真武湯與芍藥苷在系統性紅斑狼瘡中的作用及機制探討

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學和實驗研究探討真武湯（ZWD）及其關鍵成分芍藥苷（PF）在系統性紅斑狼瘡（SLE）中的治療作用及機制。方法 利用TCMSP數據庫獲取ZWD關鍵成分PF對應的靶基因信息；通過GeneCards、OMIM數據庫獲取SLE疾病相關靶基因；通過韋恩圖對PF靶基因與SLE疾病靶基因進行交集分析獲取關鍵靶點，并利用STRING平臺構建關鍵靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡模型；使用基因注釋與分析平臺DAVID 6.8對關鍵靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。體外實驗驗證：選用小鼠巨噬細胞樣細胞系RAW 264.7，實驗分為空白對照組，R848誘導組（使用R848 8 μg/mL誘導RAW 264.7細胞炎性極化48 h），PF治療組（在R848誘導極化的第24小時予以80 μmol/L處理24 h），2.5%、5%ZWD治療組（在R848誘導極化的第24小時予以2.5%、5%ZWD含藥血清處理24 h）。采用流式細胞術檢測CD86、CD206的表達情況，以明確M1型和M2型巨噬細胞比例，評估ZWD和PF對巨噬細胞炎性極化的影響。結果 網絡藥理學分析表明，PF有74個藥物靶基因，其中26個為SLE中的關鍵致病基因。GO功能富集分析顯示PF治療SLE的靶基因主要作用于細胞趨化、增殖調節和酶結合過程。KEGG通路富集顯示PF調控單核巨噬細胞的生物學功能及炎癥反應相關通路，尤其是磷酸肌醇3-激酶蛋白（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）通路、核轉錄因子（NF-κB）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子（JAK/STAT）通路，且這些通路在SLE的發病機制中起著核心作用。體外細胞學實驗顯示，與空白對照組比較，R848誘導組CD86M1型巨噬細胞比例顯著上升（Plt;0.001，Plt;0.000 1）；與R848組比較，PF組、2.5%ZWD組、5%ZWD組CD86 M1型巨噬細胞比例均顯著下降（Plt;0.001，Plt;0.000 1）。結論 中藥復方ZWD及其關鍵活性成分PF可能通過抑制單核/巨噬細胞向M1表型極化，干預炎癥反應，實現其在SLE治療中的潛在效用。

〔關鍵詞〕 系統性紅斑狼瘡；真武湯；芍藥苷；單核細胞；網絡藥理學

〔中圖分類號〕R285.5" " " " 〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.009

Effects and mechanisms of Zhenwu Decoction and paeoniflorin in treating systemic lupus erythematosus

HUANG Ting1， ZHU Quan1， CHEN Chunjing1， SHE Yan1， LUO Hui2， LU Fangguo1*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Department of Rheumatology and Immunology， Xiangya Hospital of Central South University， Changsha， Hunan 410008， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To elucidate the therapeutic effects and mechanisms of Zhenwu Decoction （ZWD） and its key component paeoniflorin （PF） in systemic lupus erythematosus （SLE） based on network pharmacology and experimental studies. Methods The target gene information corresponding to PF， the key component of ZWD， was obtained from the TCMSP database. SLE-related target genes were retrieved from the GeneCards and OMIM platforms. Key targets were identified through Venn diagram analysis of the intersection between PF target genes and SLE disease target genes. The STRING platform was used to construct a protein-protein interaction network model for the key targets. The gene annotation and analysis platform DAVID 6.8 was employed for GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the key targets. In vitro experiments validation， mouse macrophage-like cell line RAW 264.7 was selected. The experiment included blank control group， R848-induced group （RAW 264.7 cells were induced to inflammatory polarization with 8 μg/mL R848 for 48 h）， PF treatment group （treated with 80 μmol/L PF for 24 h starting from the 24th hour of R848 induction）， and 2.5% and 5% ZWD treatment groups （treated with 2.5% and 5% ZWD medicated serum for 24 h starting from the 24th hour of R848 induction）. Flow cytometry was used to check the CD86 and CD206 expressions to determine the proportion of M1 and M2 macrophages and assess the effects of ZWD and PF on macrophage inflammatory polarization. Results Network pharmacology analysis revealed that there were 74 drug target genes in PF， and 26 of which were key pathogenic genes for SLE. GO functional enrichment analysis showed that PF mainly acted on cell chemotaxis， proliferation regulation， and enzyme binding processes. KEGG pathway enrichment analysis indicated that PF can regulate biological functions of monocytes/macrophages and inflammation-related pathways， especially the phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/serine/threonine protein kinase （Akt） pathway， nuclear transcription factor （NF-κB） pathway， mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway， and Janus kinase/signal transducer and activator of transcription （JAK/STAT） pathway， which played core roles in the pathogenesis of SLE. In vitro cellular experiments showed that compared with the blank control group， the proportion of CD86 M1 macrophages in the R848-induced group significantly increased （Plt;0.001， Plt;0.000 1）. Compared with the R848-induced group， the proportions of CD86 M1 macrophages in the PF group， 2.5% ZWD group， and 5% ZWD group all notably decreased （Plt;0.001， Plt;0.000 1）. Conclusion Chinese medicine compound formula ZWD and its key active component PF may exert their potential utility in the treatment of SLE by inhibiting the polarization of monocytes/macrophages towards the M1 phenotype and intervening in the inflammatory response.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 systemic lupus erythematosus; Zhenwu Decoction; paeoniflorin; monocytes; network pharmacology

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）是一種育齡期女性高發的重大慢性、系統性自身免疫疾病，具有患病率高、病情重、合并癥廣以及預后差的特點[1]。目前，SLE的治療手段及療效有限，復發率高[2]。一項多中心縱向隊列研究數據表明，以糖皮質激素、抗瘧藥和免疫抑制劑構成的三聯療法是目前SLE最常見的治療模式[3]。在我國SLE患者的治療中，存在糖皮質激素使用周期長且劑量偏高的現象[4]。然而，糖皮質激素的作用廣泛而復雜，其靶細胞分布于全身各個組織和臟器，長期高劑量使用可能導致顯著的毒副作用，如股骨頭壞死、感染、代謝紊亂等，嚴重者甚至可能危害患者的生命安全[4]。盡管免疫抑制劑的使用可以降低激素的累積使用量，但其細胞毒性更強，且存在肝、腎及生殖毒性[5]。中醫藥憑借其多靶點作用機制，可在多維度上展現出減毒增效的效果，為SLE的治療提供重要的輔助和支持。

中醫學認為，SLE的基本病機是本虛標實，以熱毒及瘀血為標、腎虛為本，由表入里傷及臟腑，臨床常見脾腎陽虛證和熱毒熾盛證[6-7]。由附子、茯苓、白術、生姜和白芍配伍而成的經典方劑真武湯（Zhenwu Decoction， ZWD）源自古代醫學著作《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第82條和《傷寒論·辨少陰病脈證并治》第316條，其核心功效是溫補腎陽、健脾利水。在2019年發表的一項隨機對照試驗中，采用ZWD聯合免疫抑制劑連續治療8周后，SLE患者的總臨床有效率顯著升高[8]。中國中西醫結合學會在其發布的《系統性紅斑狼瘡中西醫結合診療指南》（2023版）中亦明確指出，對于以脾腎陽虛為主要證候類型的SLE患者，運用ZWD能夠有效溫腎健脾、化氣行水，達到“扶正”目的，從而發揮增效減毒的積極作用[7，9]。

針對ZWD的成分分析研究表明，其活性成分芍藥苷（Paeoniflorin， PF）對應的靶點最多，作用廣泛[10]。PF是ZWD中白芍的主要活性成分，且含量相對較高、化學性質穩定，易于提取和測定，這使得PF成為研究ZWD活性成分的理想選擇[11]。臨床上，ZWD治療SLE的具體機制有待闡明。因此，本研究擬基于網絡藥理學綜合分析ZWD及PF治療SLE的潛在分子機制，并結合臨床隊列研究及細胞試驗進行驗證，以期為ZWD及PF在SLE中的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1" 細胞與動物

小鼠巨噬細胞樣細胞系RAW 264.7購買于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司（批號：iCell-m047）。SPF級SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物飼養環境恒溫恒濕，室溫18～22 ℃，濕度40%～60%，光照12 h/d，予標準動物飼料喂養，自由飲水。本實驗于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司SPF級屏障環境開展，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2021-000，動物實驗倫理號：IACUC-SJA202410501。

1.2" 藥物

ZWD組方藥材購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。一煎：附子于全方8倍水量中煎煮1.5 h，之后加入提前浸泡20 min的茯苓、白術、白芍、生姜，武火煮至沸騰后，文火繼續煎煮40 min；二煎：4倍水武火沸騰后，文火煎煮40 min，紗布過濾。合并兩次濾液后水浴濃縮至含生藥量1.68 g/mL[12]，4 ℃下避光保存備用。

1.3" 主要試劑

DMEM培養基（美國Thermo公司，批號：11965092）；胎牛血清、青霉素-鏈霉素、CCK-8[賽文創新（北京）生物科技有限公司，批號：AFD050、SC118、SC119-02]；R848（美國Selleck生物科技有限公司，批號：144875-48-9）；PF（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：P101691）；RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：DP419）；Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，批號：AG11728、AG11701）；別藻青蛋白標記抗小鼠CD86 抗體、藻紅蛋白標記抗小鼠CD206 抗體（美國Biolegend 公司，批號：105012、141706）。

1.4" 主要儀器

臺式旋轉蒸發儀[海道爾夫儀器設備（上海）有限公司，型號：Heidolph Hei-VAP Core]；實時熒光定量 PCR 儀（德國艾本德公司，型號：Mastercycler"nexus X2）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：CytoFLEX）。

2 方法

2.1" 網絡藥理學分析

利用TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）提取ZWD的關鍵成分數據，識別主要的藥理活性成分PF（CID442534）。通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索PF的化合物信息并利用SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預測PF的潛在作用靶點。通過GeneCards數據庫（http：//www.gen？鄄ecards.org/）和OMIM數據庫（http：//www.omim.org/）獲取SLE疾病相關基因，并利用STRING平臺（https：//string-db.org/）構建SLE和PF交集基因的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡模型。使用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以明確PF治療SLE的關鍵靶點基因所參與的生物學過程及信號通路。

2.2" 含藥血清制備

大鼠經適應性喂養2 d后行灌胃操作。將大鼠隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水）和ZWD給藥組（灌胃劑量為16.8 g/kg[13]），連續7 d，1次/d。末次給藥當天禁食不禁水12 h，給藥1 h后予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g）后，予腹主動脈采血并獲取血清，56 ℃失活30 min，濾菌，-80 ℃保存。在后續的細胞實驗中，將含藥血清分別以2.5%和5%的濃度對細胞進行處理。

2.3" 細胞分組實驗

小鼠巨噬細胞樣細胞系RAW 264.7使用含有10%FBS和1%雙抗（100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素）的DMEM高糖培養基，置于37 ℃、5%CO2、濕度條件合適的培養箱中培養。實驗設置空白對照組，R848誘導組（使用R848 8 μg/mL誘導RAW 264.7細胞炎性極化48 h），PF治療組（在R848誘導極化的第24小時予以80 μmol/L處理24 h），2.5%、5%ZWD治療組（在R848誘導極化的第24小時予以2.5%、5%ZWD含藥血清處理24 h）。收集細胞，采用流式細胞術檢測CD86、CD206的表達情況，以明確M1型和M2型巨噬細胞比例。

2.4" 統計學分析

使用SPSS 26.0進行統計學分析，符合正態分布的數據采用“ｘ±s”形式表示。多組計量資料符合正態性及方差齊性則采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；若不符合正態性及方差齊性，采用非參數檢驗。均以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 網絡藥理學分析結果

分析結果確定了SLE中的937個關鍵基因和PF中的74個主要靶點，詳見圖1。其中，26個PF的靶基因被認定為SLE中的關鍵致病基因，詳見圖2。針對26個基因進行GO功能富集分析，結果表明PF治療SLE的靶基因主要富集在蛋白激酶結合、RNA聚合酶Ⅱ的轉錄正向調控、趨化因子活性調控和整合素結合等生物過程，詳見圖3。KEGG通路富集分析揭示，PF作用靶點參與包括磷酸肌醇3-激酶蛋白（phosphatidylinositol 3-kiases， PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phospho-alpha serine/threonine-protein kinase， Akt）、核因子κB（nuclear transcription factor-κB， NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子（Janus kinase-signal transducer and activators of transcription pathway， JAK/STAT）在內的多條與炎癥和免疫相關的信號通路，這些通路涉及血管內皮生長因子A、信號傳導和轉錄激活因子3和CC基序趨化因子受體6等關鍵基因，詳見圖4。

3.2" ZWD及其關鍵活性成分PF對單核巨噬細胞極化的影響

經過前期預實驗發現，80 μmol/L濃度PF可有效干預巨噬細胞M1型極化，故采取該濃度開展后續實驗。CCK-8檢測表明，ZWD含藥血清及PF對RAW 264.7細胞均無顯著細胞毒性（Pgt;0.05），詳見圖5A。與空白對照組比較，R848誘導組CD86 M1型巨噬細胞比例顯著上升（Plt;0.000 1）；與R848誘導組比較，PF治療組CD86 M1型巨噬細胞比例顯著下降（Plt;0.001），詳見圖5B。與空白對照組比較，R848誘導組CD86 M1型巨噬細胞比例顯著上升（Plt;0.001）；與R848誘導組比較，2.5%、5%ZWD治療組CD86 M1型巨噬細胞比例顯著下降（Plt;0.000 1），詳見圖5C。

4 討論

本研究發現主要聚焦于ZWD及其關鍵成分PF通過多條信號通路調控炎癥反應，以及對巨噬細胞極化表型的干預，進而揭示其在SLE中的潛在治療價值。PF對SLE中多個關鍵致病通路具有潛在的調節作用，包括PI3K/Akt、NF-κB、MAPK和JAK/STAT等多條與炎癥和免疫相關的信號通路[14-17]。有研究發現，PF可以靶向血管內皮細胞生長因子受體2介導的PI3K/Akt通路恢復自噬和抑制凋亡，從而改善糖尿病腎病中的腎臟損傷[18]，為PF在SLE中的治療潛力提供了理論基礎。另一項研究揭示，PF能夠減輕脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的巨噬細胞活化，以及其在LPS引發的NF-κB信號通路中的關鍵作用[19]。該作用機制涉及降低LPS誘導的白細胞介素1受體關聯激酶1及其下游蛋白的磷酸化水平，并抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）的表達，從而對炎癥反應進行調控[19]。

基于PI3K/Akt、NF-κB、MAPK和JAK/STAT均為調控巨噬細胞極化的核心分子通路[20-22]，本研究進一步驗證ZWD和PF對M1型巨噬細胞極化的干預作用。巨噬細胞在SLE的發病機制中發揮著多方面的作用，包括清除免疫復合物、抗原遞呈、調節炎癥和組織修復[22]。在SLE的急性炎癥期，巨噬細胞往往被極化為M1型并分泌促炎細胞因子（如TNF-α和IL-6）和高水平的共刺激分子（如CD80和CD86）來增強免疫應答、加劇組織損傷[23]。在慢性腎臟病小鼠模型中的一項研究中發現，PF顯著促進了M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的極化轉變，有效改善了腎臟的病理性損傷[24]。本研究同樣觀察到ZWD和PF對R848誘導的M1型巨噬細胞極化具有抑制作用，進一步證實了ZWD和PF可能通過調節巨噬細胞的極化狀態來干預SLE相關的炎癥過程。

本研究借助網絡藥理學分析與體外實驗發現，ZWD和PF可能通過PI3K/Akt、NF-κB、MAPK及JAK/STAT信號通路調控炎癥反應，并影響巨噬細胞極化，從而在SLE中發揮重要的免疫調節作用。在后續研究中可結合基因表達譜分析、蛋白質組學、代謝組學等綜合解析PF及ZWD在SLE中的作用機制。此外，探索ZWD與其他治療方法的聯合應用，如與免疫抑制劑、生物制劑等現代醫學治療手段相結合，將有助于形成更為有效的SLE綜合治療策略。

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