補(bǔ)腎活血湯含藥血清調(diào)控髓核細(xì)胞外泌體中 miR-222-3p抑制髓核細(xì)胞凋亡的研究

〔摘要〕 目的 通過(guò)分析補(bǔ)腎活血湯含藥血清調(diào)控髓核細(xì)胞外泌體中的miR-222-3p表達(dá)，探索其抑制髓核細(xì)胞凋亡的作用。方法 （1）將髓核細(xì)胞隨機(jī)分為PBS組、空白血清組和含藥血清組。空白血清組培養(yǎng)液中加入10%普通血清，含藥血清組培養(yǎng)液中加入 10%補(bǔ)腎活血湯含藥血清，PBS組加入等體積的PBS。3組分別培養(yǎng)48 h收集標(biāo)本，提取外泌體；透射電鏡鑒定外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，Western blot鑒定外泌體溶酶體相關(guān)膜蛋白3（CD63）、腫瘤易感基因101（TSG101）蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)外泌體miR-222-3p的表達(dá)。（2）外泌體共培養(yǎng)腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)髓核細(xì)胞模型，將髓核細(xì)胞分為空白組、模型組、空白外泌體組、含藥外泌體組、Anti-miR-222-3p外泌體組；共培養(yǎng)24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率，Real-time PCR檢測(cè)各組髓核細(xì)胞miR-222-3p的表達(dá)，Western blot檢測(cè)各組髓核細(xì)胞磷酸化蛋白53（p53）、細(xì)胞色素c（Cytc）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 （1）與空白血清組比較，含藥血清組外泌體數(shù)量增多（P＜0.05），含藥血清組外泌體標(biāo)志蛋白CD63、Tsg101相對(duì)表達(dá)量均增加（P＜0.05），含藥血清組髓核細(xì)胞外泌體中miR-222-3p表達(dá)降低（P＜0.05）；（2）與模型組及空白外泌體組比較，含藥外泌體組及Anti-miR-222-3p外泌體組髓核細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低，髓核細(xì)胞miR-222-3p表達(dá)減少（P＜0.05），p53、Cytc、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。結(jié)論 （1）補(bǔ)腎活血湯含藥血清可有效促進(jìn)大鼠髓核細(xì)胞分泌外泌體，并抑制髓核細(xì)胞外泌體中miR-222-3p的表達(dá)；（2）補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體可減輕TNF-α誘導(dǎo)的退行性髓核細(xì)胞的病理?yè)p傷，并減少髓核細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制miR-222-3p及凋亡相關(guān)蛋白p53、Cytc、Caspase-1表達(dá)密切相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)腎活血湯；髓核細(xì)胞；外泌體；miR-222-3p；細(xì)胞凋亡

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.005

Effects of BuShen Huoxue Decoction-medicated serum on regulating

miR-222-3p expression in exosomes and inhabiting nucleus

pulposus cell apoptosis

TAN Wanjun1， WU Guanbao2， PENG Xingning2， FENG Shuaihua2*

1. Shaoyang Hospital of TCM， Shaoyang， Hunan 422001， China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the inhibitory effects of Bushen Huoxue Decoction-medicated serum on nucleus pulposus cell apoptosis by analyzing its regulation of miR-222-3p expression in exosomes derived from nucleus pulposus cell. Methods （1） Nucleus pulposus cells were randomly divided into PBS group， blank serum group， and medicated serum group. The blank serum group was supplemented with 10% normal serum， the medicated serum group with 10% Bushen Huoxue Decoction-medicated serum， and the PBS group with an equal volume of PBS. After 48 h， samples were collected， and exosomes were extracted. Transmission electron microscopy was used to identify the morphological structure of exosomes. Western blot was used to determine protein expressions of lysosome-associated membrane protein 3 （CD63） and tumor susceptibility gene 101 （TSG101） in exosomes. Real-time PCR was applied to examine the miR-222-3p expression in exosomes. （2） Exosomes were co-cultured with tumor necrosis factor-α （TNF-α） to induce nucleus pulposus cell models. The nucleus pulposus cells were divided into blank group， model group， blank exosome group， medicated exosome group， and Anti-miR-222-3p exosome group. After 24 h of co-culture， the apoptosis rate of nucleus pulposus cells was measured by flow cytometry， the expression of miR-222-3p in nucleus pulposus cells was determined by real-time PCR， and the protein expressions of p53， cytochrome C （Cytc）， and cysteine-aspartic acid protegase 1 （Caspase-1） were checked by Western blot among different groups. Results （1） Compared with the blank serum group， the medicated serum group showed increased number of exosomes （Plt;0.05）， elevated relative protein expression levels of exosomal marker proteins CD63 and TSG101 （Plt;0.05）， and decreased miR-222-3p expression in exosomes derived from nucleus pulposus cells. （2） Compared with the model group and the blank exosome group， the apoptosis rate of nucleus pulposus cells further decreased， the miR-222-3p expression in nucleus pulposus cells decreased （Plt;0.05）， and the relative protein expression levels of p53， Cytc， and Caspase-1 decreased （Plt;0.05） in the medicated exosome group and the Anti-miR-222-3p exosome group. Conclusion （1） Bushen Huoxue Decoction-medicated serum can effectively prompt the secretion of exosomes by rat nucleus pulposus cells and inhibit miR-222-3p expression in exosomes derived from these cells. （2） Bushen Huoxue Decoction-medicated exosomes can alleviate the pathological damage of degenerative nucleus pulposus cells induced by TNF-α and reduce nucleus pulposus cell apoptosis. The mechanism may be closely associated with the inhibition of expressions of miR-222-3p as well as apoptosis-related proteins p53， Cytc， and Caspase-1.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Bushen Huoxue Decoction; nucleus pulposus cells; exosomes; miR-222-3p; apoptosis

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration， IDD）是導(dǎo)致腰背疼痛的主要原因，據(jù)了解，80%的成年人都會(huì)經(jīng)歷某種形式的腰背疼痛，腰背疼痛已成為醫(yī)院就診的常見(jiàn)原因，每年產(chǎn)出巨大的醫(yī)療支出[1]。近年來(lái)，尋找IDD的有效治療方法成為研究重點(diǎn)[2-4]。IDD期間，椎間盤（intervertebral disc， IVD）經(jīng)歷復(fù)雜的生化和細(xì)胞變化，包括蛋白聚糖含量的損失、Ⅱ型膠原蛋白向Ⅰ型膠原蛋白的轉(zhuǎn)變以及髓核細(xì)胞密度的降低[5]。這些退行性變化直接導(dǎo)致IVD機(jī)械功能減弱，最終引起結(jié)構(gòu)破壞，例如纖維環(huán)撕裂和髓核突出。IVD的自我修復(fù)能力有限，退化過(guò)程通常會(huì)進(jìn)展直至不可逆轉(zhuǎn)[5]。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)IDD的有效治療方法已刻不容緩。

MicroRNA（miRNA）是一組單鏈、非編碼、小功能的RNA[6]，在干細(xì)胞（包括軟骨終板）成骨分化中具有關(guān)鍵作用[7-8]，miR-222-3p基因簇位于X染色體p113位點(diǎn)，對(duì)炎癥相關(guān)性疾病的負(fù)性調(diào)控作用相對(duì)明顯。有研究顯示，過(guò)表達(dá)的miR-222-3p顯著增加了髓核細(xì)胞的凋亡，減少了髓核細(xì)胞的增殖，miR-222-3p通過(guò)抑制髓核細(xì)胞的活性來(lái)調(diào)節(jié)IDD的發(fā)展[9]。但是關(guān)于中藥復(fù)方介導(dǎo)miR-222-3p調(diào)控髓核細(xì)胞參與椎間盤退變相關(guān)機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)取得大鼠髓核細(xì)胞，研究補(bǔ)腎活血湯含藥血清對(duì)大鼠髓核細(xì)胞分泌外泌體及miR-222-3p表達(dá)以及髓核細(xì)胞外泌體結(jié)構(gòu)形態(tài)及數(shù)量的影響，旨在揭示補(bǔ)腎活血湯通過(guò)介入髓核細(xì)胞外泌體的細(xì)胞機(jī)制，豐富補(bǔ)腎活血法的理論內(nèi)涵，為補(bǔ)腎活血湯防治IDD提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（300±50） g，由湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0008]。將大鼠分籠飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)中心（SPF級(jí)），飼養(yǎng)溫度為23～26 ℃，濕度為50%～60%。日照時(shí)間8：00—18：00，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室要求，每2 d更換1次墊料，厚度3～5 cm，保持清潔干燥。本課題實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（倫理審批號(hào)：ZUFY20230307）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎活血湯制備按照《傷科大成》中補(bǔ)腎活血湯的組成：熟地黃15 g，杜仲10 g，枸杞子10 g，補(bǔ)骨脂15 g，菟絲子10 g，當(dāng)歸尾10 g，沒(méi)藥10 g，山茱萸10 g，肉蓯蓉10 g，獨(dú)活10 g，紅花6 g。組方中藥材均按《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版所記載，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供，浸泡，煎煮，去渣，分別濃縮至0.58 g/mL的中藥溶液（臨床等效劑量），封瓶備用。

1.3" 主要試劑

環(huán)氧樹(shù)脂包埋套裝（北京中鏡科儀技術(shù)有限公司，批號(hào)：18005、18022、18032、18042）；環(huán)氧丙烷（上海邁瑞爾化學(xué)公司，批號(hào)：M25514）；磷酸鹽緩沖液PBS（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9062）；鋨酸、戊二醛、胰酶消化液、三抗（青鏈霉素）（中國(guó)abiowell公司，批號(hào)：AWI0136、AWI0097、AWC0232、AWH0372a）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）（abcam公司，批號(hào)：ab229366）。

1.4" 主要儀器

直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器有限公司，型號(hào)：DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號(hào)：DSZ2000X）；低速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司，型號(hào)：SL02）；烤箱（北京市光明醫(yī)療儀器公司，型號(hào)：101型）；精密pH計(jì)（中國(guó)雷磁公司，型號(hào)：E-201-C）；切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：leica UC-7）；恒溫箱（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C）；搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：TS-92）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）。

2 方法

2.1" 補(bǔ)腎活血湯含藥血清的制備

將12只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)分為含藥血清組和普通血清組，每組6只。根據(jù)人體和大鼠體表面積換算公式（x mg/kg×70 kg×0.018/0.2 kg＝6.3 x mg/kg），計(jì)算出大鼠給藥劑量，中藥血清組按0.58 g/mL濃度的補(bǔ)腎活血湯灌胃，普通血清組灌以等量生理鹽水。每天2次，共7 d。末次灌胃結(jié)束 4 h后，經(jīng)用1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心10 min（4 ℃，2 000×g）、過(guò)濾、滅活后獲得普通血清和含藥血清，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2" 髓核細(xì)胞的制備與分組

無(wú)菌剝離SD大鼠L4/5、L5/6椎間盤組織，在無(wú)菌手術(shù)條件下PBS液清洗椎間盤組織，切成碎粒，于0.25%胰蛋白酶中以37 ℃水浴消化30 min，離心5 min（4 000 r/min），去上清，PBS液清洗。收集髓核細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5％ CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。隨機(jī)分為PBS組、空白血清組及含藥血清組。空白血清組培養(yǎng)液中加入10%普通血清，含藥血清組培養(yǎng)液中加入含10%補(bǔ)腎活血湯含藥血清，PBS組加入等體積的PBS。

2.3" 髓核細(xì)胞外泌體的制備

在各組髓核細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基更換為無(wú)外泌體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后收集上清液，過(guò)濾，多次離心取上清液，所得沉淀即為外泌體。用 PBS 緩沖液洗滌沉淀并重懸，于－80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4" 髓核細(xì)胞外泌體的鑒定

各組髓核細(xì)胞進(jìn)行外泌體提取后，采用透射電鏡觀察髓核細(xì)胞外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)記物溶酶體相關(guān)膜蛋白3（lysosome-associated membrane protein 3，CD63）、腫瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101 protein，TSG101）蛋白的表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)外泌體miR-222-3p的表達(dá)。

2.5" TNF-α刺激髓核細(xì)胞與不同組別的髓核細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)

TNF-α誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞退變，使用10 ng/mL的 TNF-α刺激NPCs細(xì)胞，持續(xù)24 h，鏡下觀察 NPCs細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以明確TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞造模成功。使用不同組別的髓核細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)24 h后，電鏡下觀察各組髓核細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)，空白組：PBS培養(yǎng)的正常髓核細(xì)胞（NPCs+PBS）；模型組：PBS培養(yǎng)TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞（NPCs+TNF-α+PBS）；空白外泌體組：普通血清外泌體+TNF-α髓核細(xì)胞（NPCs+TNF-α+普通血清-Exo）；含藥外泌體組：含藥血清外泌體+TNF-α髓核細(xì)胞（NPCs+TNF-α+含藥血清-Exo）；Anti-miR-222-3p外泌體組：AntagomiR-222-3p處理后外泌體+TNF-α髓核細(xì)胞（NPCs+TNF-α+Anti-miR-222-3p-Exo）。

2.6" 流式細(xì)胞術(shù)（Annexin V-PI 雙染色法）檢測(cè)外泌體共培養(yǎng)各組髓核細(xì)胞凋亡情況

按“2.5項(xiàng)”下分組，收集各組細(xì)胞到10 mL的離心管中，每細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106/mL，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。PBS洗1次，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15 min。在1 h內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

2.7" Real-time PCR檢測(cè)外泌體共培養(yǎng)各組髓核細(xì)胞miR-222-3p的表達(dá)

按TRJzol試劑說(shuō)明書分別提取各組的miR-222-3p。用特異的TaqMan反轉(zhuǎn)錄探針將miR-222-3p反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄體系，配制反應(yīng)體系的所有操作均在冰上進(jìn)行。反應(yīng)條件：94 ℃，4 min；94 ℃，10 s；60 ℃，30 s，并檢測(cè)信號(hào)；循環(huán)39次；實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物：以β-actin為內(nèi)參，以2-△△Ct法進(jìn)行定量比較。

2.8" Western blot檢測(cè)外泌體共培養(yǎng)各組髓核細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53， p53）、細(xì)胞色素c（cytochrome c， Cytc）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 1， Caspase-1）蛋白的表達(dá)

取“2.5項(xiàng)”各組細(xì)胞的蛋白和外泌體樣本于水浴鍋中煮沸變性，各上樣20 μg，凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%封閉液封閉處理1 h后，加入p53（1∶1 000）、Cytc（1∶1 000）、Caspase-1（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，次日TBST清洗后加入二抗（1∶5 000），室溫條件下孵育2 h，洗膜，滴加ECL顯影，化學(xué)發(fā)光儀曝光成像，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.9" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均采用“ｘ±s”表示，組間比較先檢驗(yàn)資料的正態(tài)性和方差齊性，符合條件者采用t檢驗(yàn)（兩組間） 或單因素方差分析（多組間），進(jìn)一步多重比較采用 LSD法進(jìn)行；相關(guān)性分析采用簡(jiǎn)單線性回歸分析。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 各組髓核細(xì)胞外泌體結(jié)構(gòu)形態(tài)

各組細(xì)胞外泌體均呈盤狀囊泡，直徑為40～100 nm，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PBS組及空白血清組外泌體囊泡較大，含藥血清組外泌體囊泡相對(duì)較小。詳見(jiàn)圖1。

3.2" 各組髓核細(xì)胞外泌體標(biāo)志蛋白CD63、Tsg101表達(dá)情況

與PBS組比較，空白血清組外泌體標(biāo)志蛋白CD63相對(duì)表達(dá)量減少（P＜0.05），Tsg101蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P＜0.05）；與空白血清組比較，含藥血清組外泌體標(biāo)志蛋白CD63、Tsg101相對(duì)表達(dá)量均增加（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2和表1。

3.3" 各組髓核細(xì)胞外泌體中miR-222-3p表達(dá)情況

與PBS組比較，空白血清組及含藥血清組髓核細(xì)胞外泌體中miR-222-3p表達(dá)降低（P＜0.05）；與空白血清組比較，含藥血清組髓核細(xì)胞外泌體中miR-222-3p表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.4" 外泌體共培養(yǎng)各組髓核細(xì)胞凋亡情況

空白組髓核細(xì)胞晚期凋亡率為2.12%，早期凋亡率為0.52%，總凋亡率為2.64%；模型組髓核細(xì)胞晚期凋亡率為10.32%，早期凋亡率為9.34%，總凋亡率為19.66%；空白外泌體組晚期凋亡率為13.97%，早期凋亡率為5.58%，總凋亡率為19.55%；含藥外泌體組晚期凋亡率為5.32%，早期凋亡率為3.20%，總凋亡率為8.52%；Anti-miR-222-3p外泌體組晚期凋亡率為3.08%，早期凋亡率為4.81%，總凋亡率為7.89%。詳見(jiàn)圖3。

3.5" 外泌體共培養(yǎng)各組髓核細(xì)胞miR-222-3p表達(dá)情況

與空白組比較，模型組及空白外泌體組髓核細(xì)胞miR-222-3p表達(dá)增加（P＜0.05）。與模型組比較，含藥外泌體組及Anti-miR-222-3p外泌體組髓核細(xì)胞miR-222-3p表達(dá)減少（P＜0.05）。與Anti-miR-222-3p外泌體組比較，含藥外泌體組髓核細(xì)胞miR-222-3p表達(dá)增加（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

3.6" 各組髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、Cytc、Caspase-1相對(duì)表達(dá)情況

與空白組比較，模型組及空白外泌體組髓核細(xì)胞p53、Cytc、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量上升（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體組及Anti-miR-222-3p外泌體組髓核細(xì)胞p53、Cytc、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與Anti-miR-222-3p外泌體組比較，補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體組髓核細(xì)胞Cytc蛋白相對(duì)表達(dá)量上升（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖4和表4。

4 討論

外泌體來(lái)源于細(xì)胞的納米囊泡，參與細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。通過(guò)外泌體，供體細(xì)胞可以將治療藥物中的小分子或核酸藥物轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，增加治療劑的局部濃度并使其不良反應(yīng)最小化[10]。外泌體可以協(xié)助髓核細(xì)胞再生，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步幫助維持IVD的穩(wěn)態(tài)[11]。本次研究得出，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組較空白血清組外泌體數(shù)量明顯增多，但其具體機(jī)制還待進(jìn)一步研究。

CD63、Tsg101是目前常用的外泌體蛋白標(biāo)志物[12]。張偉業(yè)等[13]通過(guò)Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)，可見(jiàn)髓核細(xì)胞外泌體均有特征性膜蛋白CD63、Tsg101表達(dá)。本次研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯含藥血清組外泌體標(biāo)志蛋白CD63、Tsg101相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，與既往研究結(jié)果一致，提示補(bǔ)腎活血湯能促進(jìn)髓核細(xì)胞外泌體標(biāo)志蛋白的分泌。

外泌體含有功能蛋白質(zhì)、核酸（mRNA、miRNA、lncRNA等）和脂質(zhì)[14]，miRNA是外泌體中的重要通信物質(zhì)，多種miRNA包括miR-21、miR-199、miR-30d、miR-125a等參與調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞的凋亡[15]。外泌體中的miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16]，miR-222-3p涉及惡性腫瘤[17]、心血管疾病[18]等疾病的發(fā)展。此次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體組髓核細(xì)胞的miR-222-3p表達(dá)相較于普通血清外泌體組髓核細(xì)胞明顯減少，表明補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體可有效發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用，減少TNF-α誘導(dǎo)的退行性髓核細(xì)胞中miR-222-3p的表達(dá)，從而減少病理?yè)p傷。

頻繁的姿勢(shì)變化、疲勞負(fù)荷和久坐會(huì)增加椎間盤退變的風(fēng)險(xiǎn)，隨著椎間盤上的負(fù)荷升高，髓核細(xì)胞作為椎間盤上重要的組成部分，能感知并響應(yīng)機(jī)械刺激，若刺激加重，髓核細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞膜被破壞，最終導(dǎo)致其衰老[19]。髓核細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的多少被認(rèn)為是重建椎間盤功能的關(guān)鍵[20]。本次研究表明，補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體組總凋亡率為8.52%，空白組總凋亡率為2.64%、模型組髓核細(xì)胞總凋亡率為19.66%，空白外泌體組總凋亡率為19.55%，相比較于模型組、空白外泌體組，補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體組可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡。在凋亡相關(guān)蛋白方面，補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體組p53、Cytc、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較空白組、模型組、空白外泌體組明顯降低（P＜0.05），提示通過(guò)拮抗外泌體中miR-222-3p表達(dá)，可抑制TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，而補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體亦可通過(guò)抑制髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。

IVD歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”“腰痛”“腰腿痛”等范疇，基于各代醫(yī)家的整理和論證，將本病的基本病機(jī)總結(jié)歸納為筋脈痹阻、腰府失養(yǎng)。內(nèi)傷多責(zé)之稟賦不足，腎虧腰府失養(yǎng)；外感為風(fēng)、寒、濕、熱諸邪痹阻經(jīng)脈，或勞力扭傷，氣滯血瘀，經(jīng)脈不通而致腰痛[21]。補(bǔ)腎活血湯為《傷科大成》所記載的經(jīng)方，方中熟地黃、山茱萸為君藥，益腎填精；杜仲、枸杞子、肉蓯蓉、補(bǔ)骨脂、菟絲子為臣藥，溫補(bǔ)元陽(yáng)，使筋骨堅(jiān)強(qiáng)；當(dāng)歸尾、沒(méi)藥、紅花、獨(dú)活為佐藥，活血通絡(luò)，祛風(fēng)除濕。全方以補(bǔ)腎溫陽(yáng)為主，兼以活血祛濕，扶正祛邪，標(biāo)本兼顧。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究中證實(shí)了補(bǔ)腎活血湯可有效調(diào)控TNF-α及p38MAPK蛋白的表達(dá)，抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白分子β-catenin蛋白的表達(dá)，降低D-半乳糖致IL-1β、TGF-β1表達(dá)從而起到延緩椎間盤退變的作用[2-3]。

綜上所述，補(bǔ)腎活血湯含藥血清可有效促進(jìn)大鼠髓核細(xì)胞分泌外泌體，并抑制髓核細(xì)胞外泌體中miR-222-3p的表達(dá)；補(bǔ)腎活血湯含藥外泌體可減輕TNF-α誘導(dǎo)的退行性髓核細(xì)胞的病理?yè)p傷，并減少髓核細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制miR-222-3p及凋亡相關(guān)蛋白p53、Cytc、Caspase-1表達(dá)密切相關(guān)。

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