高效納米硒合成菌Bacilluslicheniformis ZY3的分離、鑒定及其產吲哚乙酸能力

摘要：從富硒土壤中篩選出1株高耐硒菌株，通過形態學觀察和分子生物學分析，對其菌種進行鑒定，并作生長還原動力學分析，對其納米硒生成率、還原生成納米硒的表征及其產生長素吲哚乙酸的能力進行研究。結果表明，菌株ZY3為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），最高可耐受400 mmol/L亞硒酸鈉。菌株ZY3的納米硒生成能力較強，能夠在16 h內將5 mmol/L亞硒酸鈉95.5%還原為紅色納米硒；純化后的納米硒粒徑為（158.8±1.82） nm，Zeta電位為 -31.79 mV，穩定性高。菌株ZY3具有較強的產吲哚乙酸能力，48 h內分泌量為47.15 mg/L；添加100 mg/L色氨酸后，吲哚乙酸分泌量提升1.43倍。高產納米硒的吲哚乙酸產生菌可用于生產富硒微生物肥料。期待本研究結果可為研發富硒微生物肥料和富硒農產品提供理論依據。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；耐硒；納米硒；吲哚乙酸；富硒促生菌

中圖分類號：S182" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）03-0215-07

李孟軍，張思尚，李娜娜，等. 高效納米硒合成菌Bacillus licheniformis ZY3的分離、鑒定及其產吲哚乙酸能力［J］. 江蘇農業科學，2025，53（3）：215-222.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2025.03.029

收稿日期：2023-12-20

基金項目：湖北省自然科學基金（編號：2023AFB968）；武漢輕工大學博士科研啟動基金（編號：2023RZ015）；湖北省鄉村振興科技支撐項目（編號：2022BBA114）。

作者簡介：李孟軍（1997—），女，河南周口人，碩士研究生，主要研究方向為微生物學。E-mail：limengjun202102@163.com。

通信作者：王璋倩，博士，副教授，主要從事資源與應用微生物學及天然產物研發研究，E-mail：wzqsnu@whpu.edu.cn；何" 毅，博士，副教授，主要從事食品生物技術研究，E-mail：heyi629@126.com。

硒（Se）是人類和動物所必需的微量元素之一，具有廣泛的生物學效應，包括抗氧化、抗腫瘤、增強人體免疫力等［1-2］。世界范圍內，硒資源分布極度不均勻，人均硒攝入范圍在7～4 990 μg/d不等［3］。我國是硒缺乏最嚴重的地區之一，缺硒地區占總面積的72%，缺硒人口超過7億［4-5］。因此，日常食用富硒食品、合理補硒是十分必要的。硒具有不同的存在形式，無機硒的人體吸收率低且安全劑量范圍較窄，高濃度無機硒有一定的毒性；有機硒的人體吸收率與安全性相對較高，但自然界中含量少，生產成本高［6］。紅色納米硒活性強、毒性低、吸收性好；而微生物作為一種可生產納米硒的重要載體，近年來受到廣泛關注［7］。研究表明，乳酸菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等均可將亞硒酸鈉還原為紅色納米硒，具有很高的研究利用價值［8-10］。芽孢桿菌具有安全性高、耐熱、抵抗外界不利因素能力強、能分泌多種酶且產酶量高等優點［11-12］。

納米硒粒徑小，具有多種生物活性。研究表明，納米硒拌豌豆種子可以促進豌豆幼苗的生長［13］。噴施納米硒于紫花苜蓿葉面，可顯著提升紫花苜蓿的產量、營養品質和硒含量［14］。隨著生物納米硒對作物生長促進作用研究的不斷深入，挖掘高產納米硒的微生物資源已成為研究熱點。已有研究表明，芽孢桿菌對亞硒酸鈉具有一定的耐受性，但是大部分菌株的耐硒能力和硒轉化效率并不高［15-16］。研究發現，地衣芽孢桿菌Bl-001在亞硒酸鈉濃度為0.7 mmol/L的改良LB液體培養基中培養36 h，亞硒酸鈉的轉化率為91.52%［17］。芽孢桿菌ES2-45在48 h內可還原1 mmol/L亞硒酸鈉，從而產生納米硒［18］。

吲哚乙酸是一種重要的植物激素，與植物生長發育息息相關［19］。有研究表明，土壤中的微生物可促進作物吲哚乙酸的分泌［20］。通過給土壤接種外源性的吲哚乙酸產生菌，可以增強植物抗氧化酶的活性，從而達到促進作物生長的目的。循環芽孢桿菌E9在LB、PYM培養基中具有不同的產吲哚乙酸能力［21］。然而，芽孢桿菌作為潛在的植物促生菌，綜合評價其促生能力的研究較少。若能篩選得到高產納米硒芽孢桿菌，探究其產吲哚乙酸的能力，將更加有利于芽孢桿菌在農業上的應用，豐富具有產吲哚乙酸功能的微生物菌種資源，對開發高效促生富硒微生物菌肥具有重要意義。

本研究從富硒土壤中篩選出1株高耐硒菌株，通過形態學觀察和分子生物學分析，對該菌株進行鑒定，并對其耐硒能力和生長還原動力進行測定和分析；測定該菌株對亞硒酸鈉的還原從而生成納米硒的能力，對該菌株產生的納米硒進行表征，并對該菌株產吲哚乙酸的能力進行測定，旨在提高生物法納米硒的生產率，并為富硒微生物的開發、富硒產品的研發提供一定的指導。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 樣品來源" 于2023年9月1日在貴州省遵義市仁懷市黔北赤水河畔的茅臺鎮附近采集土壤。

1.1.2" 主要試劑" 亞硒酸鈉（分析純）、3-吲哚乙酸，來自武漢欣申試化工科技有限公司；硒標準溶液（GSB04-1751-2004），來自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；革蘭氏染色液試劑盒，來自安徽省巢湖市弘慈醫療器械有限公司。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 菌種篩選及分離

試驗菌株ZY3，為從貴州省茅臺鎮附近的土壤地表10 cm以下土層中篩選得到。將土壤樣品置于65 ℃" 烘箱中 1 h，稱取100 mg樣品，用無菌水稀釋后分別涂布在100、200、300、400、500 mmol/L 亞硒酸鈉的LB平板上，37 ℃" 培養箱培養48 h。挑選紅色菌落的菌株純化后，命名為ZY3，進行后續試驗。

1.2.2" 菌株種屬鑒定

將菌株ZY3接種到LB平板上，觀察并記錄菌落形態；根據《常見細菌系統鑒定手冊》［22］對菌株進行生理生化鑒定。將菌株PCR產物于1%瓊脂糖電泳檢測無誤后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

1.2.3" 菌株耐硒能力的測定

固體耐硒能力測定：配制0、100、200、300、400、500 mmol/L亞硒酸鈉的LB固體培養基，挑選單菌落在LB平板上劃線，37 ℃ 培養48 h，觀察平板上菌株ZY3的生長情況和納米硒的生成情況。

液體耐硒能力測定：將菌株接種于LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養至對數期，制成種子液。取上述菌株ZY3種子液按1%濃度接種至分別含0、50、100、150、200、250 mmol/L亞硒酸鈉的LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養48 h，觀察液體顏色是否變紅，并觀察菌體和納米硒的產生情況。

1.2.4" 菌株生長動力學曲線

將菌株ZY3的種子液按照1%濃度接種到含不同濃度亞硒酸鈉（0、5、25、50、100 mmoL/L）的100 mL LB培養液中，37 ℃，180 r/min搖床培養。每 4 h 測1次D600 nm，每組重復3次，以培養時間為橫坐標、D600 nm為縱坐標，繪制菌株ZY3的生長曲線。

1.2.5" 菌株的亞硒酸鈉還原率

將菌株ZY3接種于含5 mmol/L亞硒酸鈉的LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養32 h，每4 h取樣1次，12 000 r/min 離心30 min后取上清液，使用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）定量分析殘留亞硒酸鹽的濃度，對菌株ZY3的亞硒酸鈉還原生成納米硒的能力進行測定［23］。

1.2.6" 菌株生成納米硒的表征

將1%種子液添加到含有亞硒酸鈉的LB培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養48 h。將培養液以12 000 r/min離心 15 min，收集沉淀；加入無菌水清洗后離心；收集沉淀到研缽中，進行液氮研磨。超聲分散6 min后，用無菌水將其重懸；混懸液依次過20.0、10.0、5.0、3.0、1.2、0.8 μm濾膜除菌體；混懸液用1/5體積的正己烷萃取，萃取物以12 000 r/min離心10 min，收集紅色納米硒沉淀，于4 ℃密封保存。

利用馬爾文粒度儀測定菌株ZY3合成的納米硒粒徑和Zeta電位；將純化后的納米硒送至e測試技術有限公司進行SEM-EDS測定，分析其化學組成成分；將純化后的納米硒與溴化鉀置于研缽中，研磨成細粉末，并立即將粉末置于紅外干燥儀中烘干。利用傅里葉紅外光譜儀進行光譜掃描，對測試結果進行基團分析。

1.2.7" 菌株產吲哚乙酸能力測定

吲哚乙酸定性測定：將菌株ZY3單菌落接種于含有 100 mg/L 色氨酸的LB培養基中，37 ℃、180 r/min 搖床培養 1 d，8 000 r/min將菌液離心，10 min 后取50 μL上清液，置于2 mL EP管上。加入50 μL的Salkowskis比色劑混合均勻，在2 mL EP管的第3個管中加入50 mL 20 mg/L吲哚乙酸標準溶液作為陽性對照，室溫下暗色反應30 min后，觀察顏色變化。若混合液變成粉色，表明菌株具有產吲哚乙酸的能力。

吲哚乙酸定量測定：配制10、20、30、40、50 mg/L的吲哚乙酸標準溶液，與顯色劑混合后測D530 nm，繪制吲哚乙酸標準曲線，將菌株ZY3種子液接種于L-色氨酸濃度分別為0、100、200、300、400、500、600 mg/L的LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養2 d。取菌液8 000 r/min離心10 min，取 1 mL 上清液，加入1 mL Salkowskis顯色劑混勻，室溫下暗色反應30 min，測定D530 nm。根據吲哚乙酸標準曲線來計算菌液中含有的吲哚乙酸含量。

2" 結果與分析

2.1" 菌株的分離鑒定

2.1.1" 菌株的形態特征

菌株ZY3菌落形態呈現中間凸起邊緣整齊的圓形，表面濕潤，有黏液光澤（圖1-A）。短桿狀，單個或2個并排排列，易連接成長條，革蘭氏陽性菌染色結果表明其符合地衣芽孢桿菌形態學特征（圖1-B）。

2.1.2" 菌種鑒定" 測序結果在NCBI上進行Blast同源性分析，構建系統發育樹。由圖2可知，菌株ZY3與模式菌Bacillus licheniformis KP052r 16S rDNA的相似度為96%，有較高的同源性。菌株生理生化試驗結果見表1，符合伯杰氏手冊中芽孢桿菌屬的試驗結果［24］。綜上，將該菌株命名為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis） ZY3。

2.2" 菌株ZY3的耐硒能力

通過觀察菌株ZY3在37 ℃培養48 h后的生長情況，與不加硒LB平板相比，菌株ZY3在添加硒的平板中，生長的菌落明顯變少（圖3）。在相對低濃度亞硒酸鈉板上（100 mmoL/L），菌株ZY3菌落生長較好，且有紅色納米硒生成，整個菌落呈紅色。在相對高濃度（400 mmoL/L）亞硒酸鈉平板上，仍可觀察到菌株生長及紅色納米硒生成的現象，但是菌株存活率不高。在液體發酵條件下，培養基因為菌株還原生成納米硒的緣故呈現深紅至淺黃色（圖4）。因此判斷菌株ZY3在固體平板上最高可耐 400 mmol/L 硒濃度，在液體中最高可耐受 250 mmol/L 硒濃度。

2.3" 菌株ZY3的生長曲線

菌株ZY3在亞硒酸鈉（0、5、25、50、100 mmol/L）存在下的生長動力學曲線如圖5所示。結果表明，當培養基含有5、25、50 mmol/L的亞硒酸鈉時，菌株ZY3的生長得到了明顯促進，并提前進入指數期。細菌代謝活躍，600 nm處的吸光度顯著增加，約3 h進入對數增長期。在不加硒的情況（CK）下，菌株培養24 h達到穩定期；而在5、25、50 mmol/L 亞硒酸鈉濃度下，菌株ZY3到達最大生長量的時間大幅度減少，硒濃度越低越早到達穩定期，用時分別為16、20、24 h。但在100 mmol/L條件下，菌株的生長量較低，說明該濃度抑制了菌株生長。并且，在亞硒酸

鹽（相對低濃度5、25、50 mmoL/L）存在下，培養物在對數中后期、穩定期所測得的吸光度要高于CK獲得的最大值，前人研究觀察到了同樣現象［25-26］，原因可能是硒對菌株的生長具有促進作用，使其生物量增加。

2.4" 菌株ZY3的納米硒生成率

使用ICP-MS計算菌株ZY3的納米硒生成率［27］。由于5 mmol/L亞硒酸鈉對菌株ZY3的生長具有促進作用且納米硒生成速率較快，且該濃度和前期研究相比具有一定對比意義，因此選擇該濃度進一步研究菌株ZY3（圖6）。結果表明，當菌株生長3 h后，發酵液開始變紅，12 h后有73.3%的亞硒酸鈉被還原為納米硒，16 h后有95.5%的納米硒生成，大大縮短了菌株產納米硒的時間?？莶菅挎邨U菌T5在36 h可將5 mmol/L亞硒酸鹽73%還原為納米硒［28］。地衣芽孢桿菌F1經過優化培養后，36 h可將5 mmol/L亞硒酸鹽（99.28±0.57）%還原為納米硒［29］。菌株ZY3屬于高納米硒生成率菌株，合

成納米硒效率較快，所用時間較短，有利于縮短工業化生產的時間。

2.5" 菌株ZY3生成納米硒表征

在含5 mmol/L亞硒酸鈉的LB培養基中培養12 h后，菌株ZY3和納米硒的形態如圖7所示。SEM結果顯示，納米硒為球形、形狀均勻，分散性好；通過對菌株ZY3形成球形顆粒的能譜分析，檢測到Se的特征峰，證實納米硒的存在。DLS分析結果表明，納米硒平均粒徑為（158.8±1.82） nm；Zeta電位結果表明，純化納米硒的Zeta電位為 -31.79 mV 時，穩定性較高。納米硒顆粒的大小是決定其化學性質和生物活性的重要因素。菌株ZY3可以產生體積小、穩定性高的紅色納米硒，豐富了富硒微生物資源。

由圖8可見，純化的納米硒的紫外-可見光譜在280 nm處表現出峰，通常歸因于芳香族氨基酸，表明存在黏附在納米硒表面的蛋白質物質［30］。傅里葉紅外光譜（圖9）顯示：生物源納米硒在 3 429 cm-1 處出現吸收峰，表示有O—H/—OH或N—H鍵的存在，2 921 cm-1處的吸收峰為蛋白質側鏈的脂肪族飽和酸和C—H伸縮振動，1 655 cm-1處表示有不同蛋白質結構的C—O鍵的存在，1 539 cm-1 處表示以此為中心的峰是有蛋白質酰胺CO的拉伸，1 458、1 384" cm-1處說明可能是有CH鍵的彎曲、C—O或C—H鍵的存在。1 240、1 053 cm-1 處可能分別是典型的酰胺Ⅲ/核酸磷酸、C—O—C基團的拉伸振動，這說明可能有碳水化合物和蛋白質的存在。在900～1 200、1 500～1 600 cm-1 處出現吸收峰，說明可能存在細菌的代謝產物胞外多糖及蛋白質。綜上，純化后的納米硒樣品具有酰胺、羧基等特征峰，推測納米硒含有蛋白類物質。有文獻表明，微生物源納米硒表面包裹1層蛋白質，使其顆粒結構穩定、分散均勻，可以作為天然分散劑，從而具備較好的生物活性［29］，和推測結果一致。

2.6" 菌株ZY3產吲哚乙酸能力測定

菌株ZY3在正常發酵條件下（CK，不添加L-色氨酸），具有生產吲哚乙酸的能力，且吲哚乙酸的含量隨著發酵時間延長而升高，48 h后可以達到47.15 mg/L（圖10）。添加100 mg/L色氨酸后，菌株生產吲哚乙酸的能力明顯升高，48 h后可以達到67.41 mg/L，是空白發酵組的1.43倍。結果表明，菌株ZY3既可以通過非色氨酸依賴途徑生產吲哚乙酸，又可以在色氨酸存在的條件下通過色氨酸途徑生產吲哚乙酸。

3" 討論與結論

本試驗從貴州省遵義市仁懷市黔北赤水河畔茅臺鎮附近的土壤中篩選出1株耐硒能力較強的地衣芽孢桿菌ZY3，測定其在平板培養和液體中菌株的最高耐硒濃度，繪制了菌株生長動力曲線。在添加5、25 mmol/L亞硒酸鈉處理后，與不加硒相比，菌株ZY3的生物量明顯增加，進入穩定期的時間提前，縮短了菌株生成納米硒的時間。但隨著加硒濃度增加，菌株進入對數生長期和穩定期的時間延長；副地衣芽孢桿菌Y4也觀察得到隨著硒濃度的增加，菌株進入穩定期時間滯后現象［31］。

地衣芽孢桿菌ZY3具有能夠把亞硒酸鈉還原為紅色納米硒的能力。研究表明，解淀粉芽孢桿菌SRB04在60 h內可以還原2 mmol/L亞硒酸鈉［32］；奇異變形桿菌YC801在48 h內還原5 mmol/L亞硒酸鈉［33］。本研究篩選的地衣芽孢桿菌ZY3在16 h內能把95.5%的亞硒酸鈉還原為紅色納米硒（添加量為5 mmol/L亞硒酸鈉），極大縮短了菌株產生納米硒的時間，這與目前已經報道的高還原率菌株相比具有明顯優勢，豐富了富硒微生物菌種庫。納米顆粒的大小在生物活動中起著重要作用，一般來說，較小的納米顆粒更活躍。據報道，大多數生物源性納米硒的粒徑為100～500 nm，粒徑偏小，穩定性高，無細胞毒性，具有較高的生物活性［34］。菌株ZY3產生的納米硒的平均尺寸為（158.8±1.82） nm，Zeta電位為 -31.79 mV，納米硒顆粒呈球形，粒徑較小，形狀均勻，分散性好，表面具有蛋白質物質，結構穩定。水生拉氏菌HX2產納米硒的研究［35］說明了這一特征。

本研究篩選得到的地衣芽孢桿菌ZY3具有較強的生產吲哚乙酸的能力。有研究發現，吲哚乙酸對番茄的種子萌發具有促進作用，提高了番茄的莖粗、鮮重等［36］。此外，適量添加硒也具有類似的效果。用亞硒酸鈉或納米硒處理蔬菜，能增加蔬菜中的硒含量，同時可以提升蔬菜的品質，如增加可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量等。研究表明，在葉面噴施不同濃度的生物納米硒，對杭白菜生長具有促進作用，可顯著提高杭白菜的維生素C含量和關鍵抗氧化酶活性［37］。因此，本試驗篩選得到的能夠利用高產納米硒的吲哚乙酸產生菌可作為富硒微生物肥料，期待可為富硒農業和富硒產品的研發提供理論依據。

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