塔里木馬鹿抗氧化基因PRDX1的功能初探

摘 要： 旨在探討塔里木馬鹿抗氧化功能基因過氧化物酶1（PRDX1）在氧化應激中對細胞的保護作用。本研究利用塔里木馬鹿PRDX1基因（CeyPRDX1）過表達載體（pLJM1-CeyPRDX1-EGFP）感染人永生化角質形成細胞HaCaT后，通過MTT法建立HaCaT細胞在高溫、鹽（NaCl）和過氧化氫（H2O2）等脅迫條件下的損傷模型。在這3種氧化應激脅迫條件下檢測過表達CeyPRDX1基因對細胞的凋亡率、線粒體膜電位變化（JC-1）、活性氧（ROS）含量、丙二醛（MDA）含量以及SOD1、PTEN和Caspase-3等基因mRNA相對表達量的影響。結果表明，將200 mmol·L^-1的NaCl干預細胞24 h、0.50 mmol·L^-1的H2O2處理細胞12 h和42 ℃培養細胞4 h選為細胞氧化損傷的最佳脅迫條件。在此脅迫條件下，過表達CeyPRDX1基因能夠增加細胞存活率，并減少由NaCl、H2O2和高溫等脅迫條件誘導的細胞凋亡率、線粒體膜電位的損傷、ROS以及MDA含量，從而有效降低氧化應激誘導的細胞損傷。qRT-PCR結果表明，在3種脅迫條件下，與未感染和感染空載慢病毒的HaCaT細胞相比，感染CeyPRDX1過表達慢病毒的HaCaT細胞中SOD1的mRNA表達量顯著升高（P＜0.001），而PTEN和凋亡相關基因Caspase-3的mRNA表達量顯著下降（P＜0.01）。本研究結果表明， CeyPRDX1基因可能在塔里木馬鹿適應極端干旱環境和耐受高鹽飲食的過程中起到保護細胞免受氧化應激損傷的作用。其作用可能與SOD1、PTEN和Caspase-3等基因的表達調控有關。

關鍵詞： 塔里木馬鹿；PRDX1基因；HaCaT細胞；CeyPRDX1過表達；氧化應激

中圖分類號：

S825.2"""" 文獻標志碼： A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1216-15

收稿日期：2024-10-09

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金項目（2022D01B40）

作者簡介：布威海麗且姆·阿巴拜科日（1988-），女，維吾爾族，新疆和田人，副教授，博士，主要從事野生哺乳動物保護遺傳學和適應性進化、藥用植物系統進化及其相關研究，E-mail：hediqe9@163.com

*通信作者：單文娟，主要從事新疆珍稀瀕危及特有野生哺乳動物的保護遺傳學及分子系統演化研究，E-mail：swj@xju.edu.cn

Preliminary Study on the Function of PRDX1 Antioxidant Gene in Tarim Red Deer

ABABAIKERI" Buweihailiqiemu ^3，4， AIHEMAITIJIANG" Aihemaitiniyazi1，

MOHAMMADTURSUN Nabijan^1，3， SHAN Wenjuan^2*

（1.Xinjiang Hetian College， Hotan 848000， China; 2.Xinjiang Key Laboratory of

Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，

Xinjiang University， Urumqi 830017， China;

3.Xinjiang Key Laboratory of Hotan

Characteristic Chinese Traditional Medicine Research， Hotan 848000， China;

4.College

of Life Sciences，Wuhan University， Wuhan 430072， China）

Abstract：" This study was conducted to investigate the protective effect of the antioxidant gene peroxiredoxin I （PRDX1） of Tarim red deer in cells under oxidative stress. The Tarim red deer PRDX1 （CeyPRDX1） overexpression vector （pLJM1-CeyPRDX1-EGFP） was used to infect human immortalized keratinocyte HaCaT cells， and MTT method was used to establish the injury model of HaCaT cells under high temperature， salt （NaCl） and hydrogen peroxide （H2O2） stress conditions. Under this stress conditions， the effects of overexpression of CeyPRDX1 on cell apoptosis rate， mitochondrial membrane potential changes （JC-1）， reactive oxygen species （ROS） content， malondialdehyde （MDA） content， and relative expression levels of SOD1， PTEN， and Caspase-3 genes were examined. The results showed that the 24 h of intervention with 200 mmol·L^-1 NaCl， 12 h of treatment with 0.50 mmol·L^-1 H2O2， and 4 h of cultivation at 42 ℃ were selected as the optimal stress conditions for cellular oxidative damage. Under stress conditions， overexpression of CeyPRDX1 gene could increase cell survival rate， and reduce apoptosis rate， mitochondrial membrane potential damage， ROS and MDA content induced by stress conditions such as NaCl， H2O2 and high temperature， effectively reducing oxidative stress-induced cell damage. The qRT-PCR results showed that under 3 stress conditions， compared to HaCaT cells that were not infected and HaCaT cells infected with empty lentivirus， HaCaT cells infected with CeyPRDX1 overexpressing lentivirus showed significantly increased mRNA expression level of SOD1 （P＜0.001）， while significantly decreased mRNA expression levels of PTEN and apoptosis related gene Caspase-3 （P＜0.01）. The results indicate that CeyPRDX1 gene may play an important role in protecting cells from oxidative stress damage in the adaptation of Tarim red deer to extreme drought environments and tolerance to high salt diets. Its role may be related to the expression regulation of genes such as SOD1， PTEN and Caspase-3.

Keywords： Tarim red deer; PRDX1 gene; HaCaT cells; overexpression of CeyPRDX1; oxidative stress

*Corresponding author：SHAN Wenjuan， E-mail：swj@xju.edu.cn

塔里木馬鹿（Cervus elaphus yarkandensis）是中國新疆塔克拉瑪干沙漠周邊塔里木盆地特有的典型的耐旱鹿科動物。塔里木盆地極端的干旱棲息環境決定了UV輻射、溫度、鹽度和干旱是塔里木馬鹿生存過程中不可避免的脅迫因素。極端干旱^［1］、鹽^［2］和高溫^［3］等逆境脅迫會導致機體內的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量積累，當ROS的形成超過靶細胞的抗氧化防御能力時，氧化應激會導致氧化損傷。為了維持細胞ROS的代謝平衡，有效減弱脅迫誘導的細胞損傷，生物體在長期的進化過程中體內形成了完整的抗氧化系統來清除多余的ROS。

過氧化物還原酶（PRDXs）是一種在哺乳動物中高度保守的半胱氨酸依賴型過氧化物酶家族蛋白，具有高度的抗氧化活性，可去除過氧化物，包括過氧化氫、有機氫過氧化物和過氧亞硝酸鹽等^［4-5］。在哺乳動物中已鑒定出6個PRDX成員（PRDX1-PRDX6）并分為3個亞家族^［4-5］。PRDX1是典型的2-Cys-PRDX亞家族的成員，需要兩個半胱氨酸的氧化來激活其酶活性，催化過氧化氫和有機過氧化氫分別還原為水和醇^［4］。PRDX1調節與ROS相關的各種信號通路，發揮抗氧化和清除自由基的功能^［6-7］，可以保護角質化細胞免受ROS誘導的凋亡，參與表皮屏障修復，促進傷口愈合，減輕氧化應激對皮膚造成的損傷，是氧化應激條件下保護皮膚和維持皮膚穩態的新策略^［8］。在前期研究中利用全基因組重測序（WGS）進行的FST-θπ和XP-EHH選擇消除分析方法檢測到在塔里木馬鹿中PRDX1基因具有較強的選擇消除信號^［9］。與此同時，將塔里木馬鹿皮膚組織作為研究對象進行的轉錄組分析和qRT-PCR檢測，發現PRDX1基因在塔里木馬鹿皮膚組織中上調表達并顯著富集在氧化還原酶活性、抗氧化活性、過氧化物酶活性、催化活性和分子功能等6條GO功能類別以及過氧物酶體等KEGG通路^［10］。這些GO功能類別與雙峰駝（Camelus ferus）和單峰駝（Camelus dromedarius）干旱-沙漠環境適應性相關^［11］。此外，PRDX1基因在極端干旱-沙漠環境適應埃及肥尾羊（Ovis aries）中也受選擇并富集到氧化還原酶活性和抗氧化活性相關的多種生物學過程^［12］。基于以上研究報道，結合本課題組前期研究的WGS數據、皮膚組織轉錄組測序和qRT-PCR檢測結果，推測在塔里木馬鹿極端干旱環境適應中PRDX1基因可能發揮著潛在的作用。然而，細胞在不同脅迫條件下的氧化應激過程中塔里木馬鹿PRDX1是否發揮作用尚不清楚。

本研究擬利用塔里木馬鹿PRDX1基因（CeyPRDX1）編碼區CDS序列構建慢病毒表達載體，并將其感染到皮膚相關細胞人角質化細胞系 HaCaT中進行過表達后建立HaCaT細胞在高溫、鹽和過氧化氫等脅迫條件下的損傷模型，并在這3種氧化應激脅迫條件下檢測過表達CeyPRDX1對細胞的抗氧化保護作用。本研究結果可為闡明PRDX1基因在塔里木馬鹿適應環境脅迫過程中的重要作用提供有價值的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料和試劑

人永生化角質形成細胞HaCaT購于萬類生物公司；慢病毒表達載體（pLJM1-CeyPRDX1-EGFP）由本課題組提供；2×Sybr Green qPCR Mix （High ROX）和First Strand cDNA Synthesis Kit購于北京金百特生物技術有限公司；MTT檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒和活性氧（ROS）檢測試劑盒均購于萬類生物；過硫酸銨（APS）、胰蛋白酶-EDTA消化液、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）均購于北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、DMEM 和胎牛血清（FBS）均購于Invitrogen公司；Opti-MEM 培養基（Gibco，美國）、BSA牛血清蛋白（美國Biosharp 公司）、DMSO溶液和青鏈霉素均購于美國Sigma公司；Tris、H2O2（30 mL·L^-1）、NaCl和其他化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 CeyPRDX1過表達慢病毒感染HaCaT細胞

開始感染HaCaT細胞之前，病毒從－80 ℃冰箱取出后置于冰浴慢慢融化，加入培養基稀釋慢病毒，混勻分裝后即用（或4 ℃保存）。將HaCaT細胞以3×105個·mL^-1接種于24孔板，培養12～20 h。根據MOI值（20），使用1/2小體積感染法，加入250 μL慢病毒稀釋液，4 h后，加入polybrene（終濃度為8 μg·mL^-1）和完全培養基補足至500 μL并置于37 ℃，50 mL·L^-1 CO2箱中繼續培養24 h。吸去培養液，用PBS洗滌一次，加入新鮮培養液繼續培養，檢測慢病毒感染率，感染48 h后開展后續試驗。

1.3 篩選構建HaCaT細胞氧化應激損傷模型的最佳脅迫條件

HaCaT細胞用含10 mL·L^-1 FBS、100 U·mL^-1青霉素-鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃，50 mL·L^-1 CO2以及飽和濕度條件下培養至90%，再傳代并制成5×103個·mL^-1的單細胞懸液接種于96孔板中，置于細胞培養箱中繼續培養24 h。細胞分別用高鹽（0、50、100、150、200和250 mmol·L^-1濃度的NaCl溶液干預細胞4、6、12、18和24 h）、高溫（37 ℃、39 ℃、41 ℃和42 ℃的恒溫培養箱中孵育細胞1、2、3和4 h）和H2O2（0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00和2.50 mmol·L^-1濃度的H2O2培養細胞6、12、18和24 h）等3種不同脅迫條件處理后，加MTT溶液20 μL（5 mg·mL^-1）37 ℃孵育4 h。PBS清洗后每孔加l50 μL二甲基亞砜（Formazan溶解液，DMSO），振蕩10 min，570 nm處測光吸收值 D（570 nm）。 每個處理條件設3個復孔，每個脅迫重復3次。按以下公式計算細胞存活率，并根據細胞存活率篩選對細胞產生損傷的最佳處理條件。

細胞存活率（Cell viability）= D（570 nm）處理組-D（570 nm）空白D（570 nm）對照組-D（570 nm）空白×100%

對于同一時間的鹽和H2O2脅迫處理，以沒加入NaCl和H2O2的細胞作為對照組，其他藥物干預的細胞作為處理組；在同一時間的高溫脅迫處理，以37 ℃的細胞作為對照組，其余高溫刺激的細胞作為處理組。根據文獻報道^［13-19］，本試驗以細胞存活率為60%～80%的脅迫處理條件為對細胞產生損傷的最佳適宜脅迫條件，如果細胞存活率過低或過高都不利于后續試驗。

后續試驗共設為4組，分別是未脅迫處理的正常HaCaT細胞（Control，對照組）、慢病毒未感染48 h的HaCaT細胞（NC，空白組）、空載慢病毒感染48 h的HaCaT細胞（pLJM1-EGFP-vector，空載組）和CeyPRDX1過表達慢病毒感染48 h的HaCaT細胞（pLJM1-CeyPRDX1-EGFP，CeyPRDX1過表達組）。

1.4 MTT法測定過表達CeyPRDX1基因對HaCaT細胞損傷的影響

4組HaCaT細胞以5×103個·mL^-1濃度接種于96孔板中，置于細胞培養箱中繼續培養24 h。根據篩選出來的最佳脅迫條件分別處理細胞后，加MTT溶液20 μL（5 mg·mL^-1），在37 ℃孵育4 h。PBS清洗后每孔加l50 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，570 nm處測光吸收值。其中，以未脅迫處理的正常HaCaT細胞為對照組，以空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組為處理組，按“1.3”的公式計算細胞存活率，每組設置5個復孔。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將細胞以5×105個·mL^-1的密度接種于6孔板中，2 mL·孔^-1，置于細胞培養箱中繼續培養24 h。根據篩選出來的最佳脅迫條件處理空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組HaCaT細胞后，分別收集細胞。用PBS洗滌細胞，計數后再次收集。每組細胞加入500 μL Binding buffer重懸細胞于流式管；加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻；加入10 μL的碘化丙啶染色液（PI），輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，隨后上機檢測（Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶（PI）為紅色熒光）。

1.6 過表達CeyPRDX1基因對細胞氧化應激損傷的影響

為了檢測過表達基因對細胞氧化應激損傷的影響，將細胞以5×105個·mL ^-1的密度接種于6孔板中，置于37 ℃、50 mL·L^-1 CO2培養箱中繼續培養24 h。根據篩選出來的最佳脅迫條件處理空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組的HaCaT細胞后，采用流式細胞術檢測方法按照線粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒和活性氧（ROS）檢測試劑盒說明書分別檢測細胞的JC-1變化和細胞內ROS的含量。同樣的方法處理各組細胞后按照丙二醛（MDA）測定試劑盒說明書和以下公式計算MDA含量（nmol·mg^-1 prot）：

MDA含量=D（532 nm）測定-D（532 nm）對照D（532 nm）標準-D（532 nm）空白×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度。

1.7 qRT-PCR方法檢測細胞氧化應激和凋亡相關基因的表達

將細胞以2×105個·mL^-1的密度接種于6孔板中，置于細胞培養箱中繼續培養24 h。根據篩選出來的最佳脅迫條件處理后分別收集空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組的HaCaT細胞。按照TRIzol方法提取細胞總RNA后，將檢測合格的RNA反轉錄合成cDNA并以此為模板進行qRT-PCR檢測。以未轉染慢病毒的正常HaCaT細胞為對照組，以脅迫條件處理空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組的HaCaT細胞為試驗組，以β-actin（正向引物序列：5′-GGCACCCAGCACAAT-GAA-3′，反向引物序列：5′-TAGAAGCATTTGCGG-TGG-3′）作為內參基因，檢測超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）（正向引物序列：5′-GGTCCTCACTTTAATCCTCT-3′，反向引物序列：5′-CTTCATTTCCACCTTTGC-3′）、10 號染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源體（phosphatase and tensin hommolog deleted on chromosome ten，PTEN）（正向引物序列：5′-ACCATAACCCACCA-CAGC-3′，反向引物序列：5′-CAGTTCGTCCCTT-TCCAG-3′）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic protease 3，Caspase-3）（正向引物序列：5′-TGGTTCATCCAGTCGCTTTG-3′，反向引物序列：5′-AATTCTGTTGCCACCTTTCG-3′）等基因的mRNA 相對表達量，采用 2^-ΔΔCt 方法計算相對表達量，每個基因做3次重復。

1.8 數據統計分析

利用GraphPad Prisim軟件進行統計學分析。所有數據用“均數±標準差（mean±SD）”表示，組間差異采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA）進行比較，兩組間差異采用獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，ns表示沒有統計學差異。

2 結 果

2.1 篩選HaCaT細胞損傷的最佳脅迫條件

為建立細胞的損傷模型，本研究將HaCaT細胞分別用NaCl、H2O2和高溫等3種不同脅迫條件處理后，通過MTT方法檢測細胞存活率，結果如圖1所示。結果顯示，不同濃度的NaCl處理細胞至18 h對細胞存活率影響不大，而隨著作用時間的推移，對細胞存活率的影響變大。其中，200 mmol·L^-1的NaCl處理細胞24 h以及250 mmol·L^-1 NaCl處理細胞18 h和24 h時，細胞存活率在80%以下（圖1A）。200 mmol·L^-1的NaCl干預細胞24 h的存活率為（72.35±3.17）%，差異具有統計學意義（P＜ 0.01），因此將此條件選為最佳NaCl脅迫條件。

將HaCaT細胞用6種不同濃度的H2O2進行處理后，隨著H2O2濃度和處理時間的延長，細胞增殖活性逐漸下降（圖1B）。當0.50 mmol·L^-1濃度的H2O2，處理細胞12 h時，細胞存活率從（95.12±3.74）%降低到（68.67±2.37）%（P＜0.01）；時間延長至18 h和24 h后細胞存活率慢慢降低，分別為（62.90±5.97）%和（60.77±5.89）%。為了避免長時間的H2O2對細胞產生負面影響，將0.50 mmol·L^-1濃度的H2O2處理細胞12 h選為最佳H2O2的脅迫條件。

將HaCaT細胞在4種不同溫度條件下培養至2 h后，與對照組相比，細胞存活率均在80%以上，都處于正常狀態（圖1C）。在42 ℃高溫刺激細胞3 h和4 h后，細胞存活率逐漸下降均小于80%。其中，3 h的細胞存活率（79.57±1.96）%跟同一時間39 ℃和41 ℃處理的細胞存活率沒有統計學差異（P＞0.05），而42 ℃刺激細胞4 h的細胞存活率明顯降低（73.34±0.99）%，細胞存活率符合建立細胞損傷模型的范疇。因此，選42 ℃培養細胞4 h為最佳高溫處理脅迫條件。

2.2 不同脅迫條件下，過表達CeyPRDX1對細胞存活率的影響

利用最佳細胞損傷模型建立條件（200 mmol·L^-1的NaCl干預細胞24 h、0.50 mmol·L^-1濃度的H2O2處理細胞12 h和42 ℃培養細胞4 h）來處理4組細胞后，通過MTT方法檢測細胞存活率（圖2）。結果顯示，與對照組相比，用以上脅迫條件處理的空白組和空載組細胞的存活率均顯著下降（P＜0.001）；CeyPRDX1過表達組的細胞存活率均高于空白組和空載組，并具有極顯著差異（P＜0.001）。NaCl和42 ℃脅迫條件下的CeyPRDX1過表達組與對照組相比，細胞存活率沒有顯著下降的趨勢（P＞0.05）。由此可見，在細胞中過表達CeyPRDX1對細胞增殖活力產生積極影響，比空白組和空載組更能耐受脅迫引起的細胞損傷。說明，CeyPRDX1基因在應激條件下對細胞起保護作用，從而提高受損細胞的存活率。

2.3 不同脅迫條件下，過表達CeyPRDX1對HaCaT細胞凋亡的影響

細胞凋亡結果顯示（圖3），在3種脅迫條件下，與對照組和CeyPRDX1過表達組相比，空白組和空載組的細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.001）。與空白組和空載組相比，CeyPRDX1基因的過表達能顯著抑制細胞凋亡。此外，與對照組相比，CeyPRDX1過表達組在NaCl和H2O2脅迫條件下的細胞凋亡率顯著增加（P＜0.001，圖3A、3B和3D），而在42 ℃脅迫條件下的細胞凋亡率沒有顯著升高（P＞0.05，圖3C和3D）。以上結果表明，過表達CeyPRDX1基因能夠減輕由NaCl、H2O2和高溫脅迫誘導的細胞凋亡率，尤其是對高溫誘導的細胞凋亡發揮明顯的抑制作用。

2.4 線粒體膜電位變化的檢測

為了檢測細胞在不同脅迫條件下，過表達CeyPRDX1能否影響細胞的早期凋亡，利用JC-1檢測試劑盒檢測線粒體膜電位變化。結果顯示（圖4），脅迫處理細胞后，與對照組和CeyPRDX1過表達組相比，空白組和空載組細胞的平均紅綠熒光強度比值均為顯著下降（P＜0.001）。說明，脅迫條件對空白組和空載組細胞的膜電位產生較大的負面影響。與對照組相比，在H2O2脅迫條件下，CeyPRDX1過表達組細胞的平均紅綠熒光強度比值顯著降低（P＜0.001，圖4B和4D），而在NaCl和42 ℃處理條件下的線粒體膜電位沒有顯著差異（P＞0.05，圖4A、4B和4D）。說明，過表達CeyPRDX1基因能夠減少由NaCl、H2O2和高溫等脅迫條件誘導的線粒體膜電位的損傷。

2.5 流式細胞術檢測各組細胞內ROS水平

為探討過表達CeyPRDX1基因對NaCl、H2O2和高溫等脅迫條件處理細胞后的保護作用是否與ROS的清除有關，利用DCF的熒光檢測細胞內ROS 的水平，結果如圖5所示。與對照組相比，空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組細胞的ROS含量顯著升高（P＜0.05），表明不同脅迫條件處理細胞后產生了較多的 ROS。其中，CeyPRDX1過表達組細胞的ROS含量顯著低于空載組和空白組的ROS 含量（P＜ 0.001）。結果表明，過表達的CeyPRDX1能夠清除細胞氧化應激損傷產生的ROS。

2.6 丙二醛（MDA）含量的檢測

MDA含量的檢測結果顯示（圖6），與對照組相比，不同脅迫條件處理的空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組細胞的MDA含量均上升（P＜0.01）。其中，CeyPRDX1過表達組的MDA含量顯著低于空白組和空載組的MDA含量（P＜0.001）。機體內MDA的含量可以直接反映生物體的氧化或損傷程度。以上結果可以看出，CeyPRDX1基因的過表達可能通過加強細胞清除ROS的能力，降低細胞損傷過程中發生的脂質過氧化，從而減弱細胞的損傷程度。

2.7 qRT-PCR方法檢測細胞氧化應激和凋亡相關基因的表達

為探討脅迫條件下過表達CeyPRDX1基因是否影響氧化應激和凋亡相關基因的mRNA表達水平，利用qRT-PCR方法進行檢測，結果如圖7所示。結果顯示，在脅迫條件下，與對照組相比，在空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組中SOD1基因的mRNA表達量呈現出顯著下調趨勢（P＜0.001）；其中，CeyPRDX1過表達組SOD1基因的mRNA表達量顯著高于空白組和空載組（P＜0.001）。與對照相比，空白組、空載組和CeyPRDX1過表達組細胞PTEN基因的 mRNA表達量均呈現上調的趨勢，而CeyPRDX1過表達組細胞PTEN的表達量顯著低于空白組和空載組（P＜0.001）。與對照組相比，NaCl、H2O2和高溫等脅迫處理使Caspase-3基因在空白組和空載組細胞的mRNA表達量顯著升高（P＜0.001）；盡管，Caspase-3基因在CeyPRDX1過表達組中的表達量顯著低于空白組和空載組（P＜0.01），但在H2O2和42 ℃脅迫條件下CeyPRDX1過表達組Caspase-3基因的表達量非常接近于其在正常細胞的表達量（P＞0.05，圖7B和7C）。以上結果提示，細胞在氧化應激條件下過表達CeyPRDX1可通過促進抗氧化基因SOD1的mRNA表達，降低PTEN和凋亡相關基因Caspase-3的mRNA表達，從而保護細胞免受氧化損傷。

3 討 論

3.1 細胞的選擇

皮膚作為哺乳動物第一道保護屏障，要保護機體免受有害因素引起的氧化損傷^［20-21］。環境中強烈紫外線或污染以及機體內的炎癥反應都會引起氧化應激，抗氧化作用不足會造成毛囊中黑色素細胞凋亡和氧化損傷。塔里木馬鹿對塔里木盆地的各種應激環境已表現出良好的適應性，這意味著塔里木馬鹿皮膚中抗氧化系統發揮著特別重要的角色。在前期研究中發現，抗氧化基因PRDX1在塔里木馬鹿中受選擇并在皮膚組織中上調表達^［10］，從而推測塔里木馬鹿中PRDX1基因可能通過參與氧化應激反應和皮膚保護屏障的形成以及維持皮膚穩態，從而可能發揮保護機體免受有害因素對細胞損傷的作用，但其細胞保護機制尚不清楚。HaCaT細胞是氧化應激和自身免疫疾病的橋梁，具有許多與正常人角質形成細胞相似的生物學特性，因其易于生存和穩定的細胞特性常被用于表皮相關研究^［17］。為此，本試驗選擇皮膚相關的人永生化角質形成細胞HaCaT作為研究對象。

3.2 建立細胞氧化應激損傷模型

為探討過表達的CeyPRDX1是否能夠保護細胞免受氧化應激誘導的損傷，先篩選建立HaCaT細胞氧化應激損傷模型的最佳脅迫條件。在多種細胞損傷脅迫中H2O2由于穩定性較好且操作簡便，不同細胞對H2O2刺激的敏感性不同，而常被用于建立細胞氧化應激損傷模型^［13-19］。此外，塔里木盆地極端的干旱環境導致該地區土壤的鹽堿度較高，塔里木馬鹿耐受飲用高礦化度的鹽水^［22］，且蘆葦（Phragmites communis）和檉柳（Tamarix ramosissima）是該物種的主要飼料，其鹽度明顯高于內陸植物^［23-24］。因此，本研究選擇H2O2、NaCl和高溫作為刺激源建立氧化應激模型的脅迫條件。關于最佳脅迫條件的選擇，不同研究建立細胞損傷模型所采用的最佳脅迫時間和作用時間也有所差別。如，Luo等^［15］的研究中利用不同濃度的H2O2處理細胞12 h后，選取0.50 mmol·L^-1的H2O2（細胞存活率約為62%）為構建細胞損傷模型的最佳條件，此條件與高進濤等^［16］的研究報道相一致。王建波等^［25］用不同濃度的NaCl 溶液干預人腎小管上皮細胞（HK2）24 h后誘導細胞的損傷。許磊^［26］在探討安石榴苷抗高溫誘導的細胞氧化損傷分子機制研究中，根據細胞存活率選取42 ℃處理細胞6 h（細胞存活率大概75%左右）為建立熱應激模型條件。可以看出，建立氧化應激模型時，細胞存活率不能太低也不能太高，若存活率太低說明細胞處于不可恢復的損傷狀態，不利于抗氧化機制的研究；若細胞存活率過高時細胞狀態良好，脅迫條件不會造成明顯的氧化損傷，不利于后續試驗的開展。根據文獻報道^［13-19］，本試驗將細胞存活率一般在60%～80%的脅迫處理條件作為最適宜的脅迫條件。在此評判標準下，將200 mmol·L^-1的NaCl干預細胞24 h（細胞存活率（72.35±3.17）%）、0.50 mmol·L^-1的H2O2處理細胞12 h（細胞存活率（68.67±2.37）%）和42 ℃培養細胞4 h（細胞存活率（73.34±0.99）%）作為建立氧化應激模型的最佳脅迫條件。

3.3 過表達CeyPRDX1能夠有效降低氧化應激誘導的細胞損傷

正常情況下，細胞的線粒體膜電位較高，線粒體中的JC-1以聚合物（J-aggregates）的形式存在于基質并發出紅色熒光；細胞在各種脅迫條件下發生凋亡的時候線粒體膜電位也隨之下降，此時JC-1不能聚集在線粒體的基質中，而以單體（monomers）的形式存在，并發出綠色熒光，JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變能夠反映細胞早期凋亡。氧化應激導致機體內的活性氧ROS大量積累，從而引起細胞凋亡。氧化應激過程中大量ROS的產生會破壞線粒體跨膜電位的平衡，并導致線粒體損傷，從而進一步加劇細胞凋亡過程^［27-28］。生物體因受到逆境脅迫條件被誘導產生的大量ROS等自由基使生物膜上的脂質物質不斷遭受過氧化，形成脂質過氧化物，最終降解成丙二醛（MDA）等有害代謝產物，使細胞膜的流動性和通透性發生改變，改變細胞的結構和功能。因此，機體內MDA的含量可以直接反映生物體的氧化或損傷程度^［29］。本試驗用H2O2、NaCl和高溫的最佳脅迫條件處理4組細胞后，與對照組和CeyPRDX1過表達組相比，空白組和空載組的細胞存活率和線粒體膜電位顯著下降，細胞凋亡率、ROS和MDA含量顯著升高。可以看出，200 mmol·L^-1的NaCl、0.50 mmol·L^-1的H2O2和42 ℃的高溫對空白組和空載組HaCaT細胞產生明顯的氧化損傷。與此相反，與空白組和空載組相比，CeyPRDX1過表達組的細胞存活率和線粒體膜電位顯著增加，細胞凋亡率、ROS和MDA含量顯著下降。本試驗結果與Jiang 等^［30］和Wen等^［31］的研究結果相一致。可以看出，過表達CeyPRDX1基因能夠減輕脅迫處理導致的線粒體膜電位的損傷，加強細胞清除ROS的能力，降低細胞損傷過程中發生的脂質過氧化，從而降低HaCaT細胞凋亡并增加受損細胞的存活率，能夠有效降低氧化應激誘導的細胞損傷。

3.4 CeyPRDX1過表達影響SOD1、PTEN和Caspase-3等基因的表達調控

在氧化應激下，為了保護細胞免受氧化損傷，細胞表達出各種抗氧化酶，如SODs、GPXs和CAT等^［32］。Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）是一種細胞內抗氧化酶，催化超氧化物歧化成氧和毒性較小的H2O2，并通過過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物蛋白進一步將H2O2降解為氧和水，調節由線粒體和細胞質超氧化物誘導的氧化應激水平^［33］。Caspase-3是屬于Caspase家族的一種蛋白酶，能夠特異性的剪切多聚ADP核糖聚合酶和乙酰基-DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素，活化蛋白水解作用，從而導致DNA裂解促進細胞凋亡^［34］。細胞凋亡和壞死通常伴隨著氧化應激^［35］，因此，當細胞受到氧化應激損傷時，通常會檢測到抗氧化活性指標（如：SOD和GPx）的降低和氧化應激活性指標（MDA和ROS）的增加^［36］。本試驗用H2O2、NaCl和高溫的最佳脅迫條件處理細胞后，與空白組和空載組相比，在CeyPRDX1過表達組中SOD1基因呈現顯著上調表達，而Caspase-3基因下調表達（圖7）。這表明，CeyPRDX1基因可能發揮轉錄調控功能，直接或間接調節抗氧化和細胞凋亡相關基因的表達，降低ROS，進而抵御氧化應激反應，但其詳細作用機制需要待進一步的研究。

PTEN是一種具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，通過多種相互作用在染色體穩定性和遺傳完整性中發揮關鍵作用，并拮抗磷脂酰肌醇3-激酶/蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）信號通路參與細胞的凋亡和壞死^［37-38］。氧化應激通過調節PTEN/PI3K/AKT通路來實現細胞損傷，該通路是在氧化應激過程中保護細胞存活的重要途徑^［39］。多項研究表明，當細胞受到氧化應激損傷時，產生的大量ROS可以激活PTEN，抑制PI3K/AKT通路的表達，從而導致細胞凋亡和壞死^［40-41］。PTEN水平與氧化應激損傷細胞的細胞活力下降、SOD酶活性降低、ROS和MDA水平升高相關^［42］。本研究發現，在H2O2、NaCl和高溫等脅迫條件下，空白組和空載組中ROS和MDA水平明顯高于CeyPRDX1過表達組和對照組（P＜0.001，圖 5和圖 6），PTEN和Caspase-3基因呈現明顯的上調表達，而SOD1基因下調表達（P＜0.001，圖 7）。可以看出，細胞在氧化應激過程中產生的大量ROS促進PTEN的表達，而上調表達的PTEN進一步促進Caspase-3的表達，從而增加細胞凋亡率。本研究結果與Jia等^［42］的研究報道相一致，此研究表明當PTEN的表達降低時，可以升高SOD和 CAT 的水平，降低ROS和MDA含量。PTEN的負調控可以顯著提高PI3K/AKT的表達水平，從而有效防止細胞凋亡或壞死的發生^［39］。本研究中，與空白組和空載組相比，在CeyPRDX1過表達的細胞中SOD1基因上調表達，而PTEN和Caspase-3基因下調表達（圖 7）。因此，推測在氧化應激條件下，CeyPRDX1的過表達可能通過促進SOD1基因的表達，加強細胞清除ROS的能力，并隨著ROS的減少，PTEN的表達受到抑制。PTEN的下調表達可能降低Caspase-3基因的表達，進一步降低細胞凋亡率。然而在CeyPRDX1過表達的細胞中，PTEN基因的下調表達是否通過激活PI3K/AKT通路并對其他凋亡相關基因表達產生影響需要進一步的研究。

4 結 論

本研究結果表明，在H2O2、NaCl和高溫等應激條件下，在細胞中過表達CeyPRDX1基因能夠有效降低氧化應激誘導的細胞損傷。其作用可能通過促進SOD1基因的表達，加強細胞清除ROS的能力，并隨著ROS的減少，PTEN的表達受到抑制。PTEN的下調表達可能降低Caspase-3基因的表達，進一步降低細胞凋亡率。本研究結果初步揭示了，CeyPRDX1基因在塔里木馬鹿適應極端干旱環境和耐受高鹽飲食的過程中可能起到保護細胞免受氧化應激損傷的作用。

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（編輯 郭云雁）