法相比，該技術具有方便快捷、成本低和效率高等優點，是一種有效的分子標記開發方法。然而，目前尚未發現基于中國圓田螺全長轉錄數據開發SSR位點的相關研究。因此，本研究基于PacBio Sequel II測序平臺，獲得26 312條Unigene序列，在5 294條Unigene中找到8 058個SSR位點，其發生頻率為20.12%，高于泥東風螺（B. lutosa）（6.86%）（熊鋼等，2020）和黃口荔枝螺（Thais luteostoma）（6.45%）（李威等，2015），遠低于扁玉螺（Glossaulax didyma）（45.34%）（盧瑋筱等，2018），這說明了不同物種間其轉錄組中SSR位點的發生頻率不同。SSR位點的發生頻率存在差異，不僅與物種間的差異有關，還與組織、測序平臺、SSR位點的挖掘工具和搜索條件、以及數據庫的豐富程度等有關（Varshney et al，2005；Wei et al，2011；馬軍等，2020）。例如，張秀英等（2012）在櫛孔扇貝BES-SSR的開發中運用不同的檢索條件，最終得到的SSR數量不同，導致同一物種的SSR發生頻率不同。

3.2" "中國圓田螺SSR以二核苷酸重復類型為主

從SSR重復類型上看，中國圓田螺以二核苷酸重復為主，占比57.67%，這與已報道的扇貝“渤海紅”（Argopecten irradians “Bohaihong”）和墨西哥灣扇貝（A." irradians concentricus）（譚杰等，2018）研究結果相似；與文蛤（Meretrix meretrix）（以單核苷酸重復為主，33.89%）（田鎮等，2021）、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）（以三核苷酸重復為主，45.87%）（倪守勝等，2018）等相比存在差異。這一差異可能與物種間的特異性、位點突變頻率及選擇性進化機制等有關（于愛清等，2019）。從SSR重復基元上看，中國圓田螺以（AC/GT）n為主，占總SSR位點數的34.82%，這與朱穎等（2023）對中華圓田螺、銅銹環棱螺（Bellamya aeruginosa）、多棱角螺（Angulyagra polyzonata）和湄公螺（Mekongia rivularia）4種代表性貝類的研究結果相符，均以二核苷酸重復基元（AC/GT）n為主。從SSR重復次數上看，中國圓田螺4～7次重復的SSR位點數量最多，且主要分布在二核苷酸重復序列上，與細角螺（Hemifusus ternatanus）（李清薈等，2013）重復次數集中在7～30次略有不同。Thao等（2013）發現SSR的重復次數在12次以上，則表明具有多態性SSR位點的比例就越高。中國圓田螺的SSR重復次數集中在4～7次，略低于其他物種SSR重復次數，說明SSR重復次數可能受到物種差異、編碼區和非編碼區的選擇壓力所影響。此外，本研究篩選到的22個SSR位點，有18個為二核苷酸重復類型，其余4個為三核苷酸重復類型，不僅證實了Dreisigacker等（2004）發現的低級重復單元多態性高于高級重復單元多態性這一推論，而且說明了從二核苷酸重復類型中篩選到具有多態性SSR位點的概率更高。

3.3" "廣西中國圓田螺群體遺傳多樣性

多態信息含量PIC是評價遺傳多樣性的一個關鍵指標，本研究中各位點PIC為0.247～0.844，平均值為0.547。根據Botstein等（1980）的劃分依據：PICgt;0.50為高度多態性，0.25lt;PIC≤0.50為中度多態性，PIC≤0.25為低度多態性，表明本研究開發的微衛星標記具有高度多態性，能夠提供豐富的遺傳信息，且在中國圓田螺種群遺傳學研究中具有較高的實用性。雜合度是評估種群遺傳多樣性高低的重要指標之一，其中，觀測雜合度反映的是雜合子所占的比例，而期望雜合度反映的是隨機挑選2個等位基因出現雜合子的概率，因不易受樣本量的影響，所以能更好地反映種群遺傳多樣性水平（Appleyard amp; Ward，2006；Qin et al，2013）。本研究對基于轉錄組數據得到的微衛星引物進行篩選，并在廣西中國圓田螺群體中進行了遺傳多樣性分析，其平均等位基因數為4.636，平均觀測雜合度為0.286，平均期望雜合度為0.589，可看出觀測雜合度顯著低于期望雜合度，推測廣西中國圓田螺群體可能存在近親繁殖或雜合子缺失等問題。原因有以下2方面：（1）在田螺養殖群體中，長期采用“養繁一體”養殖模式，近親繁殖的情況極為普遍，使得養殖群體的雜合度遠低于野生群體（方軍等，2020）；（2）在進行PCR擴增時，未擴增的雜合子被當作純合子，導致雜合子數量減少，而純合子的數量增加（Kang et al，2013）；此外，非隨機交配、瓶頸效應和隨機遺傳漂變等也導致群體中的雜合子缺失（莊振俊等，2022）。綜上所述，本研究基于中國圓田螺全長轉錄組數據挖掘的多態性微衛星位點，在中國圓田螺的群體遺傳多樣性分析中取得較好的效果，具有一定的參考價值，證實了利用轉錄組數據開發SSR位點的可行性。

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（責任編輯" "鄭金秀" "崔莎莎）

Feature Analysis and Marker Development of Microsatellites for Cipangopaludina Chinensis Based on Full-length Transcriptome Data

WEI Xiaokai1，2， ZHOU Kangqi2， ZOU Xinxi1，2， LIN Yong2， YE Hua1， LUO Hui1， QIN Junqi2，CHEN Zhong2， HUANG Yin2， DU Xuesong2， ZHANG Caiqun2， PAN Xianhui2

（1. Southwest University， Chongqing" "402460， P.R. China;

2. Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，Guangxi Aquatic Breeding Base， Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning" "530021， P.R. China）

Abstract：In this study， we developed polymorphic SSR markers for Cipangopaludina chinensis using high throughput sequencing and then screened the genomic microsatellite loci and analyzed their features. The aim of the study was to provide technical support for field snail germplasm utilization and breeding. The study was based on the full-length transcriptome data for C. chinensis， which was obtained through PacBio's SMRT sequencing. A total of 8 058 SSR loci were identified and 1-6 nucleotide SSR repetition types were observed. Of these， dinucleotide repeat SSRs were the most common with 4 647 SSR loci （57.67%）， followed by trinucleotide repeat SSRs with 1 274 SSR loci （15.81%）. The AC/GT motif was the primary repeat unit among dinucleotide motifs， accounting for 34.82% of the total SSR loci. Then， 192 pairs of primers were synthesized randomly to screen the polymorphic SSR primers using 10 different geographical populations of C. chinensis. A total of 22 pairs of polymorphic SSR primers were obtained， and the polymorphic SSR markers were used to analyze the genetic diversity of C. chinensis populations in different geographic regions of Guangxi Province. The amplification products of the 22 SSR markers were steady and 102 alleles were detected across all markers， with an average number of alleles （Na） of 4.636. The average observed heterozygosity （Ho） and expected heterozygosity （He） of the alleles were 0.286 and 0.589， respectively. The polymorphic information content （PIC） ranged from 0.247 to 0.844， with the average value of 0.547. Among the 22 SSR loci， 13 were determined as highly polymorphic loci （PIC gt; 0.50）， and 8 were moderately polymorphic loci （0.25 lt; PIC ≤ 0.50）， indicating high genetic diversity within the C. chinensis population. In conclusion， PacBio SMRT sequencing technology was an efficient means of developing SSR markers for C. chinensis， and the markers proved suitable for evaluating the C. chinensis resource.

Key words： Cipangopaludina chinensis；transcriptome；microsatellite；polymorphic marker

基金項目：國家重點研發計劃項目（2022YFD2400700）；廣西創新驅動發展專項資金項目（AA17204080-5）；廣西特色淡水魚產業創新團隊項目（nycytxgxcxtd-2021-08）；廣西自然科學基金項目（2020GXNSFBA297067）；廣西科技基地與人才項目（AD21220010）。

作者簡介：韋小凱，1999年生，女，碩士研究生，主要從事水產動物遺傳育種研究。E-mail：2194742964@qq.com

共同第一作者：周康奇，1990年生，女，助理研究員，主要從事水產遺傳育種與資源增殖研究。E-mail：2472797247@qq.com

通信作者：潘賢輝。E-mail：panxhfisher@126.com