石仙桃內生真菌的分離及抑菌活性菌株的篩選與鑒定

摘要：從傳統藥用植物石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）中，分離對致病細菌具有抑菌作用的內生真菌菌株，研究菌株的抗菌活性。采用組織塊法分離石仙桃內生真菌，采用紙片法進行抑菌試驗，篩選出有抑菌活性的菌株；根據其形態特征，篩選有抑菌活性的菌株，并進行DNA提取和鑒定。結果表明，從石仙桃根、根莖、葉和假鱗莖中分離得到49株內生真菌，其中，廣西河池市石仙桃分離出37株內生真菌，福建省漳州市石仙桃分離出12株內生真菌，從葉部組織中分離到的廣西河池市石仙桃內生真菌HCY-5、HCY-9、HCY-10菌株和福建省漳州市石仙桃內生真菌FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7菌株對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表現出較好的抑菌活性，結合形態特征，將測得內生真菌菌株基因序列導入GenBank，經過比對，鑒定廣西河池市石仙桃內生真菌HCY-5、HCY-9、HCY-10菌株和福建省漳州市石仙桃內生真菌FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7菌株為Phyllosticta（葉點霉屬），推測為Phyllosticta capitalensis（意大利果殼葉點霉）。廣西河池市石仙桃內生真菌HCY-5、HCY-9、HCY-10和福建省漳州市石仙桃內生真菌FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7菌株具有較好的抑菌活性。

關鍵詞：石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）； 內生真菌； 抑菌活性； 篩選； 鑒定

中圖分類號：R284.2；S567.23+9" " " " "文獻標識碼：A" " " " "文章編號：0439-8114（2025）02-0112-09

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.018 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Endophytic fungi strains with antifungal activity against pathogenic bacterial were isolated from the traditional medicinal plant Pholidota chinensis， and the antifungal activity of the strains was studied. Endophytic fungi of Pholidota chinensis were isolated by tissue block method and fungal inhibition test was carried out by paper method， and the strains with antibacterial activity were screened out. According to their morphological characteristics， the active strains with antibacterial activity were screened for DNA extraction and identification. The results showed that 49 endophytic fungi were isolated from the roots， rhizomes， leaves and pseudobulb of Pholidota chinensis， including 37 endophytic fungi from Hechi City， Guangxi and 12 endophytic fungi from Zhangzhou City， Fujian Province. Endophytic fungi HCY-5， HCY-9， HCY-10 isolated from the leaf tissues of Pholidota chinensis in Hechi City， Guangxi Province， and endophytic fungi FJY-2， FJY-5， FJY-6， FJY-7 isolated from Pholidota chinensis in Zhangzhou City， Fujian Province， showed good antibacterial activity against Staphylococcus aureus. Combined with morphological characteristics， the gene sequences of endophytic fungi strains were introduced into GenBank， and after comparison， the endophytic fungi HCY-5， HCY-9， HCY-10 in Hechi City， Guangxi and FJY-2， FJY-5， FJY-6， FJY-7 in Zhangzhou City， Fujian Province were identified as Pholiosticta， which was supposed to be Pholiosticta capitalensis. Endophytic fungi HCY-5， HCY-9， HCY-10 from Hechi City， Guangxi and endophytic fungi FJY-2， FJY-5， FJY-6 and FJY-7 from Zhangzhou City， Fujian Province had good antibacterial activity.

藥材石仙桃又稱石上蓮、石橄欖、石穿盤、果上葉等，為蘭科石仙桃屬植物石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）的假鱗莖或全草。它始載于《生草藥性備要》，味甘微苦，性涼，歸肺腎經，有養陰、清肺和清熱解毒等作用；現代臨床治療肺熱咳嗽、肺結核咳血以及胃十二指腸潰瘍等［1］。石仙桃為中國南部、西南部等地區常用的傳統民族藥［2］。石仙桃屬植株全世界大約30種，遍布在熱帶亞洲至澳大利亞以及太平洋部分群島，在中國約有14種，原產于南部地區，尤以西南部較多見。石仙桃屬植物主要分布在中國的廣東、福建、廣西、云南以及貴州等地［3，4］。石仙桃屬植物成分多樣，主要有黃酮［5］、多糖［6］、酚類［7］、菲［8，9］、木脂素和甾體［10］等類化合物。藥理研究表明，石仙桃具有抗氧化［11］、抗炎［8］、抗菌［12］、提高免疫［13，14］以及抗腫瘤［15］等作用。

植物內生菌指生活在健康植物體內的部分或所有階段的微生物，包括內生細菌、真菌和放線菌。在植物中，它們不會引起植物有明顯的疾病和癥狀，并與植物宿主建立了和諧的共生關系［16］。為緩解瀕危植物和稀有植物資源的可繼續發展，擴大天然藥物資源，研究者已經開始尋找植物內生菌與植物寄主相同或類似的天然化學成分。現代科學研究表明，內生菌的次生代謝產物在植物中可以形成許多生物活性物質，它們具有抑菌、抗氧化和抗腫瘤［17-19］等功能，在新型藥品篩選、生物防治領域具有相當大的應用前景，現已成為國內外的研究熱點。本研究以藥用植物石仙桃為研究對象，從廣西河池市和福建省漳州市的石仙桃根、根莖、葉和假鱗莖分離出內生真菌，為了更深入了解石仙桃的生物活性，對石仙桃分離出的內生真菌進行了抑菌活性測定，運用生物發酵技術進行液體發酵培養，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌為指示菌，采用紙片法篩選出具有抑菌作用的內生真菌菌株，經過初篩和復篩，篩選出對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用的菌株。由于對天然產物中抗菌活性成分研究的廣泛關注，而通過人工標準化栽培石仙桃工藝尚未成熟，市場上出現的石仙桃屬植物多來自野外資源，一旦無規劃、盲目采挖，將嚴重破壞其自然資源，珍稀物種也將會處于逐漸瀕危或消亡。本研究對石仙桃植物內生菌理化性質和形態結構進行分析，以期為指導石仙桃次生代謝產物研究和替代品開發提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

選取新鮮無黃葉、病斑、斑點和腐爛的石仙桃整體植株，采自廣西河池市和福建省漳州市，經廣西中醫藥大學朱意麟高級園藝師鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃全草。試驗所用材料、儀器如表1和表2所示。

1.2 方法

1.2.1 培養基制備

1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。取新鮮的馬鈴薯，去皮后切成塊，稱取200 g放入容器中，加入1 000 mL滅菌水。煮沸后計時煮15～30 min，用3層紗布過濾，去掉濾渣取濾液。馬鈴薯汁煮至微沸后，加入葡萄糖20 g、瓊脂15 g充分攪拌溶解后，再加滅菌水定容至1 000 mL，自然pH下，煮沸，隨后分裝到容器中，包扎，于121 ℃滅菌30 min后取出放冷，凝固。

2）營養肉湯瓊脂培養基（NB）。稱取牛肉膏" " "5 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蛋白胨10 g放入容器中，加入1 000 mL滅菌水。攪拌，煮沸溶解后，加滅菌水定容至1 000 mL，pH 7.4～7.6，分裝到容器中，包扎，于121 ℃滅菌30 min后取出放冷凝固。

1.2.2 石仙桃外植體處理

將石仙桃外植體表面消毒。選取生長健康的石仙桃植株，用刀將根、根莖、葉、假鱗莖各部位切取下來，用流動自來水沖洗表面泥沙，用洗衣粉水浸泡輕微搓洗各部位表面，再用自來水沖洗干凈，接著用滅菌水再沖洗，用濾紙吸去各部位表面水分，用剪刀剪去多余部分，剩余部分放至容器中，噴上乙醇溶液。轉移到超凈工作臺，用滅菌水漂洗→75%乙醇溶液消毒→滅菌水漂洗→5%次氯酸鈉溶液滅菌→滅菌水漂洗→滅菌水沖洗5次→用滅菌濾紙吸干水分。各部位消毒處理操作步驟相同。石仙桃不同部位外植體的消毒時間如表3所示。

1.2.3 內生真菌的分離

石仙桃內生真菌采用組織塊法分離。用滅過菌的刀片將已滅菌的石仙桃根、根莖和假鱗莖切去外部表皮后橫切為5 mm的小塊，葉切為5 mm的小片，用已滅過菌的鑷子依次將根、根莖和假鱗莖的靠內側切面與葉片貼向培養基接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，每個培養皿中放入3～5個組織塊，將放入組織塊的培養基移入到28 ℃的恒溫培養箱中，培養3～6 d。為了確定組織塊表面消毒是否完全，取少量沖洗過組織塊的洗滌液涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，并在相同條件下培養作為對照。

1.2.4 內生真菌的純化

待接種組織塊與培養基接種表面或邊緣有菌落長出時，挑取位置、大小和形態等不同的單菌落，用平行劃線法接入到新的培養基，于28 ℃繼續培養，待長出新菌落后，根據菌落顏色與形態差異，再次挑取菌落進行純化，如此反復純化直到純化至單個菌株。

1.2.5 抑菌活性內生真菌的初篩

采用紙片法篩選抑菌活性內生真菌。將內生真菌接種到裝有150 mL已滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，通過搖瓶振蕩培養7 d后，獲得內生真菌發酵液。將供試病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白色念珠菌）接種至倒有營養肉湯瓊脂（NB）培養皿培養，后將其制成菌懸液或發酵液，取100 μL菌懸液或發酵液涂布在PDA平板上，制成含菌平板。用已滅菌的鑷子將濾紙片浸入到內生真菌發酵液中，取出紙片置于已接種供試病原菌的平板上，每個處理1次重復，以滅菌水代替內生真菌發酵液作為對照，于28 ℃培養48～72 h后，觀察有無抑菌圈。

1.2.6 抑菌活性內生真菌的復篩

將初篩有抑菌效果的菌株再用相同的方法復篩1次，每個處理3次重復。于28 ℃培養48～72 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈大小，計算抑菌帶寬度。抑菌帶寬度=（抑菌圈直徑-測量菌直徑）/2。

1.2.7 抑菌活性菌株DNA分子鑒定

取20 mg菌絲，用液氮研磨成粉末，置于2 mL離心管中。加入400 μL Buffer Digestion和4 μL β-巰基乙醇，振蕩混勻，在65 ℃水浴1 h至細胞完全裂解。加入200 μL Buffer PF，充分顛倒混勻，于-20 ℃冰箱放置5 min。取出，于10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液500 μL轉移到2 mL離心管中。加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫下放置2～3 min。于10 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清液。加入1 mL 75%乙醇溶液，顛倒漂洗1～3 min，10 000 r/min離心2 min，棄去上清液，如此重復1次。開蓋，室溫下放置至殘留的乙醇完全揮發，得到的DNA用50～100 μL TE Buffer溶解即得。將提取的真菌DNA產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離結果

石仙桃不同部位內生菌種類和數量有差異，廣西河池市石仙桃根和葉中分離出的內生菌種類較為豐富，根莖最少，假鱗莖未分離出內生菌。福建省漳州市石仙桃的根和葉中分離出了內生菌，根莖及假鱗莖中未分離出內生菌。定殖率=分離出菌株的組織塊數/總組織塊數。分離率=每組組織塊中分離出的菌株數/總分離出的菌株數。廣西河池市、福建省漳州市石仙桃內生真菌的定殖率和分離率分別見表4和表5。

由表4可以看出，廣西河池市石仙桃內生真菌在根、根莖和葉中的定殖率分別為25.00%、5.26%和41.67%，分離率分別為40.54%、2.70%和56.76%，假鱗莖中的定殖率和分離率均為0。由表5可以看出，福建省漳州市石仙桃內生真菌在根、葉中的定殖率分別為25.00%、15.00%，分離率分別為41.67%和58.33%，而根莖和假鱗莖中的定殖率和分離率均為0。

2.2 石仙桃內生真菌純化結果

從2個產地的石仙桃中共分離純化49株內生菌，分布情況和菌株編號見表6和表7。如圖1和圖2所示，從廣西河池市石仙桃中分離出37株內生真菌，其中，從葉中分離出21株，以HCY-1、HCY-2……HCY-n編號，菌落外觀為灰白色、灰褐色、乳白色、黑褐色，形狀呈圓形、云朵狀、不規則形；從根中分離出15株，以HCG-1、HCG-2……HCG-n編號，菌落外觀為乳白色、灰白色、灰褐色，形狀呈圓形；從根莖中分離出1株，以HCGJ-1編號，菌落外觀灰黃色，形狀為不規則形。從福建省漳州市石仙桃中分離出12株內生真菌，其中，從葉中分離出7株，以FJY-1、FJY-2……FJY-n編號，菌落外觀灰褐色、黑褐色，呈圓形、不規則形；從根中分離出5株，以FJG-1、FJG-2……FJG-n編號，菌落外觀為灰白色、灰褐色，呈圓形。

2.3 石仙桃抑菌活性內生真菌的篩選結果

2.3.1 石仙桃抑菌活性內生真菌的初篩

利用紙片法對從廣西河池市和福建省漳州市分離得到的內生真菌進行拮抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、白色念珠菌抑菌活性的篩選。由表8和表9可知，共篩選出7株內生真菌的發酵液紙片周圍有抑菌圈出現，分別為廣西河池市的HCY-5、HCY-9、HCY-10菌株和福建省漳州市的FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7菌株對金黃色葡萄球菌表現出抑菌性。

2.3.2 石仙桃抑菌活性內生真菌的復篩

將初步篩選出對金黃色葡萄球菌有抑菌作用的7株菌株用紙片法再進行復篩1次，復篩結果顯示，7株菌株對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用。對比圖3、圖4與滅菌水濾紙片空白對照菌株可以看出，HCY-5、HCY-9、HCY-10、FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7濾紙片周圍有抑菌圈出現，對金黃色葡萄球菌有抑菌作用。由表10和表11可知，抑菌帶寬度分別為0.28、0.36、0.31、0.33、0.25、0.21、0.23 cm。

2.4 石仙桃抑菌活性菌株DNA分子鑒定

利用通用引物ITS1、ITS4擴增出待檢菌基因序列為18S rRNA片段、ITS1、5.8S rDNA、ITS2的全序列28S區序列片段，序列如下：ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG內轉錄間隔區1和2 600 bp左右；ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC內轉錄間隔區1和2 600 bp左右。

將測得內生菌菌株基因序列導入GenBank，經過比對（表12、表13），內生菌菌株HCY-5、HCY-9、HCY-10、FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7與葉點霉菌株基因序列相似度分別達100.00%、99.81%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、99.63%。因此，7株菌株被鑒定為Phyllosticta（葉點霉屬），推測為Phyllosticta capitalensis（意大利果殼葉點霉）。

3 小結與討論

本研究從分離出的49株內生真菌中，篩選出7株對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用的菌株，分別是HCY-5、HCY-9、HCY-10、FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7菌株，抑菌圈直徑分別為1.17、1.31、1.22、1.25、1.10、1.03、1.05 cm。這表明石仙桃中內生真菌的分布比較豐富，有抗菌活性的菌株比例相對較高，且內生菌在石仙桃中分布存在差異，具有抑菌作用的菌株主要分布在葉中，未分離出內生菌的組織部位可能是由于內生菌對宿主的選擇性及適應性或外植體消毒時間不同所導致。從石仙桃分離到的內生真菌中，未篩選出對大腸埃希氏菌和白色念珠菌有抑菌活性的菌株。在篩選出具有抑菌作用的菌株中，進行DNA提取，將測得的內生菌菌株基因序列導入GenBank，經過比對，內生菌菌株HCY-5、HCY-9、HCY-10、FJY-2、FJY-5、FJY-6、FJY-7與基因序列葉點霉相似度分別達100.00%、99.81%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%和99.63%。因此，鑒定7株菌株為Phyllosticta（葉點霉屬），推測為Phyllosticta capitalensis（意大利果殼葉點霉）。

近年來，關于內生菌對植物致病菌抑制作用方面的研究較多。寄生于植物體內的內生菌會在植物內部建立共同進化和互利的關系［20，21］，對于藥用植物而言，內生菌對植物的影響體現在3個方面，第一可以通過分泌生長素來促進植物的生長，第二是參與植物中活性成分的代謝過程，對藥用植物中活性成分的積累有一定的影響，第三通過抑制寄生在植物體內的致病菌，從而避免致病菌感染和病蟲害的產生。由于大部分植物病原菌都是真菌，內生細菌一般通過分泌抗菌物質來抑制植物病原菌，而內生真菌對植物致病菌的抑制作用除了產生某些抗菌化合物之外，主要通過占有生存空間、營養競爭以及溶解菌絲來實現對致病菌的對抗效果。Si等［22］從石柑子中分離到脂肪酸化合物，通過抑菌活性分析，發現其對金黃色葡萄球菌有中等抑制作用；Ti等［9］從石仙桃中分離到菲類化合物，對其進行抗菌活性分析，發現對金黃色葡萄球菌的MIC50（50%最低抑菌濃度）為68.39 μmol/L，并推測菲類成分可能是其抗菌的活性成分。與石仙桃菲類成分抑制金黃色葡萄球菌活性相比，本研究利用紙片法對分離得到的內生真菌進行分析，發現其對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，說明石仙桃內生真菌有一定的抑菌效果，推測石仙桃可能在細菌相關傳染病的治療中發揮作用，對石仙桃內生真菌抑菌作用的具體抗菌機理仍有待進一步研究。內生真菌可為篩選出石仙桃具有藥用價值的活性物質或新型化合物提供新的思路，期望其能促進石仙桃有價值產物的開發和利用。

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收稿日期：2024-06-20

基金項目：2024年度廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2024KY0310）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD21238031）；廣西藥監局藥品安全科研計劃項目（桂藥監科直屬［2023］035號）；廣西中醫藥重點學科壯藥學項目（GZXK-Z-20-64）；廣西一流學科中藥學（民族藥學）項目（桂教科研［2018］12號）；廣西科協“提質增效”項目

作者簡介：朱 華（1957-），男，廣西南寧人，教授，博士，主要從事中藥及民族藥的研究與開發工作，（電話）18977165885（電子信箱）zhuhuagx@163.com；通信作者，張 淼（1991-），女，山西臨汾人，助理研究員，博士，主要從事中藥及壯瑤藥的品種鑒定與開發研究，（電話）18169648756（電子信箱）676407465@qq.com；施曉光（1981-），男，副主任藥師，碩士，主要從事壯瑤藥物質基礎與質量控制研究，（電話）18077798392（電子信箱）shixiaoguang2007@126.com。