薏苡仁湯對寒濕痹阻型膠原性關節炎大鼠Treg/Th17細胞 失衡的調節作用

〔摘要〕 目的 觀察薏苡仁湯對寒濕痹阻型膠原性關節炎（CIA）大鼠的防治作用，探討其對調節性T細胞（Treg）、輔助性T細胞17（Th17）的影響。方法 采用Ⅱ型膠原注射聯合氣候箱模擬寒濕環境的方法進行造模，大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（來氟米特10 mg/kg）及薏苡仁湯低、高劑量組（生藥量分別為12、24 g/kg），每組8只。每日觀察大鼠的整體情況，每周測量右后足的關節腫脹度。給藥4周后，光學顯微鏡下觀察踝關節切片的組織病理學；ELISA法檢測疾病活動度指標類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）、C反應蛋白（CRP）、血清轉化生長因子-β（TGF-β）及白細胞介素-17A（IL-17A）水平；流式細胞術檢測外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg細胞、CD4+ IL-17+ Th17細胞所占CD4+ T細胞的比例。結果 模型組大鼠整體情況符合寒濕痹阻型CIA的典型癥狀，關節可見強直、畸形、活動功能受限等現象；薏苡仁湯低、高劑量組大鼠整體情況和關節癥狀有所改善，關節腫脹度在給藥3、4周時較模型組降低（Plt;0.01）。給藥4周后，與模型組比較，薏苡仁湯低、高劑量組踝關節在炎性細胞浸潤、滑膜/纖維組織增生、骨和軟骨結構破壞等方面均有不同程度的改善，血清RF、ACPA、CRP水平均降低（Plt;0.05，Plt;0.01），外周血Treg細胞比例及其標志性細胞因子TGF-β水平升高（Plt;0.01），Th17細胞比例及其標志性細胞因子IL-17A水平降低（Plt;0.01）。薏苡仁湯高劑量組血清TGF-β水平較薏苡仁湯低劑量組增高（Plt;0.05），其他指標兩組間差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。結論 薏苡仁湯可改善寒濕痹阻型CIA大鼠的整體情況及關節癥狀，其作用機制可能與調節Treg/Th17細胞間的免疫失衡狀態、減輕關節組織和全身的炎性反應、緩解關節軟骨和骨的破壞等有關。

〔關鍵詞〕 膠原性關節炎；寒濕痹阻證；薏苡仁湯；調節性T細胞；輔助性T細胞17；轉化生長因子-β；白細胞介素-17A

〔中圖分類號〕R285.5" " " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.001

Regulatory effects of Yiyiren Decoction on Treg/Th17 cell imbalance in rats with collagen-induced arthritis of cold-dampness obstruction pattern

LIU Xinxin1， TIAN Songyun2， CUI Jianbo1， GE Yan1， ZHANG Guobin1*

1. Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou， Henan 450046， China;

2. Xuchang Renhe Orthopedic Hospital， Xuchang， Henan 461000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the preventive and therapeutic effects of Yiyiren Decoction （YYRD） on collagen-induced arthritis （CIA） rats with cold-dampness obstruction pattern， and to investigate its impact on regulatory T cells （Treg） and T helper cell 17 （Th17） cells. Methods A rat model was established by injecting type Ⅱ collagen combined with exposure to a climate chamber simulating a cold-dampness environment. Rats were randomly divided into blank group， model group， positive control group （leflunomide 10 mg/kg）， and low- and high-dose YYRD groups （12 g/kg and 24 g/kg raw medicines， respectively）， with eight rats in each group. The overall situation signs of the rats were observed daily， and the joint swelling in the right hind paw was measured weekly. After four weeks of administration， the histopathological changes in ankle joint sections were observed under an optical microscope. ELISA was used to determine the levels of rheumatoid factor （RF）， anti-cyclic citrullinated peptide antibody （ACPA）， C-reactive protein （CRP）， serum transforming growth factor-β （TGF-β）， and interleukin-17A （IL-17A）， which are indicators of disease activity. Flow cytometry was used to check the proportions of CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells and CD4+ IL-17+ Th17 cells among CD4+ T cells in peripheral blood. Results The overall situation signs of the rats in the model group were consistent with CIA of cold-dampness obstruction pattern， with visible joint stiffness， deformity， and limited mobility. The overall situation and joint symptoms of the rats in the low- and high- dose YYRD groups were alleviated， and the degree of joint swelling was lower than that in the model group at three and four weeks after administration （Plt;0.01）. After four weeks of administration， compared with the model group， both the low- and high-dose YYRD groups showed varying degrees of reduction in ankle joint inflammatory cell infiltration， synovial/fibrous tissue hyperplasia， and bone and cartilage structure damage. The serum levels of RF， ACPA， and CRP were all reduced （Plt;0.05， Plt;0.01）， the proportion of Treg cells in peripheral blood and the level of their signature cytokine TGF-β increased （Plt;0.01）， and the proportion of Th17 cells and the level of their signature cytokine IL-17A decreased （Plt;0.01）. The serum level of TGF-β in the high-dose YYRD group was higher than that in the low-dose YYRD group （Plt;0.05）， with no statistically significant differences in other indicators between the two groups （Pgt;0.05）. Conclusion YYRD can relieve the overall situation signs and joint symptoms of rats with CIA of cold-dampness obstruction pattern. Its mechanism of action may be related to regulating the immune imbalance between Treg/Th17 cells， reducing inflammatory reactions in joint tissue and the whole body， and alleviating bone and cartilage damage.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 collagen-induced arthritis; cold-dampness obstruction pattern; Yiyiren Decoction; regulatory T cells; T helper cell 17; transforming growth factor-β; interleukin-17A

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是以滑膜炎癥、增生、軟骨破壞和骨侵蝕等關節病變為主的慢性自身免疫性疾病，目前難以治愈，關節功能受限及殘疾發生率高[1]。中醫藥憑借其整體觀念、辨證論治的自身優勢，在難治病、慢性病的診療領域發揮重要作用[2-3]。薏苡仁湯出自皇甫中的《明醫指掌·痹證》，是經典的除濕痹方劑，臨床用于寒濕痹阻型RA療效確切，可顯著改善患者的關節疼痛、腫脹、晨僵等癥狀，且具備較好的安全性[4-5]。研究顯示，RA患者體內存在調節性T細胞（regulatory T cell， Treg）、輔助性T細胞17（T helper cell 17， Th17）的免疫失衡狀態及其標志性細胞因子轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、白細胞介素-17A（interleukin-17A， IL-17A）的表達異常[6]。寒濕痹阻型RA患者的Treg/Th17細胞及血清TGF-β、IL-17A水平亦存在異常表達現象[7-8]。本研究從調控Treg/Th17細胞比例及TGF-β、IL-17A表達等角度出發，在膠原性關節炎（collagen induced arthritis， CIA）模型基礎上誘導寒濕痹阻證型，以探討薏苡仁湯的治療效果和作用機制。

1 材料

1.1" 實驗動物

健康SPF級SD大鼠40只，雌性，體質量（170±10） g，由鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場提供，許可證號：SCXK（豫）2019-0002。置于河南中醫藥大學動物房屏障環境，明暗光照12 h∶12 h，溫度20～23 ℃，相對濕度60%～70%，飼喂常規滅菌飼料及純水。實驗動物相關操作嚴格遵循河南中醫藥大學倫理委員會規定（審批號：HUCM-210049）。

1.2" 藥物和主要試劑

薏苡仁湯（組方：薏苡仁30 g，白芍、蒼術、當歸各12 g，川芎、獨活、羌活、防風各10 g，麻黃、桂枝、生姜各8 g，甘草6 g），飲片由河南中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供，制成生藥含量1.2 g/mL的水煎液。來氟米特片（商品名：愛若華，蘇州長征欣凱制藥有限公司，規格：10 mg/片，批號：210901）。

牛Ⅱ型膠原蛋白（美國Chondrex公司，批號：CA20022）；弗氏完全佐劑（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：F5881，含熱滅活結核分枝桿菌1 mg/mL）；10%甲醛固定液（貨號：ABS9179）、淋巴細胞分離液（貨號：ABS930）、RPMI-1640培養液（貨號：ABS9468）、HE染色試劑盒（批號：220407）均購自愛必信（上海）生物科技有限公司；大鼠類風濕因子（rheumatoid factor， RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody， ACPA）、C反應蛋白（C-reactive protein， CRP）、TGF-β、IL-17A ELISA試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號：20220109、20220315、20220320、20220526、20220528）；FITC標記的抗鼠CD4抗體（anti-CD4 FITC）、PE標記的抗鼠CD25抗體（anti-CD25 PE）、PE標記的抗鼠IL-17抗體（anti-IL-17 PE）、APC標記的抗鼠Foxp3抗體（anti-Foxp3 APC）（美國Becton Dickinson公司，批號：18-4651-73、16-9201-82、16-2553-82、17-6810-81）。

1.3" 主要儀器

3112型微量移液器、5418R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；BIC-300型人工氣候箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；NEO-9型動物標記儀（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司）；BW-PVM802型足趾容積測量儀（上海軟隆科技發展有限公司）；H-100型數字式動物體溫計（上海玉研科學儀器有限公司）；XHF-DY型高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BC/BD-200GHEPG型超低溫冰箱（海爾智家股份有限公司）；6749型細胞計數儀（美國Corning公司）；DSZ-44LS-FN型光學顯微鏡（日本Carton光學株式會社）；xMark型酶聯免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司）；BD FACSAria Ⅲ型流式細胞檢測儀（美國Becton Dickinson公司）。

2 方法

2.1" 寒濕痹阻型CIA模型的建立

參照文獻[9]的方法，采用Ⅱ型膠原聯合氣候箱的方法造模。將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于0.1 mol/L的冰醋酸中配成2 mg/mL溶液，4 ℃過夜后，與等體積弗氏完全佐劑混合，置于冰上3 000 r/min（離心半徑10 cm）高速離心分散攪拌，以充分乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑（含牛Ⅱ型膠原蛋白1 mg/mL、熱滅活結核分枝桿菌0.5 mg/mL）。于每只大鼠的右后足趾墊處及尾根部消毒，多點皮內注射Ⅱ型膠原乳劑0.1 mL；初次免疫1周后，于大鼠尾根部再次皮內注射Ⅱ型膠原乳劑0.1 mL以激發免疫。從初次免疫開始，每日將大鼠置于溫度（5±1） ℃、濕度85%±5%的人工氣候箱內，每次時長4 h，持續5周，以誘導寒濕痹阻證型。造模后期，模型組大鼠均表現出寒濕痹阻證的典型癥狀且關節炎指數≥4分，確定模型建立成功[10]。

2.2" 分組和干預

初次免疫1周后，將造模大鼠隨機分為4組（n=8）：模型組（等體積溶媒）、陽性組（來氟米特10 mg/kg）[11]及薏苡仁湯低、高劑量組（按人體表面積換算成大鼠等效劑量，生藥量分別為12、24 g/kg，相當于人用劑量的6倍、12倍[12]）。另取未造模的正常大鼠8只，作為空白組（等體積溶媒）。各組灌胃干預，每日1次，持續4周。

2.3" 觀察指標

2.3.1" 整體情況" 初次免疫后，參照中醫證候動物模型評價方法[13]，每日觀察大鼠的整體情況，包括精神狀態、活動量、大小便、舌象、皮毛光澤度、關節活動功能等，定期稱取大鼠體質量、攝食量并通過數字式體溫計探頭測量其足掌溫度。

2.3.2" 關節腫脹度" 造模前，在大鼠踝關節處做永久性標記，采用水容積法測量右后足容積；造模后（自給藥前至給藥4周），每周測量1次右后足容積，每次測量3次取均值。關節腫脹度按下列公式計算：關節腫脹度=（造模后容積-造模前容積）/造模前容積×100%。

2.3.3" 疾病活動度指標及細胞因子水平" 末次給藥后，各組禁食不禁水12 h，將大鼠麻醉，腹主動脈采血，4 ℃下靜置1 h，3 500 r/min低溫離心15 min（離心半徑15 cm），收集血清。按ELISA試劑盒操作步驟，采用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算血清RF、ACPA、CRP、TGF-β及IL-17A水平。

2.3.4" 關節組織病理學" 將大鼠處死后，取右后踝關節，置于10%甲醛液固定48 h，行石蠟包埋、關節矢狀面切片（厚度約5 μm）、HE染色、制片，光學顯微鏡下觀察滑膜/纖維組織增生、炎性細胞浸潤、骨結構破壞等病理變化。

2.3.5" 外周血Treg、Th17細胞比例" 自大鼠腹主動脈采集新鮮的外周血，抗凝處理后，常規密度梯度離心法分離得到單核細胞，用RPMI-1640培養基洗滌單核細胞并調整濃度為1×107個細胞/mL。取100 μL單核細胞懸液，加入anti-CD25 PE和（或）anti-CD4 FITC染色，4 ℃避光孵育30 min，固定、破膜、洗滌，加入anti-IL-17 PE或anti-Foxp3 APC染色，4 ℃避光孵育30 min，洗滌，用RPMI-1640培養基重懸細胞，采用流式細胞儀檢測分析。Treg細胞比例表示為CD4+ CD25+ Foxp3+細胞所占CD4+ T細胞的百分比，Th17細胞比例表示為CD4+ IL-17+細胞所占CD4+ T細胞的百分比。

2.4" 統計學方法

數據導入SPSS 22.0軟件進行處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用SNK檢驗，同一指標的不同時段比較采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 薏苡仁湯對寒濕痹阻型CIA大鼠整體情況的影響

空白組大鼠表現正常，體質量平穩增長。初次免疫后，寒濕痹阻證型誘導期間，模型組大鼠表現出明顯的精神萎靡、少動、便溏、舌質紫黯、皮毛無光澤等癥狀，攝食量減少，體質量增長緩慢，足掌溫度降低；初次免疫后9～11 d開始發病，后足首先出現炎性反應，逐漸累及前足及尾根部，后期關節有強直、畸形及活動功能受限等現象。各用藥組大鼠上述體征及關節癥狀均有不同程度的改善。試驗期間各組大鼠無死亡現象。

3.2" 薏苡仁湯對寒濕痹阻型CIA大鼠關節腫脹度的影響

空白組大鼠足爪正常發育，無腫脹現象。與空白組比較，模型組關節腫脹度自造模后至給藥4周均顯著增大（Plt;0.01）。與模型組比較，陽性組自給藥2周后關節腫脹度顯著減小（Plt;0.05，Plt;0.01）；薏苡仁湯低、高劑量組關節腫脹度給藥3、4周時顯著減小（Plt;0.01）。詳見表1。

3.3" 薏苡仁湯對寒濕痹阻型CIA大鼠踝關節組織病理學的影響

空白組踝關節組織結構正常，無明顯病理改變。模型組踝關節切片可見大量炎性細胞浸潤、滑膜明顯充血水腫、纖維組織過度增生、骨和軟骨結構不完整等現象。陽性組及薏苡仁湯低、高劑量組踝關節在炎性細胞浸潤、滑膜/纖維組織增生、骨和軟骨結構破壞等方面均有不同程度的改善。詳見圖1。

3.4" 薏苡仁湯對寒濕痹阻型CIA大鼠疾病活動度指標的影響

與空白組比較，模型組血清RF、ACPA、CRP水平均明顯增高（Plt;0.01）。與模型組比較，陽性組及薏苡仁湯低、高劑量組血清RF、ACPA、CRP水平均降低（Plt;0.05，Plt;0.01）。與陽性組比較，薏苡仁湯低劑量組血清CRP水平升高（Plt;0.05）。詳見表2。

3.5" 薏苡仁湯對寒濕痹阻型CIA大鼠細胞因子的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清TGF-β、IL-17A水平均明顯增高（Plt;0.01）。與模型組比較，陽性組及薏苡仁湯低、高劑量組血清TGF-β水平均增高（Plt;0.05，Plt;0.01），IL-17A水平均降低（Plt;0.05或Plt;0.01）。與陽性組比較，薏苡仁湯高劑量組血清TGF-β水平明顯升高（Plt;0.01），IL-17A水平降低（Plt;0.05）。與薏苡仁湯低劑量組比較，薏苡仁湯高劑量組血清TGF-β水平增高（Plt;0.05）。詳見表3。

3.6" 薏苡仁湯對寒濕痹阻型CIA大鼠Treg、Th17細胞比例的影響

與空白組比較，模型組Treg、Th17細胞比例均顯著升高（Plt;0.01）。與模型組比較，陽性組及薏苡仁湯低、高劑量組Treg細胞比例均升高（Plt;0.05，Plt;0.01），Th17細胞比例均降低（Plt;0.01）。與陽性組比較，薏苡仁湯高劑量組Treg細胞比例升高（Plt;0.05），薏苡仁湯低、高劑量組Th17細胞比例均降低（Plt;0.05）。詳見表4、圖2。

4 討論

RA可歸屬于中醫學“尪痹”范疇[14]，其病因多為外邪凝滯于肢體筋脈、關節，氣血運行不暢，經脈痹阻不通，致關節出現疼痛、腫脹、晨僵、變形、屈伸不利等。寒濕痹阻為RA人群較為常見的證型，因患者自體正氣不足，且長期身處濕冷環境，風寒濕邪侵襲，常伴有神疲倦怠、畏寒惡風、舌暗苔白等癥狀[15]。本研究采用Ⅱ型膠原注射聯合人工氣候箱模擬濕冷環境的方法造模，可見大鼠的體征表現基本符合寒濕痹阻的證候特征，結合踝關節腫脹度及組織病理學結果，提示該模型能夠一定程度上模擬寒濕痹阻型RA的疾病狀態。

針對寒濕痹阻型RA內因和外因相互作用的病因病機特點，治宜內扶正、外祛邪。薏苡仁湯用大劑量的薏苡仁作為君藥，意在利水滲濕、除痹散結、健脾和中；蒼術、白芍、獨活、羌活、防風為臣藥，通痹散寒、祛風除濕、益氣健脾、養血補虛；一佐麻黃、桂枝、生姜，溫通經脈、消腫止痛，二佐當歸、川芎，當歸為血中之氣藥，川芎則是氣中之血藥，二者配伍，使得補血而氣血不滯、逐瘀而氣血無損；甘草調和諸藥、引藥入脾，為使藥。諸藥合用，共奏祛風燥濕散寒、通絡除痹止痛、健脾和中、調和營衛之功。臨床研究表明，薏苡仁湯口服用于寒濕痹阻型RA療效確切，可顯著減輕患者體內炎性反應，改善關節功能，降低紅細胞沉降率和CRP等疾病活動度指標水平[16]。

RA患者的關節損傷與其體內免疫系統功能紊亂及炎性反應異常密切相關。免疫學指標RF、ACPA及炎癥指標CRP作為關節損害進展的預測因素，可為判斷RA病情活動度提供參考[17]。本研究中，模型組大鼠血清自身抗體RF、ACPA及炎癥因子CRP水平均顯著增高，提示寒濕痹阻型CIA大鼠機體處于疾病活動期，并伴有明顯的全身炎性反應。治療4周后，薏苡仁湯低、高劑量組血清RF、ACPA、CRP水平均顯著降低，關節腫脹度顯著減小，關節切片的組織病理學亦有明顯改善，說明口服薏苡仁湯可減輕寒濕痹阻型CIA大鼠的關節腔和全身的炎性反應，改善其關節受損和骨破壞程度。陳歡等[18]實驗研究表明，長期寒濕環境能加重佐劑性關節炎大鼠踝關節的損傷程度，擴大全身炎性反應，可能與寒濕環境因素刺激機體產生異常的自身免疫反應，進而促使RF、ACPA及炎癥因子的過度釋放等有關，這與本研究結果一致。

免疫細胞尤其是CD4+T細胞的異常活化為RA發生、發展的中心環節。Treg、Th17細胞亞群皆由活化的CD4+T細胞分化而成。Th17細胞主要分泌促炎細胞因子IL-17A，參與機體的進行性炎癥，并增強關節軟骨和骨破壞效應；Treg細胞通過分泌IL-10、TGF-β等抑炎細胞因子，發揮免疫負調控的作用。二者在分化上相互抑制、在功能上相互拮抗，是維持體內免疫穩態的重要組成[19]。調控Treg/Th17細胞的分化平衡亦有望成為RA新的防治手段。來氟米特屬于改善病情抗風濕藥中的免疫抑制劑，臨床使用率高、不良反應少，因其可干預T淋巴細胞及其亞群的表達、調節機體免疫應答，被選作本研究陽性對照藥。本研究結果表明，模型組大鼠Treg、Th17細胞所占比例及其標志性細胞因子TGF-β、IL-17A水平均較空白組明顯升高，提示寒濕痹阻型CIA大鼠體內T細胞處于高度活化狀態，Th17細胞比例的升高幅度更為顯著，說明Treg/Th17細胞間的分化平衡向Th17細胞傾斜。治療4周后，薏苡仁湯低、高劑量組Treg細胞比例及血清TGF-β水平均較模型組明顯升高，Th17細胞比例及血清IL-17A水平均較模型組明顯降低，說明薏苡仁湯可調控Treg/Th17細胞間的免疫失衡狀態，調節細胞因子網絡，抑制炎癥因子對滑膜組織的刺激作用及對關節軟骨的侵蝕效應，進而干預寒濕痹阻型CIA的病變進程。

綜上所述，薏苡仁湯可改善寒濕痹阻型CIA大鼠的整體情況及關節癥狀，其作用機制可能與調節Treg/Th17細胞間的免疫失衡狀態、減輕關節組織和全身的炎癥反應、抑制促炎細胞因子對關節軟骨和骨的破壞等有關，其量效關系仍有待于進一步探索。

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