基于糖基功能化磁性納米顆粒材料富集-熒光法快速檢測(cè)包裝飲用水中銅綠假單胞菌

摘要：基于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）對(duì)糖基功能化磁性納米顆粒材料特異性識(shí)別和銅綠假單胞菌分泌明膠酶的特點(diǎn)，誘導(dǎo)負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜上FITC的釋放，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定功能化納米纖維膜的熒光強(qiáng)度，建立包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)方法。該方法采用糖基功能化磁性納米顆粒材料富集銅綠假單胞菌，250 mL飲用水中糖基功能化磁性納米顆粒材料的添加量為5.00 mg，糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為6 h，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為30 min，檢驗(yàn)時(shí)間小于8 h，方法檢出限為0.004 CFU/mL，特異性強(qiáng)。相較于GB 8538—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》中的檢測(cè)方法，該方法縮短了檢測(cè)時(shí)間，且檢出限能夠滿足監(jiān)管需要，可作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；糖基功能化；磁性納米顆粒材料；富集；熒光；快速檢測(cè)；包裝飲用水

中圖分類號(hào)：TS207.3" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " "文章編號(hào)：0439-8114（2025）02-0171-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.027 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Based on the specific recognition of glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials by Pseudomonas aeruginosa and the secretion of gelatinase by Pseudomonas aeruginosa， the release of FITC was induced from load GNP@FITC functionalized nanofiber membrane. The fluorescence intensity of functionalized nanofiber membrane was measured using a fluorescence spectrophotometer to establish a rapid detection method for Pseudomonas aeruginosa in packaged drinking water. This method used glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials to enrich Pseudomonas aeruginosa. The amount of glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials added to 250 mL of drinking water was 5.00 mg， and the optimal co culture time between glycosylation functionalized magnetic nanoparticle materials and Pseudomonas aeruginosa was 6 hours. The optimal co-culture time between load GNP@FITC functionalized nanofiber membrane and Pseudomonas aeruginosa was 30 minutes， with a test time of less than 8 hours. The detection limit of the method was 0.004 CFU/mL， indicating strong specificity. Compared with the testing method in GB 8538—2022 ‘National Food Safety Standard for Drinking Natural Mineral Water Inspection Method’， this method shortened the testing time and the detection limit could meet regulatory needs， making it a useful supplement to traditional testing methods.

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是常見(jiàn)的水源性和食源性革蘭氏陰性條件致病菌［1-3］，對(duì)紫外線、消毒劑等具有較強(qiáng)的抵抗力［4-6］，嚴(yán)重危害人類的健康［7-10］。隨著人們生活節(jié)奏的加快，包裝飲用水因其方便快捷的特點(diǎn)成為中國(guó)發(fā)展最快的食品產(chǎn)業(yè)之一［11］，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢出的報(bào)道層出不窮［12-16］。因此，急需加強(qiáng)監(jiān)管力度來(lái)保障居民包裝飲用水的安全性，快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)管的重要手段。

目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)主要參照GB 8538—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》，根據(jù)單菌落的數(shù)量計(jì)數(shù)。該方法成熟、準(zhǔn)確，但過(guò)程繁瑣且周期長(zhǎng)，這不僅會(huì)加重食品行業(yè)的倉(cāng)儲(chǔ)成本，而且難以適應(yīng)重大活動(dòng)中食品安全保障的時(shí)效性要求。馮秀娟等［17］建立核酸等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增熒光法檢測(cè)包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)方法，該方法具有良好的重復(fù)性，特異性較強(qiáng)，用時(shí)縮短至18 h，方法檢測(cè)限為103 CFU/mL。有學(xué)者基于適配體的生物傳感器技術(shù)檢測(cè)銅綠假單胞菌，其最低檢出限可達(dá)50 CFU/mL［18，19］，王芳妹等［20］針對(duì)銅綠假單胞菌pcrL和16S rRNA基因的V3～V4區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立銅綠假單胞菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，該方法特異性好、靈敏度高，檢出限可達(dá)10 CFU/mL。劉輝等［21］建立重組酶聚合酶擴(kuò)增法檢測(cè)瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌的分析方法，該方法能特異、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)銅綠假單胞菌，對(duì)人工污染的水樣最低檢出限為36 CFU/mL，且重復(fù)性好。龍慧等［22］根據(jù)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中uidA和gyrB基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系，同時(shí)檢測(cè)桶裝水中的大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌，該方法檢測(cè)周期短、靈敏度高，大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌的檢測(cè)限均為102 CFU/mL。上述研究方法雖然在檢測(cè)時(shí)效上相較于傳統(tǒng)方法有了較大提升，但是方法檢出限均無(wú)法滿足現(xiàn)行監(jiān)管需求，因GB 19298—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》規(guī)定包裝飲用水中不得檢出銅綠假單胞菌（銅綠假單胞菌濃度小于0.004 CFU/mL，視為未檢出），對(duì)于低含量銅綠假單胞菌污染的包裝飲用水，采用上述方法存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)，因此建立包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速、靈敏、滿足監(jiān)管需要的檢測(cè)方法極為重要。

細(xì)菌的凝集素（碳水化合物結(jié)合蛋白）與宿主組織上的聚糖特異性相互作用。銅綠假單胞菌的LecA是特異性靶向半乳糖的凝集素，可以促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)化至細(xì)胞［23］。銅綠假單胞菌的LecB可以強(qiáng)烈結(jié)合巖藻糖和含巖藻糖的寡糖，有助于細(xì)菌粘附到氣道上皮細(xì)胞［24］。在體外和體內(nèi)研究中，銅綠假單胞菌的生物膜形成被LecA和LecB抑制［25］。本研究基于銅綠假單胞菌對(duì)半乳糖和巖藻糖及其衍生物的特異性識(shí)別［26］，實(shí)現(xiàn)雙糖磁性納米粒子對(duì)銅綠假單胞菌的特異性富集吸附，同時(shí)利用銅綠假單胞菌代謝明膠酶的特征，誘導(dǎo)負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜上FITC（異硫氰酸熒光素）的釋放，通過(guò)功能化納米纖維膜熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MS7-H550-Pro型磁力攪拌器（武漢科爾儀器設(shè)備有限公司）；TENSOR 27型傅里葉變換紅外光譜儀（濟(jì)南上地電子科技有限公司）；GeminiSEM 300型發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）；LakeShore7404型磁滯回線（天津研塔科技有限公司）；TG209F1型熱重分析儀［耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)（上海）有限公司］；F97pro型熒光分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；DSA30S型接觸角測(cè)量?jī)x（德國(guó)克呂士公司）；ZEN3600型馬爾文激光粒度儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；UV-2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）和大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 25922）購(gòu)自南京樂(lè)珍生物科技有限公司；糞鏈球菌（Streptococcus faecalis BNCC337174）和產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens BNCC317723）購(gòu)自ATCC美國(guó)菌種保藏中心；明膠（藥用級(jí)，膠強(qiáng)度約240 g Bloom）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；戊二醛水溶液（20%）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖基功能化磁性納米顆粒、負(fù)載異硫氰酸熒光素包裹的明膠納米粒子（GNP@FITC）功能化納米纖維膜均由武漢紡織大學(xué)提供。

1.2 包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)

稱取5 mg糖基功能化磁性納米顆粒置于250 mL包裝飲用水中，于160 r/min的搖床中，37 ℃條件下振蕩30 min，用磁鐵將糖基功能化磁性納米顆粒材料吸附至底部，倒掉上層菌液，然后加入20 mL液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)6 h。將負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜置于培養(yǎng)基中，30 min后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定納米纖維膜熒光強(qiáng)度，如圖1所示。通過(guò)I與I0的比值（I/I0）是否小于0.7來(lái)確定該包裝飲用水中是否含有銅綠假單胞菌（I為培養(yǎng)30 min后負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜的熒光強(qiáng)度，I0為培養(yǎng)0 min時(shí)負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜的熒光強(qiáng)度）。

1.3 條件試驗(yàn)方法

每250 mL體系中糖基功能化磁性納米顆粒材料添加量為0.05、0.50、5.00 mg，糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)間為0、2、4、6、8、10 h，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜與吸附細(xì)菌共培養(yǎng)時(shí)間為0、15、30、60 min，分析得出最優(yōu)試驗(yàn)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基功能化磁性納米顆粒的表征

基于銅綠假單胞菌對(duì)半乳糖和巖藻糖及其衍生物具有特異性識(shí)別的特點(diǎn)［26］，在磁性四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒表面接枝半乳糖和巖藻糖單體，實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的特異性識(shí)別。圖2a為糖基功能化磁性納米顆粒材料的FTIR光譜。糖基功能化磁性納米顆粒材料的Si—O—Si伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 098 cm-1處，表明裸露的Fe3O4表面成功包裹了二氧化硅；糖基功能化磁性納米顆粒材料的N—C=O伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 655 cm-1處；糖單體的—COOR伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 727 cm-1處，表明半乳糖和巖藻糖單體成功接枝到糖基功能化磁性納米顆粒材料上。圖2b為糖基功能化磁性納米顆粒材料質(zhì)量損失隨溫度變化的曲線。在溫度低于100 ℃時(shí)質(zhì)量損失主要?dú)w結(jié)于物理吸附水的蒸發(fā)，在溫度250 ℃～450 ℃時(shí)質(zhì)量損失主要?dú)w結(jié)于二氧化硅和有機(jī)物的分解，在溫度大于450 ℃時(shí)質(zhì)量損失主要?dú)w結(jié)于硅與氮?dú)庠诟邷叵掳l(fā)生反應(yīng)，生成氮化硅和Si3N4。圖2c顯示了在27 ℃下糖基功能化磁性納米顆粒材料磁化強(qiáng)度的磁場(chǎng)依賴性，在27 ℃下沒(méi)有觀察到滯后行為，這表明該糖基功能化磁性納米顆粒材料的超順磁性，對(duì)捕獲細(xì)菌后進(jìn)行磁分離提供了可能性。糖基功能化磁性納米顆粒材料均為球形（圖2d），直徑約為245 nm，具有高比表面積的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜的測(cè)試表征

以高比表面積的納米纖維膜為基材［27］，將GNP@FITC吸附到納米纖維膜上，得到負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜。由于銅綠假單胞菌能分泌明膠酶［28］，因此能分解納米纖維膜表面的明膠粒子，釋放FITC，膜表面熒光強(qiáng)度減弱，實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)。如圖3所示，GNP@FITC的粒徑大約為526 nm，分散性系數(shù)PDI為0.067，說(shuō)明GNP@FITC具有良好的穩(wěn)定性；GNP@FITC在溶液中電位約為-16.5 mV，具有較高的電負(fù)性，使得明膠納米粒子在溶液中更加穩(wěn)定。如圖4所示，納米纖維膜上負(fù)載的GNP@FITC均勻平整，明膠粒子緊密堆積，增加了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。如圖5所示，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜與空白納米纖維膜相比，納米纖維膜負(fù)載GNP@FITC后，在2 917 cm-1處C—H的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰減弱，同時(shí)出現(xiàn)了2組新的吸收峰，分別為1 631 cm-1處酰胺I帶的C=O伸縮振動(dòng)和1 534 cm-1處酰胺II帶的C=O伸縮振動(dòng)，表明GNP@FITC成功負(fù)載到納米纖維膜表面。如圖6所示，負(fù)載GNP@FITC后的納米纖維膜表面熒光顯著提高。如圖7所示，空白組納米纖維膜的接觸角為47°，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜的接觸角為73°，這表明在納米纖維膜上負(fù)載GNP@FITC后，膜表面的疏水性能會(huì)得到提高。

2.3 糖基功能化磁性納米顆粒材料添加量的確定

使用不同添加量的糖基功能化磁性納米顆粒材料對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行捕獲。糖基功能化磁性納米顆粒材料的添加量分別為0.05、0.50、5.00 mg時(shí)（圖8），捕獲銅綠假單胞菌的效率分別為5.1%、31.4%、81.7%（圖9）。隨著糖基功能化磁性納米顆粒材料添加量的增大，捕獲銅綠假單胞菌的效率也逐漸升高，添加量為5.00 mg時(shí)，捕獲效率最高，因此選擇添加5.00 mg糖基功能化磁性納米顆粒材料用以捕獲銅綠假單胞菌。

2.4 糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)間的確定

由圖10可知，隨著糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)間的增加，銅綠假單胞菌分泌明膠酶的量也增加，糖基功能化磁性納米顆粒材料上明膠納米粒子分解量增加，膜表面的熒光逐漸減弱。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為0～6 h時(shí)，銅綠假單胞菌生長(zhǎng)速度較快，分泌的明膠酶較多，因此糖基功能化磁性納米顆粒材料表面熒光強(qiáng)度下降的速度較快；當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為6～10 h時(shí)，銅綠假單胞菌生長(zhǎng)速度減弱，分泌的明膠酶減少，膜表面熒光強(qiáng)度下降速率減弱。糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為6 h。

2.5 負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)間的確定

由圖11可知，隨著負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)間的增加，膜表面GNP@FITC被分解的越多，膜表面熒光強(qiáng)度越弱。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為0～30 min時(shí)，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜表面的熒光強(qiáng)度下降較快；當(dāng)共培養(yǎng)30 min時(shí)，熒光強(qiáng)度比值降至0.70以下，30 min后膜表面的熒光強(qiáng)度下降速率減弱，可能是由于菌液中明膠酶對(duì)明膠的分解作用進(jìn)入滯遲期造成的。因此GNP@FITC功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為30 min。

2.6 方法特異性

銅綠假單胞菌是造成飲用水污染的主要細(xì)菌［29］，GB 19298—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》對(duì)包裝飲用水中銅綠假單胞菌和大腸桿菌" " "2種微生物做了限量要求，本研究基于實(shí)際情況對(duì)大腸桿菌、糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌3種微生物進(jìn)行特異性試驗(yàn)。由圖12可知，除大腸桿菌外，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜與不同細(xì)菌共培養(yǎng)后，其熒光強(qiáng)度比值均有所下降。與糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌共培養(yǎng)后，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜表面的熒光強(qiáng)度比值均超過(guò)0.70。與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜表面的熒光強(qiáng)度明顯降低。除銅綠假單胞菌外，其他微生物對(duì)功能化納米纖維膜上的GNP@FITC作用不明顯，因此該法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的特異性檢測(cè)。

2.7 銅綠假單胞菌的檢出限

GB 19298—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》規(guī)定包裝飲用水中不得檢出銅綠假單胞菌，對(duì)應(yīng)的檢驗(yàn)方法為GB 8538—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》，當(dāng)銅綠假單胞菌濃度小于0.004 CFU/mL時(shí)，即無(wú)法讀取，視為未檢出。將5.00 mg糖基功能化磁性納米顆粒材料加入250 mL不同銅綠假單胞菌濃度的飲用水中，并進(jìn)行共培養(yǎng)和檢測(cè)。由圖13可知，當(dāng)菌液濃度為10.000 CFU/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度比值下降至0.37。菌液濃度較低時(shí)，分泌的明膠酶較少，負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜熒光強(qiáng)度較高。當(dāng)菌液濃度為0.004 CFU/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度比值為0.63，小于0.70，說(shuō)明當(dāng)包裝飲用水中銅綠假單胞菌濃度為0.004 CFU/mL時(shí)，也能被檢出，得到陽(yáng)性結(jié)果。

3 小結(jié)

本研究基于具有特異性識(shí)別銅綠假單胞菌功能的磁性納米顆粒材料和銅綠假單胞菌所分泌明膠酶的雙靶向選擇，誘導(dǎo)負(fù)載GNP@FITC功能化納米纖維膜上FITC的釋放，通過(guò)功能化納米纖維膜熒光強(qiáng)度前后的變化來(lái)判定包裝飲用水中是否含有銅綠假單胞菌，建立包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)方法。該法采用糖基功能化磁性納米顆粒材料富集銅綠假單胞菌，250 mL飲用水中糖基功能化磁性納米顆粒材料的添加量為5.00 mg，糖基功能化磁性納米顆粒材料與銅綠假單胞菌的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為6 h，負(fù)載GNP@FITC的功能化納米纖維膜與銅綠假單胞菌最佳共培養(yǎng)時(shí)間為30 min，方法整體檢驗(yàn)時(shí)間小于8 h，方法檢出限為0.004 CFU/mL，特異性強(qiáng)。相較于GB 8538—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》的檢測(cè)方法，該方法縮短了檢測(cè)時(shí)間，且檢出限能夠滿足監(jiān)管需要，可作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充。

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收稿日期：2023-10-13

作者簡(jiǎn)介：黃 徽（1989-），男，湖北鐘祥人，工程師，碩士，主要從事食品安全檢測(cè)研究，（電話）15871439229（電子信箱）781312833@qq.com；

通信作者，王福燕（1975-），女，湖北江陵人，講師，博士，主要從事公共衛(wèi)生與安全研究，（電話）18971283408（電子信箱）1447004395@qq.com。