草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌的抑制作用

摘要：探明草珊瑚［Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai］揮發油對越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）圓斑病病原菌（Didymella glomerata）的抑菌活性及作用機理。通過測定菌落直徑及菌絲體質量，研究揮發油對越南槐圓斑病病原菌生長的抑制作用；通過測定電導率、可溶性蛋白質含量、還原糖含量、丙二醛（MDA）含量，初步探討揮發油的作用機制。結果表明，草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌具有顯著抑菌活性，EC50為271.00 mg/L；揮發油質量濃度2 000 mg/L、作用72 h對菌絲生長的抑制效果最好，菌落擴展和菌絲生長抑制率分別為100%、95.00%；處理的電導率、可溶性蛋白質含量、MDA含量均顯著高于對照，揮發油質量濃度2 000 mg/L、處理72 h的電導率和可溶性蛋白質含量分別是對照的1.54倍和4.74倍；MDA含量在處理96 h達到最大值，是對照的3.11倍；處理還原糖含量變化不大，對照還原糖含量隨時間的延長而降低，比處理72 h降低了52.37%。

關鍵詞：草珊瑚［Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai］；越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）；揮發油；圓斑病病原菌（Didymella glomerata）；抑制作用

中圖分類號：S432.4+4；R284.1" " " " "文獻標識碼：A" " " " " 文章編號：0439-8114（2025）02-0089-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The antibacterial activity and mechanism of the volatile oil of Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai against Didymella glomerata of Sophora tonkinensis Gagnep. were investigated. The inhibitory effects of Sarcandra glabra oil on the growth of Didymella glomerata were studied by measuring the colony diameter and mycelium weight. The electrical conductivity， soluble protein， reducing sugar and malondialdehyde （MDA） were determined to investigate the action mechanism of Sarcandra glabra oil. The results showed that the volatile oil of Sarcandra glabra had significant antibacterial activity against the Didymella glomerata of Sophora tonkinensis， and the EC50 was 271.00 mg/L. The inhibitory effect on mycelial growth was the best when the concentration of volatile oil was 2 000 mg/L and the treatment time was 72 h. The inhibitory rate of colony expansion and mycelial growth were 100% and 95.00%， respectively. The electrical conductivity， soluble protein content and MDA content of the treatment group were significantly higher than those of the control group. The electrical conductivity and soluble protein content of the treatment were 1.54 times and 4.74 times of those the control， respectively when the mass concentration of volatile oil was 2 000 mg/L for 72 h. MDA reached its maximum value at 96 h， which was 3.11 times that of the control. The reducing sugar content in the treatment did not change much， and the reducing sugar content in the control group decreased with the extension of time， and was 53.36% lower than that in the treatment group at 72 h.

豆科多年生植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）是廣西大宗道地藥材山豆根的基原植物，山豆根藥材具有清熱解毒、消腫利咽等功效［1，2］。近年來隨著市場需求的增大，越南槐在廣西的種植面積也在逐步擴大。2018年在廣西越南槐種植區發現圓斑病新病害，平均發病率為45.6%，病情指數為28.16，嚴重影響越南槐的生長［3］。圓斑病防治主要還是噴施化學殺菌劑，隨著用藥量、用藥次數的不斷加大，藥材農殘超標的風險增大，將制約山豆根藥材產業的高質量、可持續發展。中藥材作為中國廣大人民群眾防病、治病的重要物質基礎，其農藥殘留超標問題一直備受關注，農殘超標不但影響中藥的療效，對人體健康造成傷害，同時也會制約中藥材走向國際市場［4，5］。為此，開發安全、環保的植物源農藥有效防治病害對保障中藥材質量安全具有重要意義。

揮發油（精油）是一類揮發性高、滲透性強、不易產生抗藥性的植物次生代謝產物［6］。國內外有不少關于揮發油防治植物病害的報道［7-9］，且在國外已經開發出一些精油類農藥，中國也逐漸重視對植物精油殺菌劑的研究［10］。

草珊瑚［Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai］為金粟蘭科草珊瑚屬植物，是中國傳統常用中藥材腫節風的基原植物，具有清熱解毒、消腫止痛、祛風除濕的功效［1，11］。草珊瑚莖、葉可提取揮發油，研究表明草珊瑚揮發油具有抗菌消炎、祛風通絡、活血散結及抑制肺炎、風濕痛、腫瘤等功效，對金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、傷寒桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等均具有一定的抑制作用［12，13］。但目前鮮見草珊瑚揮發油抑制植物病原微生物的報道。評價揮發油抑制微生物的生物效果，掌握其作用機理是更好利用這類天然產物的基礎。為此，本研究在室內試驗條件下測定了草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌的抑菌效果，并初步探討了其抑菌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 草珊瑚

所需的草珊瑚均采集自廣西柳州市融安縣草珊瑚生態種植示范基地，經廣西藥用植物園資源中心彭玉德高級工程師鑒定為草珊瑚。

1.1.2 供試越南槐病原真菌

越南槐圓斑病病原菌（Didymella glomerata），菌株編號SDG-1，由廣西藥用植物園植物病理研究室分離、鑒定并保存。

1.1.3 供試培養基和發酵液

菌株活化、拮抗試驗培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂25 g、無菌水1 L）。液體發酵培養基：馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB，含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、無菌水1 L）。

1.2 方法

1.2.1 草珊瑚揮發油提取

取用的材料為新鮮草珊瑚的莖和葉，自然晾干后用小型粉碎機粉碎，過三號篩。參照2020版《中華人民共和國藥典》揮發油測定法提取草珊瑚揮發油：稱取粉碎過篩的草珊瑚粉末250 g，置于5 000 mL圓底燒瓶中，加入2 500 mL無菌水，采用水蒸氣蒸餾法蒸餾5 h，用樣品瓶收集揮發油，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 抑菌活性測定

1）固體培養基抑菌試驗。在草珊瑚揮發油中加入適量Tween-80，用去離子水配制成質量濃度為20 000 mg/L的母液。PDA加熱溶解，溫度降至40～50 ℃時，吸取適量母液至PDA中，充分混勻后倒入一次性培養皿，配制成質量濃度為2 000、1 000、500、250、125 mg/L的含藥培養基，對照組培養基中加入與處理組等量的Tween-80。待培養基冷卻凝固后，采用直徑為6 mm的打孔器沿經活化的越南槐圓斑病病原菌SDG-1菌落邊緣制取菌餅，用接種針將菌餅菌絲面分別接種到不同濃度的含藥及對照的PDA培養基平板中心，置于溫度為（27±1） ℃的培養箱中，每處理重復3次，分別于接菌后24、48、72、120 h采用十字交叉法測量菌落直徑（mm），計算抑菌率，并采用最小二乘法求出毒力回歸方程、相關系數（r）、有效中濃度（EC50）及EC50的95%置信限。

菌落擴展直徑（mm）=實測菌落直徑（mm）-6 mm

抑制率=（對照菌落擴展直徑-處理菌落擴展直徑）/對照菌落擴展直徑×100%

2）液體培養基抑菌試驗。在草珊瑚揮發油中加入適量Tween-80，用去離子水配制成質量濃度為20 000 mg/L的母液；取滅菌的錐形瓶，分別加入適量母液，加PDB定容至100 mL，配制成質量濃度為" "2 000、1 000、500、250、125 mg/L的含藥培養基，對照組培養基中加入與處理組等量的Tween-80。每濃度放入直徑為6 mm的SDG-1菌餅，置于（27±1） ℃、120 r/min的恒溫搖床振蕩培養，每處理重復3次，分別于接菌后24、48、72、120 h用抽濾器分別收集菌絲體和培養液，在電子天平上稱量并記錄菌絲體的質量。

1.2.3 抑菌機理研究

1）細胞膜透性測定。參考王桂清等［14］的方法，通過測定電導率來考察揮發油對菌絲體細胞膜透性的影響。取直徑為6 mm的SDG-1菌餅放入150 mL PDB培養液中，置于（27±1） ℃、120 r/min的恒溫搖床振蕩培養5 d，用滅菌水充分洗凈后抽濾，收集菌絲體備用；取少量Tween-80、無菌水將揮發油配制成質量濃度為1 000 mg/L的溶液備用。

取揮發油溶液80 mL、菌絲體2 g，充分混合后置于（27±1） ℃、120 r/min的恒溫搖床振蕩培養，分別于培養12、24、48、72 h取出，用抽濾器將菌絲體和培養液分離。用電導率儀（DDS-307A型，儀電科學儀器股份有限公司）測定培養液的電導率。以加等量Tween-80、無菌水及菌絲體為對照，每處理重復3次。

2）生理指標的測定。取滅菌的錐形瓶，加入適量Tween-80和PDB培養液，配制草珊瑚質量濃度為2 000 mg/L的含藥培養基，加入直徑為6 mm的SDG-1菌餅，置于（27±1） ℃、120 r/min的恒溫搖床振蕩培養。以等量的Tween-80、無菌水，并加入等量的菌餅共培養作為對照。每處理重復3次。分別于培養12、24、48、60、72、96、120 h后用抽濾器將菌絲體和培養液分離。采用考馬斯亮藍-G250染色法，測定可溶性蛋白質含量；采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量；采用硫代巴比妥酸法測定菌絲體中丙二醛（MDA）含量。

1.2.4 數據分析

采用SPSS 22.0統計軟件對所有數據進行ANOVA方差分析、Duncan’s多重比較，評價處理間的差異顯著性和重復間的離散度。

2 結果與分析

2.1 草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌菌絲生長的影響

2.1.1 固體培養基抑菌試驗

越南槐圓斑病病原菌SDG-1在含有草珊瑚揮發油的固體培養基中菌落明顯小于對照，不僅生長受到抑制，而且觀察到菌絲稀疏、顏色灰白（圖1A）；而對照菌落菌絲密實，顏色灰綠，且布滿黑色子實體（圖1B）。

不同質量濃度的草珊瑚揮發油溶液對SDG-1菌落的擴展有不同程度的抑制作用（表1）。在相同培養時間內，菌落擴展抑制率隨著揮發油質量濃度升高而遞增。5個質量濃度的含藥培養基均表現為在24～72 h抑制率隨著時間的延長而升高，120 h后抑制率降低，分析原因可能是揮發油中的抑菌物質易揮發，隨著培養時間的延長有效成分含量緩慢減少導致。

草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌抑菌活性較為顯著，EC50為271.00 mg/L，毒力回歸方程為y=1.979 2x+0.184 8，相關系數為0.996 5，95%置信區間為242.67～302.63 mg/L。

2.1.2 液體培養基抑菌試驗

SDG-1在含揮發油的液體培養基中，溶液渾濁、黑色，菌絲量顯著少于對照，菌絲顏色變黑且不成團（圖2A）；而對照溶液清澈，菌絲呈黃白色，聚合成數個黃乳白色小圓球（圖2B）。分析原因可能是揮發油在液體培養基中與菌絲體產生某種生理生化反應而引起的溶液顏色變化。

與固體培養結果相似，在相同培養時間內，菌絲體生長抑制率隨著揮發油質量濃度升高而遞增，各質量濃度含藥培養基的抑制率也隨著培養時間的推移整體呈先升高后下降的趨勢（表2）。

2.2 草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌菌絲體細胞膜透性的影響

草珊瑚揮發油處理病原菌菌絲體后電導率升高，且揮發油溶液濃度越高、作用時間越長，電導率越大（表3）。揮發油質量濃度為2 000 mg/L和1 000 mg/L，處理72 h后，電導率分別為對照的1.54、1.47倍，為差異較大兩組處理。表明草珊瑚揮發油處理后病原菌菌絲體電導率升高，即細胞膜透性增大，且隨著處理濃度的增加及作用時間的延長，菌絲體細胞膜透性變化增大。

2.3 草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌生理代謝的影響

2.3.1 草珊瑚揮發油對培養液中可溶性蛋白質含量的影響

如圖3所示，質量濃度為2 000 mg/L的草珊瑚揮發油溶液處理越南槐圓斑病病原菌菌絲，作用時間為12、24、36、48、60、72 h時，處理培養液中可溶性蛋白質含量分別為2.07、2.98、3.26、5.26、6.32、8.95 μg/mL，對照培養液中可溶性蛋白質含量分別為1.48、1.48、1.56、1.56、1.80、1.89 μg/mL，處理顯著高于對照。隨著作用時間的延長，處理可溶性蛋白質含量升高，而對照中可溶性蛋白質含量變化不大。由此初步推測，草珊瑚揮發油能引起菌絲體內原生質外滲，處理72 h后，可溶性蛋白質含量達到最大值，是對照的4.74倍。

2.3.2 草珊瑚揮發油對菌絲體中丙二醛（MDA）含量的影響

如圖4所示，處理MDA含量極顯著高于對照，處理MDA含量在24 h后顯著升高，在96 h時MDA含量為6.23 nmol/mg，達到峰值，是對照的3.11倍，隨后有所下降。對照MDA含量基本沒有變化。菌絲體細胞膜受損后可以引起脂質過氧化反應，MDA是脂質過氧化的最終產物，MDA含量是衡量脂質過氧化反應的重要指標［10，11］。結果（圖4）表明，在草珊瑚揮發油的作用下，越南槐圓斑病病原菌菌絲體的細胞膜被破壞，MDA含量極顯著高于對照。

2.4 草珊瑚揮發油對菌絲吸收營養物質的影響

由圖5可以看出，草珊瑚揮發油處理12、24、36、48、72 h，培養液中還原糖含量分別為11.50、10.70、10.10、9.80、9.52、9.07 mg/mL，總體維持在較高的水平；而對照還原糖含量隨作用時間的延長而逐漸降低，72 h還原糖含量降低至4.32 mg/mL，與處理相比，降低了52.37%。還原糖包括葡萄糖、麥芽糖、果糖、半乳糖等，是微生物正常生長的重要營養因子。表明草珊瑚揮發油處理越南槐圓斑病病原菌菌絲后，菌絲體對還原糖的吸收受到抑制，分析原因可能是基于菌絲體細胞膜受損，而導致菌絲體對外界營養物質吸收受阻。

3 小結與討論

中藥材遼細辛、土荊芥、茅蒼術、香茅、草果等揮發油（精油）對黃瓜灰霉病菌、灰葡萄孢菌、交鏈孢菌、番茄早疫病菌、瓜果腐霉、尖鐮孢菌等植物病原真菌均有良好的抑制活性［14-18］。本研究以越南槐圓斑病病原菌為靶標，利用草珊瑚揮發油對該病原真菌進行抑菌活性研究，發現質量濃度為2 000 mg/L的草珊瑚揮發油溶液對病原菌菌絲的生長具有極強的抑制活性，其菌落直徑基本不擴張、菌絲質量基本不增加。草珊瑚揮發油對越南槐圓斑病病原菌的抑制中濃度為271.00 mg/L，抑菌活性較為顯著，在該病害的生物防治領域具有較大的應用潛力。但是，草珊瑚揮發油對其他病原真菌的抑制活性有待進一步研究。

在揮發油（精油）對植物病原菌的抑菌機制研究方面，主要集中在對病原菌菌絲細胞膜的影響方面。細胞膜是保護微生物正常生理代謝的生物屏障，一旦遭到破壞，內部電解質（如K+、Na+ ）大量滲入至培養液，導致培養液電導率上升［6］。劉耀華等［18］、王春梅等［19］的研究報道，香茅精油可破壞番茄早疫病病原菌細胞膜，一方面引起細胞膜透性改變，細胞內的原生質外滲，從而引起電導率的增加，同時膜受損后可引起脂質過氧化反應，反應產物MDA含量隨著作用時間的延長呈線性增加；陳利軍等［15］在研究土荊芥揮發油抑制灰葡萄孢菌的機理時發現，病原菌孢外蛋白質含量增大，認為主要是揮發油破壞了菌絲體的細胞膜，導致細胞內含物、核酸類物質、蛋白質等外滲到培養液中；黃曉霞等［20］的研究發現山蒼子精油能夠破壞黃曲霉細胞膜，改變膜的通透性，導致細胞對營養物質的利用率下降，引起細胞死亡。本研究與上述研究結果相似，表明草珊瑚揮發油能破壞越南槐圓斑病病原菌細胞膜，從而引起相關生理生化指標的變化。

在今后的研究中可應用掃描電鏡或透視電鏡進一步觀察、驗證草珊瑚揮發油對菌體細胞壁、細胞膜等組織結構完整性的影響。此外，還可以通過轉錄組測序、代謝組測序等分子生物學技術研究揮發油對菌絲體DNA和RNA的生物合作、代謝的影響。同時，還應進一步明確草珊瑚揮發油中的抑菌物質成分，為精油類農藥的開發奠定理論基礎。本研究不僅對開發植物源殺菌劑防治病害發生、保護生態平衡、保障中藥材質量安全具有重要意義，也可為拓寬草珊瑚揮發油的應用途徑提供參考。

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收稿日期：2024-05-23

基金項目：肉桂等廣西特色藥材高質量生產關鍵技術及系列產品開發研究項目（桂科AA22096021）；廣西中醫藥多學科交叉創新團隊項目（GZKJ2305）；廣西道地藥材高品質形成與應用重點實驗室項目（ZJC2020003）

作者簡介：丘卓秋（1992-），女，廣西貴港人，工程師，碩士，主要從事藥用植物保護研究，（電子信箱）1562159766@qq.com；通信作者，李林軒，正高級工程師，碩士，主要從事藥用植物栽培研究，（電子信箱）lilinxuan1125@163.com；詹鑫婕，工程師，碩士，主要從事藥用植物病蟲害防治研究，（電話）18878730996（電子信箱）554504719@qq.com。