三葉委陵菜化學成分及其抗氧化活性研究

〔摘要〕 目的 研究三葉委陵菜（Potentilla freyniana Bornm.）根二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位的化學成分，并篩選其抗氧化活性成分。方法 采用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、半制備高效液相等色譜技術分離純化其醇提物的二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位，利用核磁共振波譜、質譜等技術對所得化合物的結構進行鑒定。通過羥自由基清除實驗、DPPH自由基清除實驗以及ABTS自由基清除實驗，對黃酮類化合物7和9的抗氧化活性展開測定。結果 從三葉委陵菜中分離得到17個化合物，鑒定為胡蘿卜苷（1）、β-谷甾醇（2）、7-酮-β-谷甾醇（3）、柚皮素（4）、紅花素（5）、香橙素（6）、圣草酚（7）、槲皮素（8）、兒茶素（9）、thunberginol C（10）、杜鵑醇（11）、4-（4-carboxy-2-methoxyphenoxy）-3，5-dimethoxybenzoic acid（12）、鄰苯二甲酸丁二酯（13）、香草酸（14）、原兒茶酸（15）、對羥基苯甲酸（16）、蓮花掌苷（17）。其中，化合物4為首次從該植物中分離得到，化合物3、10、12、13、14為首次從該屬植物中分離得到。化合物7（濃度大于5 mmol/L）和化合物9（濃度大于2 mmol/L）兩個化合物對羥自由基的清除率均超過90%、對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均超過95%，抗氧化水平與維生素C相近。結論 化合物7和9在抗氧化和抗炎潛力方面表現了一定活性潛力，為三葉委陵菜的化學成分和生物活性提供了一些實驗依據和科學參考，推動了其活性成分的進一步開發與利用。

〔關鍵詞〕 委陵菜屬；三葉委陵菜；化學成分；甾體；黃酮；抗氧化

〔中圖分類號〕R284.2" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０25.03.010

Chemical constituents and antioxidant activity of Potentilla freyniana Bornm.

FU Gang1，2， XIAO Shiyu1，2， YAO Qingying1，2， ZHANG Zaiqi3， JIANG Xingming1，2*， LI Bin1，2*

1. TCM and Ethnomedicine Innovation amp; Development International Laboratory， School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Province Laboratory of Natural Medicinal Resources and Functions， School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Dong Medicine， Hunan University of Medicine， Huaihua， Hunan 418000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the chemical constituents of the dichloromethane and ethyl acetate fractions of the roots of Potentilla freyniana Bornm. and to screen for their antioxidant active components. Methods The dichloromethane and ethyl acetate fractions of the ethanol extract were separated and purified using silica gel chromatography， gel chromatography， and semi-preparative HPLC. The structures of the isolated compounds were identified by NMR and MS. The antioxidant activities of the flavonoids 7 and 9 were evaluated through hydroxyl radical scavenging assay， DPPH radical scavenging assay， and ABTS radical scavenging assay. Results Seventeen compounds were isolated from P. freyniana and identified as daucosterol （1）， β-sitosterol （2）， 7-keto-β-sitosterol （3）， naringenin （4）， carthamidin （5）， dihydrokaempferol （6）， eriodictyol （7）， quercetin （8）， catechin （9）， thunberginol C （10）， rhododenol （11）， 4-（4-carboxy-2-methoxyphenoxy）-3，5-dimethoxybenzoic acid （12）， butylene phthalate （13）， vanillic acid （14）， protocatechuic acid （15）， phydroxybenzoic acid （16）， and lindleyin （17）. Among them， compound 4 was identified from this plant for the first time， and compounds 3， 10， 12， 13， and 14 were separated from this genus for the first time. When the concentration of compound 7 exceeds 5 mmol/L and the concentration of compound 9 exceeds 2 mmol/L， the scavenging rate of hydroxyl radicals exceeds 90%， and the scavenging rates of DPPH radicals and ABTS radicals exceed 95%. The antioxidant level is similar to that of VC， indicating significant antioxidant performance. Conclusion Compounds 7 and 9 exhibited certain potential in antioxidant and anti-inflammatory activities. This study provides some experimental basis and scientific references for the chemical composition and biological activity of Potentilla freyniana Bornm.， promoting the further development and utilization of its active components.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Potentilla L; Potentilla freyniana Bornm.; chemical constituents; steroid; flavone; antioxidantion

三葉委陵菜（Potentilla freyniana Bornm.）是薔薇科委陵菜屬的多年生草本植物[1]，分布于我國湖南、湖北、廣西等地，生長于海拔300～2 100 m的山坡草地、溪邊及林下陰濕處，別名有地蜂子、蜂子芪、軟梗蛇扭、毛猴子、獨腳傘、獨腳委陵菜、三爪金、地蜘蛛、鐵枕頭、三葉翻白草等[2]。三葉委陵菜使用范圍廣泛，在《浙江民間常用草藥》《湖南藥物志》《秦嶺巴山天然藥物志》等均有收錄[3]，其以根或全草入藥，夏秋采收，鮮用或曬干，味苦微辛，性微寒，歸胃、腎、大腸經，功效清熱解毒、止痛止血。其常用于腸炎、痢疾；牙痛、胃痛、腰痛；月經過多、產后或流產后出血過多；骨髓炎、骨結核；跌打損傷、創傷出血、胃腸出血；燒燙傷、蟲蛇咬傷[1-2]。目前研究顯示，三葉委陵菜的主要次生代謝產物為三萜類和黃酮類，具有抗菌、鎮痛、抗炎、抗氧化及抗病毒等活性[4]。本實驗對三葉委陵菜根部醇提物的二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位的化學成分開展了研究，利用多種色譜分離技術與波譜分析方法對化合物進行分離和結構鑒定，結果從三葉委陵菜中分離得到17個化合物。分別為胡蘿卜苷（1）、β-谷甾醇（2）、7-酮-β-谷甾醇（3）、柚皮素（4）、紅花素（5）、香橙素（6）、圣草酚（7）、槲皮素（8）、兒茶素（9）、香豆素（10）、杜鵑醇（11）、4-（4-carboxy-2-methoxyphenoxy）-3，5-dimethoxybenzoic acid（12）、鄰苯二甲酸丁二酯（13）、香草酸（14）、原兒茶酸（15）、對羥基苯甲酸（16）、蓮花掌苷（17）。并對二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位中的化合物7和9進行抗氧化活性評估。

1 材料與方法

1.1" 儀器與試劑

N-1300 旋轉蒸發儀（日本理化器械株式會社）； 6200 TOF/6500型質譜儀、Agilent 1206半制備HPLC儀（美國Agilent公司）；AV-600核磁共振儀（德國 Bruker公司）；SB-5200DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技）；ME204e電子分析天平（瑞士Mettler Toledo有限公司）；WFH-203B暗箱式紫外分析儀（杭州齊威儀器公司）；多功能酶標儀（美國熱電公司）；無水甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；Sephadex LH-20 凝膠（通用電氣醫療系統有限公司）；薄層色譜硅膠板（GF254 5 cm*10 cm，煙臺江友硅膠開發有限公司）；柱層析硅膠填料（80-100目、200-300目、300-400目，青島海洋化工有限公司）；濃硫酸-香草醛顯色劑（1%硫酸-香蘭素，自制）；Elabscience羥自由基清除能力比色法測試盒（批號：FU04FNX89641，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；DHHP自由基清除能力檢測試劑盒（批號：2407004）、ABTS自由基清除能力檢測試劑盒（批號：2404003）均購自北京索萊寶科技有限公司。FeCl3·6H2O（20 mmol/L）50 mL；0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6）500 mL。

1.2" 藥材來源

三葉委陵菜藥材來源于湖南省懷化市，經湖南中醫藥大學藥學院王智副教授鑒定為薔薇科委陵菜屬植物三葉委陵菜（Potentilla freyniana Bornm）的根。其標本（HTGPYY-1041）存放于湖南中醫藥大學湖南省中醫藥民族醫藥國際聯合實驗室。

1.3" 提取與分離

三葉委陵菜根（10 kg）粉碎后，用95%乙醇于常溫下浸漬，每次15 d，重復3次。合并提取液并減壓濃縮，得到總浸膏600 g。總浸膏用水懸濁后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓濃縮得到石油醚部位浸膏2.5 g、二氯甲烷部位浸膏41.5 g、乙酸乙酯部位浸膏96.3 g和正丁醇部位浸膏325.2 g，選擇二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位進行進一步研究。

二氯甲烷部位浸膏（40 g）與硅膠（80-100目）拌樣，干法上樣，經硅膠柱色譜（石油醚∶乙酸乙酯，1∶0-0∶1）梯度洗脫，TLC分析后合并流分，得到14個組分（C1～C14）。二氯甲烷部位浸膏（40 g）與硅膠（80-100目）拌樣，干法上樣，經硅膠柱色譜（石油醚：乙酸乙酯，1∶0-0∶1）梯度洗脫，TLC分析后合并流分，得到14個組分（C1～C14）。C10經Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇，1∶1）和硅膠柱色譜分離，最終通過半制備HPLC（0～20 min，98%甲醇，3 mL·min-1）得到化合物3（4.8 mg）。C11通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離后，采用半制備HPLC（0～20 min，80%～100%甲醇，3 mL·min-1）分離純化，得到化合物11（2.6 mg）和化合物4（5.2 mg）。C12經過多次硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（50∶1）及半制備HPLC（0～20 min，40%～50%乙腈，3 mL·min-1）分離后，得到化合物10（1.7 mg）。

乙酸乙酯部位浸膏（96.3 g）與硅膠拌樣，干法上樣，經硅膠柱色譜二氯甲烷∶甲醇（100∶0—85∶15），二氯甲烷∶甲醇∶水（15∶2∶0.25—8∶2∶0.25），乙酸乙酯∶二氯甲烷∶甲醇∶水（6∶4∶4∶1）梯度洗脫梯度洗脫，得到5個組分（F1～F5）。F2經Sephadex LH-20凝膠柱色譜及半制備HPLC分離，得到化合物14（2.5 mg）、化合物5（2.4 mg）、化合物2（4.2 mg）和化合物1（2.7 mg）。F3經過硅膠柱色譜和Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，最終通過HPLC（0～20 min，30%～90%甲醇，3 mL·min-1）分離得到化合物6（4.1 mg）、化合物7（6.8 mg）、化合物8（9.6 mg）、化合物12（13.7 mg）和化合物15（2.1 mg）。F4通過ODS反相硅膠柱色譜及HPLC分離，得到化合物9（26.9 mg）、化合物13（13.5 mg）、化合物17（5.7 mg）和化合物16（2.5 mg）。通過TLC、HPLC和光譜分析等手段對分離化合物進行結構鑒定，最終得到17個化合物。

1.4" 抗氧化活性檢測

1.4.1" 羥自由基清除能力測定" 按照參考文獻[5]描述的方法使用Solarbio試劑盒進行羥自由基清除實驗，依次吸取0.15 mL的緩沖液，0.3 mL的FeSO4溶液和H2O2溶液，測定管吸取濃度梯度的0.15 mL的待測定化合物，充分反應后加入水楊酸溶液，維生素C為陽性對照，37 ℃溫度下避光反應60 min，10 000 r/min，離心半徑15 cm、常溫離心10 min，除去沉淀，取上清液測定536 nm處測吸光度值。

計算清除率：D%=×100%。其中，A1：對照孔OD值（蒸餾水代替樣品溶液）；A2：空白孔OD值（蒸餾水和水楊酸溶液）；A3：測定孔OD值（樣品溶液和羥自由基清除能力測定溶液）。

1.4.2" 2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH自由基）清除能力測定" 按照參考文獻[6]描述的方法使用Solarbio試劑盒進行DPPH自由基清除實驗，按照濃度梯度吸取待測化合物10 μL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液190 μL，維生素C為陽性對照，避光反應30 min，515 nm處測吸光值，計算清除率。

DPPH自由基清除率D%={[A2-（A3-A1）]÷A2}×100%。其中，A1—對照孔OD值（75%的乙醇和樣品溶液）；A2—空白孔OD值（樣品溶液和DPPH）；A3—測定孔OD值（樣品溶液和DPPH）。

1.4.3" 2，2'-氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基（ABTS陽離子自由基）清除能力測定" 參考文獻[7]描述的方法使用Solarbio試劑盒進行ABTS自由基清除實驗，按照濃度梯度吸取待測化合物50 μL，加入850 μL ABTS工作液，室溫避光靜置6 min，測定405 nm處的吸光度，維生素C為做陽性對照，計算清除率。

ABTS自由基清除率D%={[A2-（A3-A1）]÷A1}×100%。其中，A1—對照孔OD值（磷酸鹽緩沖液和ABTS）；A2—空白孔OD值（蒸餾水和ABTS）；A3—測定孔OD值（樣品溶液和ABTS）。

2 結果

2.1" 結構鑒定

化合物1無色粉末（甲醇）。香草醛-濃硫酸薄層色譜顯色為藍紫色，通過電噴霧離子化質譜（ESI-MS）對化合物1進行分子量檢測，從而確定該化合物的分子量為576.40，分子式C35H60O6，不飽和度 6。經3種不同的展開劑（氯仿∶甲醇∶水=7∶2∶1；二氯甲烷∶甲醇=7∶3；正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5）TLC檢測與已知胡蘿卜苷的對照品對比一致，故鑒定化合物1為胡蘿卜苷。

化合物2無色針狀晶體（甲醇）。香草醛-濃硫酸薄層色譜顯色為藍紫色，通過ESI-MS對化合物2進行分子量檢測，從而確定該化合物的分子量為414.40，分子式C29H50O，不飽和度為 5。經3種不同劑（石油醚∶乙酸乙酯=8∶2；氯仿∶丙酮=10∶1；正己烷∶乙酸乙酯=7∶3）TLC檢測與已知β-谷甾醇的對照品對比一致，故鑒定化合物2為β-谷甾醇。

化合物3無色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z： 430.40[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz） δH：3.58（1H，m，H-3），5.66（1H，brs，H-6），1.25（3H，s，H3-19），0.74（3H，s，H3-18），0.98（1H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.87（1H，d，J=6.9 Hz，H-26），0.85（1H，d，J=6.8 Hz，H-27），0.88（1H，t，J=7.4 Hz，H-29）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC： 37.6（C-1），31.9（C-2），71.2（C-3），42.7（C-4），169.1（C-5），126.3（C-6），204.7（C-7），46.6（C-8），51.5（C-9），39.7（C-10），22.3（C-11），40.1（C-12），44.3（C-13），51.5（C-14），27.2（C-15），29.6（C-16），56.1（C-17），12.0（C-18），17.7（C-19），37.4（C-20），19.4（C-21），35.1（C-22），27.4（C-23），47.3（C-24），30.4（C-25），19.5（C-26），20.2（C-27），24.2（C-28），12.4（C-29）。以上數據與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物3為7-酮-β-谷甾醇。

化合物4淺黃色固體（甲醇）。ESI-MS m/z： 274.10[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz） δH：5.31（1H，dd，J=12.9，2.9 Hz，H-2），3.11（1H，dd，J=17.1，12.9 Hz，H-3a），2.70（1H，d，J=17.1，2.9 Hz，H-3b），5.88（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），5.89（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），7.31（2H，d，J=8.1 Hz，H-2'/6'），6.82（2H，d，J=8.2 Hz，H-3'/5'）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC：80.5（C-2），44.1（C-3），197.8（C-4），165.5（C-5），97.1（C-6），168.5（C-7），96.2（C-8），164.9（C-9），103.3（C-10），131.1（C-1'），129.0（C-2'/6'），116.3（C-3'/5'），159.0（C-4'）。以上數據與文獻報道基本一致[9]，故鑒定化合物4為柚皮素。

化合物5淺黃色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：289.20[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：5.89（1H，m，H-8），7.31（2H，d，J=8.2 Hz，H-2'/6'），6.82（2H，d，J=8.1 Hz，H-3'/5'），2.70（2H，dd，J=17.1，13.0 Hz，H-3），5.34（1H，dd，J=13.0，3.1 Hz，H-2）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC： 80.5（C-2），44.1（C- 3），197.8（C-4），165.9（C-5），128.0（C-6），159.0（C-7），96.2（C-8），165.4（C-9），103.3（C-10），131.1（C-1'），129.0（C-2'/6'），116.3（C-3'/5'），168.4（C-4'）。以上數據與文獻報道基本一致[10]，故鑒定化合物5為紅花素。

化合物6淺黃色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：289.30[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：5.78（1H，brs，H-6），5.78（1H，brs，H-8），7.31（2H，d，J=8.6 Hz，H-2'/6'），6.79（2H，d，J=8.6 Hz，H-3'/5'），4.91（1H，d，J=11.6 Hz，H-2），4.48（1H，d，J=11.5 Hz，H-3）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC： 80.5（C-2），73.6（C- 3），197.7（C-4），164.5（C-5），97.0（C-6），164.5（C-7），97.0（C-8），164.5（C-9），101.2（C-10），129.5（C-1'），130.4（C-2'/6'），116.1（C-3'/5'），159.2（C-4'）。以上數據與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物6為香橙素。

化合物7淺黃色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：289.30[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：5.84（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），5.86（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.88（1H，d，J=1.7 Hz，H-2'），6.70-6.78（2H，m，H-5'/6'），2.66（1H，dd，J=17.1，3.1 Hz，H-3），3.03（1H，dd，J=17.1，12.8 Hz，H-3），5.24（1H，dd，J=12.8，3.0 Hz，H-2）；13C-NMR （CD3OD，150 MHz）δC： 80.5（C-2），44.1（C-3），197.8（C-4），165.5（C-5），97.0 （C-6），168.4（C-7），96.2（C-8），164.9（C-9），103.3（C-10），131.8（C-1'），114.7 （C-2'），146.5（C-3'），146.9（C-4'），116.2（C-5'），119.2（C-6'）。以上數據與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物7為圣草酚。

化合物8淺黃色固體（甲醇）。ESI-MS m/z：301.20[M-H]+；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：6.39（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.16（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），7.65（1H，d，J=2.2 Hz，H-2'），6.86（1H，d，J=8.4 Hz，H-5'），7.51（1H，dd，J=8.5，2.2 Hz，H-6'）；13C-NMR（DMSO-d6，

150 MHz）δC：146.8（C-2），135.8（C-3），1176.0（C-4），156.1（C-5），98.2（C-6），160.7（C-7），93.4（C-8），163.9（C-9），103.1（C-10），122.0（C-1'），115.6（C-2'），145.1（C-3'），147.7（C-4'），115.1（C-5'），120.0（C-6'）。以上數據與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物8為槲皮素。

化合物9白色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：290.55[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：5.91（1H，d，J=2.3 Hz，H-6），5.83（1H，d，J=2.3 Hz，H-8），6.88（1H，d，J=2.0 Hz，H-2'），6.74（1H，d，J=8.1 Hz，H-5'），6.69（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6'），2.82（1H，dd，J=16.1，5.4 Hz，H-4），2.48（1H，dd，J=16.1，8.1 Hz，H-4），4.54（1H，d，J=7.5 Hz，H-2），3.99-3.91（1H，m，H-3）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC：82.8（C-2），68.8（C-3），28.5（C-4），157.7（C-5），96.3（C-6），167.5（C-7），95.5（C-8），100.9（C-9），156.9（C-10），132.2（C-1'），115.3（C-2'），146.2（C-3'），146.2（C-4'），116.1（C-5'），120.1（C-6'）。以上數據與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物9為兒茶素。

化合物10黃色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：274.30[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz） δH：5.49（1H，dd，J=12.1，3.2 Hz，H-3），3.27（1H，dd，J=16.6，12.3 Hz，H-4a），3.02（1H，dd，J=16.5，3.2 Hz，H-4b），6.27（1H，d，J=2.2 Hz，H-5），6.23（1H，d，J=2.2 Hz，H-7），7.32（2H，d，J=8.5 Hz，H-2'/6'），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3'/5'）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC：171.8（C-1），82.1（C-3），35.9（C-4），107.9（C-5），166.4（C-6），102.3（C-7），165.7（C-8），143.7（C-4a），101.7（C-8a），130.7（C-1'），129.0（C-2'/6'），116.3（C-3'/5'），159.1（C-4'）。以上數據與已知化合物[15]報道數據一致，故鑒定化合物10為香豆素類化合物 thunberginol C。

化合物11棕紅色油狀物（甲醇）。ESI-MS m/z：168.10[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz） δH：1.18（3H，d，J=6.2 Hz，H-1），3.72（1H，m，H-2），1.68（1H，m，H-3a），1.68（1H，m，H-3b），2.63（1H，m，H-4a），2.55（1H，m，H-4b），7.01（2H，d，J=8.4 Hz，H-2'/6'），6.69（2H，d，J=8.4 Hz，H-3'/5'）；13C-NMR（CD3 OD，150 MHz）δC： 23.5（C-1），67.9（C-2），42.4（C- 3），32.3（C-4），134.4（C-1'），130.2（C-2'/6'），116.1（C-3'/5'），156.3（C-4'），其旋光度為-15.0°。以上數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物11為杜鵑醇。

化合物12白色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：384.50[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：7.42-7.38（2H，s，H-2，6），7.18（2H，m，H-2'，6'），6.69（1H，d，J=8.7 Hz，H-5'），3.74（3H，s，5-OCH3），3.74（3H，s，3'-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δC： 56.7（5-OCH3），56.4（3'-OCH3），170.0（C-7），170.0（C-7'），121.9（C-1），108.2（C-2/6），148.8（C-3/5），123.0（C-1'），113.7（C-2'），152.7（C-3'），148.6（C-4'），115.8（C-5'），125.3（C-6'）。以上數據與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物12為4-（4-carboxy-2-methoxyphenoxy）-3，5-dimethoxybenzoic acid。

化合物13白色無定型粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：225.30[M+H]+；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH： 7.67（2H，dd，J=5.7，3.3 Hz，H-3/6），7.73（2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-4/5），4.23（4H，t，J=6.6 Hz，H-1'/1''），1.71-1.59（4H，m，H-2'/2''），1.45-1.31（4H，m，H-3'/3\"），0.92（6H，t，J=7.4 Hz，H-4'/4''）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δC： 131.7（C-1/2），128.7（C-3/6），131.5（C-4/5），65.0（C-1'/1''），30.0（C-2'/2''），18.7（C-3'/3''），13.6（C-4'/4''），167.0（-COO-）。以上數據與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物13為鄰苯二甲酸丁二酯。

化合物14白色無定型粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：169.20[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz） δH：7.47-7.58（2H，m，H-2/6），6.82（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），3.88（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz） δC：123.4（C-1），115.8（C-2），148.6（C-3），152.6（C-4），113.8（C-5），125.2（C-6），170.3（C-7），56.4（3-OCH3）。以上數據與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物14為香草酸。

化合物15無定形粉末（甲醇）。ESI-MS：m/z：156.70[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：7.38（1H，brs，H-2），6.73（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），7.36（1H，brs，H-6）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz） δC：123.7（C-1），115.6（C-2），145.9（C-3），151.1（C-4），117.7（C-5），123.7（C-6），171.6（C-7）。以上數據與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物15為原兒茶酸。

化合物16無色粉末（甲醇）。香草醛-濃硫酸薄層色譜熒光下顯示暗斑，過電噴霧離子化質譜（ESI-MS）對化合物16進行分子量檢測，從而確定該化合物分子量為135.10，分子式 C7H6O3，不飽和度5。經3種不同的展開劑[氯仿∶甲醇∶水=85∶15∶2；二氯甲烷∶甲醇=8∶2；正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5（需飽和）]TLC 檢測與已知對羥基苯甲酸的對照品對比一致，故鑒定化合物16為對羥基苯甲酸。

化合物17無色晶體（甲醇）。ESI-MS m/z：495.60[M+H]+；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δH：6.89（2H，d，J=8.6 Hz，H-2'/6'），6.93（2H，d，J=8.6 Hz，H-3'/5'），7.06（2H，s，H-2'''/6'''），2.73-2.54（2H，m，H-3），2.73-2.54（2H，m，H-4），2.08（1H，s，H-1），4.77（1H，d，J=7.3 Hz，H-1''）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz） δC： 30.4（C-1），29.9（C-3），45.8（C-4），136.3（C-1'），130.2（C-2'/6'），117.8（C-3'/5'），121.3（C-1'''），110.3（C-2'''/6'''），146.6（C-3'''/5'''），140.1（C-4'''），211.5（C-2），168.2（C-7'''），102.5（C-1''），75.6（C-2'''），78.0（C-3''），72.1（C-4''），74.9（C-5''），65.0（C-6'''）。以上數據與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物17為蓮花掌苷。

2.2" 抗氧化結果

隨著樣品濃度的增加，化合物7和9的自由基清除能力逐漸增強，且清除率呈上升趨勢。以對照品維生素C為標準，所有濃度下的清除率均為100%。在5 mmol/L濃度下，化合物7的羥自由基清除率為90.49%，而化合物9在2.5 mmol/L濃度時達到最高值93.24%。在DPPH自由基清除率方面，化合物7在濃度大于4 mmol/L時清除率可超過95%，化合物9在濃度大于0.75 mmol/L時也能達到95%以上。在ABTS自由基清除率方面，化合物7在濃度大于5 mmol/L時清除率超過95%，而化合物9在濃度大于1.5 mmol/L時亦可達到95%以上。不同濃度下化合物7和化合物9的羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除率見表1。

3 討論

本實驗對三葉委陵菜的二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位的化學成分進行了系統研究，采用多種分離純化方法，共分離得到17個化合物，并對其化學結構進行了鑒定。結果表明，其中化合物1～3為甾體類，4～10為黃酮類，11～17為苯環衍生物。值得注意的是，化合物4為首次從該植物中分離得到，而化合物3、10、12、13、14則是首次從該屬植物中分離得到。

在生物活性研究方面，抗氧化能力是一項重要的評估指標，能夠間接反映化合物的抗炎、抗衰老等潛在作用[22]。本研究選擇了羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基3種常用的抗氧化測定方法，以全面評估化合物的抗氧化活性，自由基清除率越高，抗氧化能力越強。其中，羥自由基是導致氧化應激的重要因子，DPPH自由基可直接反映化合物的自由基清除能力，而ABTS自由基測定方法適用于親水性和疏水性化合物的抗氧化評價[23-24]。

在抗氧化活性篩選過程中，重點評估了化合物7和化合物9。選擇這兩種化合物的主要原因如下：首先，它們均為多酚類化合物，已有文獻表明多酚類化合物具有顯著的抗氧化特性；其次，化合物9在提取部位中的相對含量較高，具有代表性；此外，它們的結構特征，如酚羥基和雙鍵，使其具備優異的自由基清除能力；同時，這兩種化合物穩定性良好，實驗操作簡便，適合用于活性篩選研究[25-26]。因此，對其抗氧化能力的深入研究，有助于進一步挖掘三葉委陵菜的潛在生物活性。

抗氧化活性與抗炎活性之間存在緊密的關聯。研究表明，氧化應激可誘發炎癥反應，而自由基的過度產生會激活炎癥信號通路，進而導致組織損傷和疾病發生[27]。因此，抗氧化能力的評估不僅有助于預測化合物的抗炎潛力，同時，抗氧化測定方法具有操作簡便、靈敏度高的優勢，可快速篩選出具有較好抗炎潛力的候選化合物，為進一步研究提供科學依據。

實驗結果顯示，化合物7和化合物9對羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均隨濃度增加而顯著提高，且在高濃度條件下，清除率均超過95%，表現出較強的抗氧化效果。這一結果驗證了兩種化合物在抗氧化方面的應用潛力。

綜上所述，本研究不僅豐富了三葉委陵菜的化學成分，為其物質基礎研究提供了實驗依據，同時，通過抗氧化活性評估，為該植物活性成分的進一步開發和利用提供了科學參考。

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