降脂理肝湯抑制鐵死亡改善非酒精性脂肪性肝病小鼠的研究

〔摘要〕 目的 研究降脂理肝湯對非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠的影響，并探究其中的作用機制。方法 將60只SPF級C57BL/6小鼠隨機分成空白組、模型組、鐵死亡抑制劑組（1 mg·kg-1）和降脂理肝湯高、中、低劑量組（13.30、6.60、3.30 g·kg-1）。通過喂養12周高脂飼料（HFD）建立NAFLD模型。造模成功后，每組每天分別給對應的藥物，連續6周。本實驗檢測小鼠血清中游離脂肪酸（FFA）、甘油三酯（TG）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）以及丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase， ALT）的含量；采用油紅O染色法和HE染色法檢測肝臟脂質沉積和病理損傷情況；通過RT-qPCR檢測肝組織中核因子E2相關因子2（Nrf2）、胱氨酸谷氨酸轉運蛋白（SLC7A11）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的mRNA表達情況；通過Western blot檢測肝組織中Nrf2、SLC7A11以及GPX4的蛋白表達情況。結果 與空白組相比，模型組小鼠肝臟重量和肝臟指數上升（P＜0.05），肝功能ALT、AST指標上升（P＜0.01，P＜0.05），肝臟有明顯的脂肪變性，肝小葉結構紊亂，Nrf2、SLC7A11和GPX4蛋白及mRNA表達顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，鐵死亡抑制劑組小鼠肝臟重量和肝臟指數下降（P＜0.05，P＜0.01），肝小葉結構清晰，血清中ALT、AST和TG含量下降（P＜0.01，P＜0.05），Nrf2、SLC7A11和GPX4 蛋白及mRNA表達上升（P＜0.01）。高劑量降脂理肝湯組小鼠肝臟重量和肝臟指數下降（P＜0.05），肝功能顯著改善，血脂FFA、TG下降（P＜0.05，P＜0.01），Nrf2、SLC7A11和GPX4 蛋白及mRNA的表達水平上調（P＜0.05）。降脂理肝湯中、低劑量組小鼠肝臟指數下降（P＜0.05，P＜0.01），肝功能改善，血清中FFA、TG含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結論 降脂理肝湯可降低血脂，改善肝功能，減輕NAFLD，這可能與抑制鐵死亡相關。

〔關鍵詞〕 非酒精性脂肪性肝病；鐵死亡；降脂理肝湯；Nrf2；SLC7A11；GPX4

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.006

Study on Jiangzhi Ligan Decoction inhibiting ferroptosis and alleviating non-alcoholic fatty liver disease in mice

XUE Xiaoyan1， LI Pengcheng1*， YIN Kangkang2*

1. School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 2. Office of Asset amp; Laboratory Management， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Jiangzhi Ligan Decoction （JZLGD） on non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） mice and explore its mechanism of action. Methods Sixty SPF-grade C57BL/6 mice were randomly divided into blank group， model group， ferroptosis inhibitor group （1 mg/kg-1）， and high-， medium-， and low-dose JZLGD groups （13.30， 6.60， and 3.30 g/kg-1）. The NAFLD model was established by feeding the mice high fat diet （HFD） for 12 weeks. After successful modelling， each group was given the corresponding medication daily for six consecutive weeks. In this experiment， the serum levels of free fatty acids（FFA）， triglyceride （TG）， aspartate aminotransferase （AST）， and alanine aminotransferase （ALT） were determined in mice， the hepatic lipid deposition and pathological damage in liver tissue were examined by Oil Red O staining and HE staining， the mRNA expressions of Nrf2， SLC7A11， and GPX4 in liver tissue were checked by RT-qPCR， and the protein expressions of Nrf2， SLC7A11， and GPX4 in liver tissue were determined by Western blot. Results Compared with mice in the blank group， the mice in the model group exhibited increased liver weight and liver index （Plt;0.05）， elevated liver function indicators ALT and AST （Plt;0.01， Plt;0.05）， obvious steatosis in the liver， disordered hepatic lobule structure， and significantly reduced protein and mRNA expressions of Nrf2， SLC7A11， and GPX4 （Plt;0.01）. Compared with the model group， mice in the ferroptosis inhibitor group showed decreased liver weight and liver index （Plt;0.05， Plt;0.01）， clear liver lobule structure， reduced serum levels of ALT， AST， and TG （Plt;0.01， Plt;0.05）， and increased protein and mRNA expressions of Nrf2， SLC7A11， and GPX4 （Plt;0.01）. Mice in the high-dose JZLGD group showed decreased liver weight and liver index （Plt;0.05）， significantly improved liver function， reduced blood lipids （TG and FFA） （Plt;0.05， Plt;0.01）， and upregulated protein and mRNA expressions of Nrf2， SLC7A11， and GPX4 （Plt;0.05）. Mice in the medium- and low-dose JZLGD groups also showed decreased liver index （Plt;0.05， Plt;0.01）， improved liver function， and reduced serum levels of FFA and TG （Plt;0.05， Plt;0.01）. Conclusion JZLGD can reduce blood lipids， improve liver function， and alleviate NAFLD， potentially through inhibiting ferroptosis.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 non-alcoholic fatty liver disease; ferroptosis; Jiangzhi Ligan Decoction; Nrf2; SLC7A11; GPX4

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）指以肝細胞內脂肪過度堆積為特點的普遍的臨床慢性肝病，與肥胖、胰島素抵抗和糖尿病等多種代謝綜合征密切相關[1]。據WHO統計，NAFLD成年人患病率占全球人口的25.2%，且患病率呈現增加趨勢[2]。NAFLD增加了2型糖尿病、心血管疾病及慢性腎臟疾病的風險[3]。隨著疾病的發展，NAFLD還會發展為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis， NASH），嚴重時甚至會發展為肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）[4]。

鐵死亡是新發現的一種不同于細胞凋亡、壞死和自噬的細胞死亡方式，其特征是鐵依賴性的脂質過氧化物的累積，以及起著脂質過氧化物清除作用的還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）系統的破壞[5]。YANG等[6]研究顯示，與正常飲食的小鼠相比，在代謝相關脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease， MAFLD）模型中參與抑制鐵死亡的關鍵蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白（solutecarrierfamily 7， membrane11， SLC7A11）和核因子E2相關因子2 （nuclear factor-erythroid 2 related factor 2， Nrf2）的蛋白水平均有明顯的降低。肝細胞在維持肝鐵穩態中起著重要的作用。有研究表明，在大部分的NAFLD患者中存在著血清鐵蛋白水平升高的情況[7]。鐵過載及脂質過氧化在鐵死亡的發展中起著重要作用[8]。這說明鐵死亡與NAFLD發展的機制相關。

降脂理肝湯是臨床常用經驗方，具有良好的療效，能夠減輕NAFLD[9-10]。韓靜等[11]研究表明，降脂理肝湯能夠減輕NAFLD大鼠的炎癥反應和氧化應激，改善NAFLD。本研究通過給小鼠喂食高脂飼料（high fat diet， HFD）構建NAFLD模型，并使用降脂理肝湯或鐵死亡抑制劑（ferrostatin-1）干預NAFLD小鼠，從鐵死亡層面探討降脂理肝湯對NAFLD小鼠的影響，為藥物的使用提供可靠的實驗數據。

1 材料

1.1" 動物

60只SPF級C57BL/6小鼠，體質量18～22 g，6～7周齡，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，溫度（22±2） ℃，濕度50%～70%，12 h/12 h光暗交替循環周期。本研究符合湖南中醫藥大學動物實驗管理與福利倫理委員會要求，審查批準編號：LL2022122601。

1.2" 藥物與試劑

降脂理肝湯由澤瀉10 g、荷葉10 g、丹參10 g、郁金10 g、決明子30 g、海藻30 g（批號：QW23032203、2022051302、HH23032102、HH23031305、2022101201、220901）組成，中藥飲片均購買于湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診藥房。降脂理肝湯用常規方式煎煮，減壓濃縮成1 g·mL-1濃縮液，于4 ℃冰箱中保存備用。

Ferrostatin-1（批號：HY-100579）購自美國MedChemExpress生物科技公司；生理鹽水溶液（批號：C21061604）購自江西科倫藥業有限公司；GPX4（貨號：DF6701）、Nrf2（貨號：AF0639）、SLC7A11（貨號：DF12509）抗體均購于美國Affinity公司；β-肌動蛋白（β-actin，貨號：66009-1-Ig）購自美國proteintech公司；BCA蛋白定量試劑盒（貨號：AWB0104）購自中國Abiowell公司；mRNA逆轉錄試劑盒（貨號：CW2569）購自中國北京康為世紀公司。

1.3" 儀器

Modular DPP型全自動生化儀（瑞士羅氏公司）；ChemiScope6100型化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）；PIKOREAL96型熒光定量RCP儀（美國Thermo公司）；H1650R型臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；02387型石蠟切片機（德國徠卡儀器有限公司）。

2 方法

2.1" 動物分組

60只SPF級C57BL/6小鼠隨機分成空白組、模型組、鐵死亡抑制劑組（1 mg·kg-1）和降脂理肝湯高、中、低劑量組（13.30、6.60、3.30 g·kg-1），每組10只。降脂理肝湯高、中、低劑量組給藥劑量參照前期研究，按照動物給藥劑量換算公式得出[12-13]。

2.2" 造模及給藥

小鼠經過適應性喂養1周后，喂食12周高脂飼料造模[14]。隨機抽取2只小鼠肝臟進行HE染色，觀察小鼠肝臟呈現不同程度的脂肪變性和氣球樣變，表示造模成功。將小鼠分成空白組，模型組，降脂理肝湯高、中、低劑量組，鐵死亡抑制劑組。空白組小鼠在造模過程中喂食正常飼料。在造模結束后，對降脂理肝湯高、中、低劑量組小鼠分別灌胃生藥13.30、6.60、3.30 g/（kg·d），對鐵死亡抑制劑組的小鼠腹腔注射1 mg/（kg·d）的ferrostatin-1，空白組和模型組每天灌胃等量生理鹽水。連續6周。

2.3" 血脂、肝功能檢測

給藥結束后，對小鼠進行摘眼球取血并存放于凍存管中，靜置2 h后對稱擺放于離心機中以3 000 r·min-1轉速離心15 min。離心結束后，取上層血清冷藏。采用全自動生化儀檢測血清中游離脂肪酸（free fatty acids， FFA）、甘油三酯（triglyceride， TG）和肝功能指標天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase， AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase， ALT）的含量。

2.4" 油紅O染色

取新鮮小鼠肝組織置于固定液中放置在4 ℃固定24 h，取出固定好的肝組織放于10％蔗糖溶液中脫水沉底，接著重復這個步驟將肝組織放在20％，30％蔗糖溶液中繼續脫水沉底。然后進行OTC包埋，冰凍切片。冰凍切片放于60％異丙醇中浸洗2 min，油紅O染色液染色10 min，將切片放于60％異丙醇中調色，蘇木素復染1 min，1％鹽酸乙醇中分化3 s， 流水返藍后使用甘藍明膠封片。最后將切片放于掃描機下拍照保存。

2.5" HE染色

將小鼠肝組織放在4％的多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋。肝組織石蠟樣本切片，厚度約4 μm，進行HE染色。將脫蠟后的切片2次放置于二甲苯溶液中。然后依次使用梯度乙醇（70％、80％、95％）進行脫水，脫水后進行蘇木素染色，接著1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗返藍后進行伊紅染色，最后進行梯度乙醇脫水。將切片2次放置于二甲苯溶液中透明。最后使用中性樹脂密封切片，顯微鏡下觀察。

2.6" RT-qPCR

在小鼠肝組織中加入法Trizol裂解液提取肝組織總RNA。肝組織RNA為模板逆轉錄cRNA。將逆轉錄產物進行定量RT-PCR分析。RT-qPCR擴增條件：95 ℃、15 min預變性；40個95 ℃、15 s變性和60 ℃、30 s退火循環。引物序列見表1，以β-actin為內參基因，使用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

2.7" Western blot

在小鼠肝組織中加入RIPA裂解液提取肝組織總蛋白。使用BCA定量法測量蛋白濃度。在蛋白中加入上樣緩沖液，金屬浴變性。配制10％分離膠和4.8％濃縮膠。以75 V恒定電壓電泳130 min，待溴酚藍跑至膠底部時停止電泳。以300 mA恒定電流轉膜。脫脂奶粉封閉。一抗4 ℃孵育過夜。第二天PBST 洗膜3次后使用二抗常溫孵育1 h，隨后PBST 洗膜3次。加入ECL化學發光液，凝膠成像系統顯影，分析條帶灰度值。

2.8" 統計學分析

使用SPSS 27.0軟件進行數據分析，所有數據均用“ｘ±s”表示。當數據符合正態性和方差齊性時，多組間的數據兩兩比較，使用One-way ANOVA分析，不符合正態性或方差齊性時，采用Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 小鼠肝臟質量、肝臟指數和體質量的變化

與空白組小鼠相比，模型組小鼠的肝臟質量和肝臟指數增加（P＜0.05）。與模型組小鼠相比，鐵死亡抑制劑組和降脂理肝湯高、中、低劑量組NAFLD小鼠的肝臟指數降低（P＜0.05，P＜0.01），降脂理肝湯高劑量組和鐵死亡抑制劑組NAFLD小鼠肝臟質量下降（P＜0.05）。體質量在各組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

3.2" 小鼠肝功能ALT、AST和血脂TG、FFA的變化

與空白組相比，模型組小鼠肝功能指標ALT、AST含量明顯升高（Plt;0.01，Plt;0.05）。與模型組相比，各給藥組的ALT含量均顯著降低（Plt;0.01），降脂理肝湯高、低劑量組和鐵死亡抑制劑組小鼠的AST含量明顯降低（Plt;0.01，Plt;0.05），降脂理肝湯高、中、低劑量組小鼠血清中FFA、TG的水平降低（Plt;0.01，Plt;0.05），鐵死亡抑制劑組小鼠血清中TG的水平降低（Plt;0.05）。詳見表3。

3.3" 小鼠肝組織病理變化

油紅O染色結果顯示，模型組小鼠肝組織內脂肪變性程度加重，可見著大量脂滴空泡。與模型組相比，降脂理肝湯高、中、低劑量組和鐵死亡抑制劑組小鼠肝細胞脂肪變性程度減輕，脂滴空泡減少。詳見圖1。

HE染色結果顯示，空白組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞大小均勻，肝索排列整齊。與空白組相比，模型組小鼠肝索結構紊亂，肝細胞呈氣球樣變，炎細胞浸潤伴小灶壞死。經各組藥物干預后，小鼠肝小葉結構改善，間質有少量的炎性細胞浸潤。詳見圖2。

3.4" 小鼠肝組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA的表達

與空白組相比，模型組小鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4 蛋白的表達水平顯著降低（Plt;0.01）。與模型組相比，鐵死亡抑制劑組小鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白的表達水平顯著上調（Plt;0.01），降脂理肝湯高劑量組小鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4的蛋白表達水平提高（Plt;0.05），降脂理肝湯中劑量組小鼠的SLC7A11蛋白表達水平上升（Plt;0.05）。詳見圖3、表4。

RT-qPCR結果表明，與空白組相比，模型組小鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA的表達水平顯著降低（Plt;0.01）。與模型組相比，鐵死亡抑制劑組小鼠的Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA的表達水平顯著升高（Plt;0.01），降脂理肝湯高劑量組小鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4 mRNA的表達提高（Plt;0.05），降脂理肝湯低劑量組小鼠的SLC7A11的mRNA表達上升（Plt;0.05）。見表5。

4 討論

NAFLD臨床表現為超過5%的肝臟細胞脂肪變性，與多種代謝性綜合征相關。“多重打擊學說”是目前大多數學者認可的NAFLD發生發展機制[15]。在本次實驗中，模型組小鼠肝臟存在不同程度的肝細胞氣球樣變及脂肪變性，經降脂理肝湯干預之后，肝臟脂肪變性及氣球樣變均有明顯的改善。降脂理肝湯是澤瀉、丹參、決明子、郁金、荷葉和海藻6味中藥組成的中藥方。藥方中澤瀉降脂化濁，丹參活血化瘀，為君藥；海藻軟堅散結，決明子清肝利水，為臣藥；郁金活血行氣化瘀，為佐藥；荷葉升清降濁，調和諸藥，為使藥。降脂理肝湯中多種藥物協同作用對“多重打擊”導致的NAFLD有良好的療效。經網絡藥理學分析，降脂理肝湯中存在著多種活性成分，如丹參新酮、大黃素、槲皮素等[16]。秦智等[17]研究表明，丹參酮ⅡＡ可上調Nrf2和GPX4的蛋白表達，抑制小鼠肝細胞鐵死亡。JIANG等[18]研究表明，槲皮素可減輕NAFLD小鼠肝臟脂質過氧化，提高GPX4蛋白的表達，抑制鐵死亡。降脂理肝湯可能通過丹參酮ⅡＡ和槲皮素抑制鐵死亡，改善NAFLD。

Nrf2是抗氧化的關鍵調節因子，可調控系統Xc-、GPX4、FTL（鐵蛋白輕鏈）和FPN1（亞鐵輸出鐵轉運蛋白1）等多個鐵死亡相關因子[19]。SLC7A11是系統Xc-的組成成分之一，可維持還原型谷胱甘肽（GSH）水平，并受Nrf2的轉錄調控[20]。System Xc-/GSH/GPX4軸是調控鐵死亡的經典通路。System Xc-可通過合成GSH對GPX4進行調控。GPX4可在GSH的輔助下將脂質過氧化過程產生的有毒的脂氫化合物（L-OOH）轉化為無毒的脂質醇（L-OH），減少ROS的積累，改善鐵死亡[21]。脂質過氧化過程中易產生4-HNE、MDA以及ROS。ROS可介導脂質過氧化的發生[22]。過量的4-HNE和MDA會加重NAFLD。氧化應激在NAFLD的發展中起著重要的作用。因此，Nrf2、SLC7A11和GPX4表達的增加可減少肝臟氧化應激和脂質過氧化的發生，減輕NAFLD。

在本次研究中，模型組小鼠肝臟指數上升，肝組織脂肪變性嚴重，肝功能下降，Nrf2、SLC7A11、GPX4 蛋白及mRNA表達含量下降，這說明鐵死亡發生促進NAFLD。NAFLD小鼠經鐵死亡抑制劑及高劑量降脂理肝湯干預后，肝功能明顯改善，同時Nrf2、SLC7A11和GPX4 蛋白及mRNA表達含量上升。這說明鐵死亡在NAFLD的發展中起促進作用，而高劑量降脂理肝湯可抑制鐵死亡。

綜上所述，本研究觀察降脂理肝湯對NAFLD小鼠的影響，探討NAFLD的發生發展機制，結果顯示降脂理肝湯可改善肝功能，降低血脂，抑制鐵死亡，改善NAFLD。然而，降脂理肝湯中是否存在其他單體抑制鐵死亡，改善NAFLD，仍需要深入研究。

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