番茄褪綠病毒外殼蛋白多克隆抗體的制備和應用

摘要：為建立番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）的快速檢測技術，通過RT-PCR技術克隆病毒的主要外殼蛋白（Coat protein，CP）基因，利用Gateway技術將其重組至原核表達載體中，轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21菌株中誘導表達，將純化后的CP作為抗原免疫日本大耳兔制備ToCV CP多克隆抗體。間接ELISA顯示ToCV CP多克隆抗體的效價為1∶12 800；Western blot和田間試驗結果顯示多克隆抗體有很好的特異性和靈敏度。ToCV CP多克隆抗體可用于田間ToCV的檢測。

關鍵詞：番茄褪綠病毒（ToCV）；外殼蛋白（CP）；原核表達；多克隆抗體；制備

中圖分類號：S432.41" " " " "文獻標識碼：A" " " " " 文章編號：0439-8114（2025）02-0197-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.02.031 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to establish a rapid detection technology for the tomato chlorosis virus （ToCV）， the coat protein （CP） gene of the virus was cloned by RT-PCR technology， and it was recombinant into a prokaryotic expression vector using Gateway technology. It was then transformed into Escherichia coli BL21 strain for induction of expression. The purified CP protein was used as an antigen to prepare a ToCV CP polyclonal antibody by immunizing Japanese rabbits. Indirect ELISA showed that the titer of the ToCV CP polyclonal antibody was 1∶12 800. Western blot and field experiments had shown that the ToCV CP polyclonal antibody had good specificity and sensitivity. The ToCV CP" polyclonal antibody could be used for the detection of ToCV in the field.

番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus， ToCV）是正單鏈RNA病毒，隸屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），在自然條件下主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci）和紋翅粉虱（Trialeurodes abutilonea）等粉虱科（Aleyrodidae）昆蟲以半持久性方式傳播［1-3］。番茄褪綠病毒粒體形態為彎曲棒狀，長度800～850 nm，基因組包含2條正義RNA單鏈（RNA1和RNA2），其中RNA1鏈包含4個ORFs（Open reading frames），RNA2鏈包含9個ORFs［4-6］。RNA2含有2個重復的外殼蛋白ORFs，分別編碼主要外殼蛋白（Coat protein，CP）和次要外殼蛋白（Minor coat protein，CPm），CP的功能主要為包裹病毒核酸，CPm則與病毒粒子末端的形成相關［7-9］。

ToCV侵染番茄、煙草等寄主植物后，早期癥狀包括葉脈間的輕微泛黃，類似營養缺乏，后期整株出現黃化癥狀，葉片變厚變脆，直至干燥脫落［3］。染病番茄植株的果實較小、呈白色，果實產量和品質均下降，甚至絕收，給番茄的健康和安全生產造成嚴重的影響［10］。ToCV于20世紀90年代中期在美國佛羅里達州首次被發現［11］，現已蔓延至世界各地［12-14］。2004年中國臺灣省報道了ToCV［15］，之后該病毒快速擴散傳播，目前已在17個省份陸續被發現。目前在中國ToCV已成為一種危害嚴重、影響范圍廣的新型流行病毒。由于缺乏針對該病毒的有效防控藥劑，所以快速診斷對其防控尤為關鍵。因此，本研究通過制備ToCV CP的多克隆抗體，建立ToCV快速檢測方法，為田間番茄褪綠病毒病的快速診斷和預報提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大腸桿菌（Escherichia coli） BL21感受態細胞和DH5α感受態細胞由本實驗室保存；含ToCV的煙草葉片來自中國農業科學院煙草研究所；制備多克隆抗體所需的雄性日本大耳兔購自湖北省荊州市中心醫院動物研究中心。

1.2 主要試劑

Trizol試劑、2×HiFi Taq PCR StarMix、反轉錄酶以及純化所需的金屬鎳高流速瓊脂糖親和介質（NTA）均購自北京康潤誠業生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自OMEGA公司；DL 2000 DNA Marker、Protein Marker、T4 DNA Ligase均購自Takara公司；ECL顯色液、Protein Ladder、PVDF膜、酶標板均購自Thermo Scientific公司；TMB顯色液（組化或膜HRP顯色用）購自碧云天生物技術有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自康為世紀生物科技有限公司；Gateway系統載體pDONR221和pDEST17、BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix均購自Invitrogen公司；特異性引物由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 ToCV CP基因的克隆及原核表達載體的構建

利用Trizol試劑從感染ToCV的煙草葉片中提取總RNA，利用特異引物（表1）進行RT-PCR擴增。PCR擴增體系：2×HiFi Taq PCR StarMix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，去離子水10.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR擴增程序：預變性95 ℃" " " " 5 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，36個循環，最后72 ℃延伸5 min。隨后根據Invitrogen公司BP Clonase Enzyme Mix說明書將純化回收到的片段連接到載體pDONR221上并轉化至DH5α感受態細胞中，經卡那霉素篩選陽性克隆并送往武漢華大基因有限公司進行序列測定。對序列鑒定正確的克隆子pDONR221-CP進行過夜搖菌并提取質粒。利用LR Clonase Enzyme Mix將pDONR221-CP中CP片段重組到原核表達載體pDEST17上，經氨芐霉素篩選陽性克隆pDEST7-CP，并提取質粒備用。

1.3.2 pDEST17-ToCV CP的原核表達

將質粒pDEST17-CP轉入Escherichia coil BL21感受態細胞內，通過菌落PCR挑選陽性克隆子；將驗證正確的克隆子菌液接種至5 mL LB液體培養基中，37 ℃培養至菌液OD600 nm為0.6～0.8，然后加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）使培養液IPTG的終濃度為1 mmol/L，28 ℃繼續培養4 h；離心收集菌體，采用1×PBS緩沖液重懸菌體后進行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳。

1.3.3 CP可溶性分析及純化復性

誘導表達后，收集菌體并加入10 mL細胞裂解液，于37 ℃培養箱裂解30 min，使用細胞破碎儀進行破碎后離心，分別取沉淀、上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。根據抗原的可溶性，選擇上清液或沉淀，0.22 μm無菌濾膜過濾后通過Ni2+-NTA層析柱，經不同濃度（20、40、80 mmol/L）咪唑洗脫液純化獲得抗原CP。

將層析后得到的CP進行透析復性，在透析結束后收集透析液并將其置于-80 ℃環境中冷凍后進行真空冷凍干燥，得到純化的CP。

1.3.4 ToCV CP多克隆抗體的制備及其效價測定

用純化的CP作為免疫原免疫成年雄性日本大耳兔來制備ToCV CP多克隆抗體。將300 μg純化CP和完全弗氏佐劑（初次免疫）或不完全弗氏佐劑（增強免疫）等量混合均勻，進行皮下多點注射。共進行4次免疫，每次免疫間隔7 d，第4次免疫2周后取全血，37 ℃靜置1 h，4 ℃靜置過夜，離心收集上清液，得到含ToCV CP多克隆抗體的血清。分別以染病、健康本氏煙作為抗原，ToCV CP多克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，采用間接ELISA測定抗體效價。

1.3.5 Western blot檢測多克隆抗體的特異性和靈敏度

多克隆抗體特異性檢測參考文獻［16］的方法。提取攜帶ToCV的本氏煙及健康的本氏煙總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，同時以抗原蛋白作為陽性對照。采用濕轉方法（250 mA，120 min）將總蛋白轉移到PVDF膜上，以制備的ToCV CP多克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，顯色檢測表達的重組CP。

多克隆抗體的靈敏度檢測參考李雨珈等［17］的方法。將抗原蛋白從0.5 mg溶于1 mL PBS開始倍比稀釋，染病葉片0.1 g溶于1 mL PBS開始倍比稀釋，進行Western blot檢測。

1.3.6 利用ToCV CP多克隆抗體進行番茄褪綠病毒的田間檢測

利用制備的ToCV CP多克隆抗體通過間接ELISA方法檢測試驗田的66株煙草植株（已經通過RT-PCR確診病原），用酶標儀讀取OD450 nm，記錄后分析結果。

2 結果與分析

2.1 ToCV CP基因的克隆及原核表達載體的構建

從染病的本氏煙葉片中提取總RNA，經RT-PCR擴增獲得大小約774 bp的片段，該片段大小符合預期（圖1a）。利用Gateway重組獲得重組載體pDONR221-CP，菌落PCR鑒定為陽性的克隆子經武漢華大基因有限公司測序證實插入的序列以及讀框碼正確，同時經LR重組酶進行LR重組反應獲得重組原核表達載體pDEST17-CP，提取陽性克隆子的質粒，經PCR鑒定獲得符合預期大小約774 bp的片段（圖1b）。

2.2 CP可溶性分析及純化

采用IPTG誘導表達后，將破碎細胞的上清液和沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。與上清液樣品的泳道相比，沉淀樣品所在的泳道存在一條明顯的目的條帶（圖2a），可見沉淀中所含目的蛋白含量遠高于上清液，CP主要以包涵體形式存在。接著采用Ni2+-NTA層析柱對CP進行純化，泳道2和3均有單一且大小與預期一致的條帶，表明CP純化成功（圖2b）。

2.3 間接ELISA檢測抗體的效價

分別以染病、健康本氏煙作為抗原，ToCV CP多克隆抗體作為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，采用間接ELISA方法檢測抗體效價，以陽性OD450 nm/陰性OD450 nmgt;2為判定標準。結果（圖3）表明，濃度為0.100 g/mL的染病本氏煙汁液可以與稀釋12 800倍的ToCV CP多克隆抗體產生陽性免疫反應，說明ToCV CP多克隆抗體的效價為1∶12 800。

2.4 Western blot檢測多克隆抗體的特異性和靈敏度

2.4.1 Western blot檢測多克隆抗體的特異性

以染病本氏煙植株和健康本氏煙植株提取的總蛋白為樣品，純化的抗原蛋白作為陽性對照，ToCV CP多克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，進行Western blot檢測。結果表明，ToCV CP多克隆抗體能特異性識別染病植株中CP（28.70 ku左右），陽性對照也能檢測到31.30 ku左右的蛋白，但健康本氏煙樣品沒有檢測到該蛋白（圖4），說明獲得的ToCV CP多克隆抗體具有很好的特異性。

2.4.2 Western blot檢測ToCV CP多克隆抗體的靈敏度

以0.100 g/mL的染病本氏煙汁液為起始濃度，按1∶10進行倍比稀釋，Western blot檢測分析，檢測結果（圖5a）顯示，ToCV CP多克隆抗體能檢測到的染病本氏煙汁液濃度為0.010 g/mL；同時以0.5 mg/mL抗原蛋白作為起始濃度按1∶10進行倍比稀釋，染病煙草病毒（健康煙草）Western blot檢測分析，檢測結果（圖5b）顯示，ToCV CP多克隆抗體能檢測到的抗原蛋白濃度為0.005 0 mg/mL。

2.5 利用多克隆抗體進行番茄褪綠病毒的田間檢測

使用制備的ToCV CP多克隆抗體對試驗田中通過RT-PCR檢測的66株煙草樣品（包括辣椒脈斑駁病毒病株21株，馬鈴薯Y病毒病株18株，煙草花葉病毒病株14株，番茄褪綠病毒病株6株，健康植株7株）進行間接ELISA檢測。檢測結果如表2、表3所示，有6株煙草樣品的檢測結果為陽性，該結果與RT-PCR檢測結果一致，說明制備的ToCV CP多克隆抗體有較強的特異性，能用于田間樣品的檢測。

3 討論與小結

3.1 討論

植物病毒病被稱為“植物癌癥”，是僅次于真菌病害的第二大植物病害，能夠對植物的生長帶來嚴重危害［18-20］。自1988年美國首次發現ToCV以來，世界多地均陸續報道了ToCV侵染植物的記錄。ToCV不僅可以侵染茄科（Solanaceae）、菊科（Compositae）、藜科（Chenopodiaceae）、夾竹桃科（Chenopodiaceae）等多科不同屬的植物［21-23］，包括經濟作物、觀賞植物，還可以侵染如苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）等常見雜草［24］。2020年中國報道了ToCV侵染黃瓜（Cucumis sativus）的記錄［25］，隨著ToCV變異株的增多，未來ToCV的寄主范圍可能會變得更加廣泛。為有效預防ToCV的傳播，迫切需要開發出一種快速、高效、靈敏的病毒檢測技術。目前，檢測ToCV的方法主要是RT-PCR技術。RT-PCR技術是通過病毒的核酸來檢測病毒，該技術特異性強且可用于檢測更低數量級的病毒，但它有成本高、耗時長、對儀器的依賴度高等缺點。因此，具有操作簡便、迅速、可批量檢測樣品的血清學方法被廣泛運用于病毒檢測［26-28］，但ToCV的血清學檢測方法鮮有報道，本研究通過克隆ToCV中保守性高且在病毒侵染時不可缺少的CP基因來制備多克隆抗體，從而建立檢測ToCV的血清學方法。

3.2 小結

本研究采用了與傳統基因克隆方法不同的Gateway重組技術將目的基因重組到表達載體上，一方面Gateway重組技術操作更簡便快速，可極大提高試驗效率；另一方面利用大腸桿菌表達系統更容易得到大量的高純度抗原蛋白［29-32］。本研究首先利用ToCV特異性引物對CP基因片段進行PCR擴增，接著采用Gateway重組技術構建原核表達載體并將其轉化至Escherichia coil BL21細胞中，菌落PCR驗證及陽性克隆測序。選取序列正確的菌株， IPTG誘導Escherichia coil BL21表達CP，將成功表達CP的菌株進行裂解、破碎以及SDS-PAGE凝膠電泳檢測等一系列操作后確認CP為包涵體蛋白。進而采用Ni2+-NTA層析柱獲得大量純化的CP，將純化的CP作為抗原免疫日本大耳兔制備ToCV CP多克隆抗體。間接ELISA和Western blot檢測結果可知制備的ToCV CP多克隆抗體效價為1∶12 800，且具有很好的特異性和靈敏度。此外，田間病株的間接ELISA檢測結果也顯示ToCV CP多克隆抗體能夠特異性檢測ToCV病株。這表明本研究制備的ToCV CP多克隆抗體可用于田間番茄褪綠病毒的檢測，同時也為研究病毒外殼蛋白的功能及其與寄主間互作奠定了基礎。

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收稿日期：2024-03-21

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31972243）；廣西作物病蟲害生物學重點實驗室基金項目（22-035-31-22KF03）

作者簡介：伍維蘭（1999-），女，重慶梁平人，在讀碩士研究生，研究方向為病毒監測與分子病毒學，（電話）17302361878（電子信箱）weilan_wu@163.com；通信作者，郭靈芳（1977-），女，湖北黃梅人，高級實驗師，主要從事化學生物學研究，（電子信箱）glf0498104@163.com；共同通信作者，章松柏（1978-），男，湖北黃梅人，教授，主要從事病毒監測與分子病毒學研究，（電子信箱）yangtze2008@126.com。