LncRNA 18850對豬流行性腹瀉病毒復制的影響

摘 要： 長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 bp且缺乏蛋白質編碼能力的RNA，已有研究表明lncRNA在病毒復制過程中具有重要的生物學作用。本研究分析了豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染細胞的lncRNA表達變化及其對PEDV復制的影響。轉錄組測序PEDV感染 Vero-E6細胞24h的樣品中lncRNA，構建lncRNA 18850過表達質粒，Western blot、qPCR以及TCID50等方法分析lncRNA 18850過表達對PEDV復制的影響，轉錄組測序分析lncRNA 18850過表達的Vero-E6細胞差異基因表達，生物信息學分析lncRNA 18850靶向基因及差異蛋白互作關系。結果顯示，PEDV感染Vero-E6細胞24和48 h lncRNA 18850的表達量均呈極顯著上升（Plt;0.01）；lncRNA 18850的過表達可顯著促進PEDV的復制（Plt;0.05）；LIF、IL11、EPHA2、CCND1、DUSP5、CCN2基因與lncRNA 18850存在靶向關系。PEDV感染可上調Vero-E6細胞內lncRNA 18850的表達，lncRNA 18850可能通過靶向調控多個基因而促進病毒的復制，本研究為深入探析PEDV的復制機制及潛在靶向治療策略提供了新的視角。

關鍵詞： 長鏈非編碼RNA；豬流行性腹瀉病毒；轉錄組測序；Apelin信號通路

中圖分類號：

S852.659.6"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1366-10

收稿日期：2024-04-17

基金項目：浙江省自然科學基金探索類項目（LY23C180003）；浙江省自然科學基金基礎公益項目（TGN24C180001）；金華市重點科技計劃項目（農業類）（2023-2-022）；浙江省領雁計劃項目（2023C02022）；農業農村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室開放課題項目（YDWS202210）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（202310341032）

作者簡介：余昕雅（1997-），女，浙江杭州人，碩士生，主要從事豬傳染性腹瀉病毒研究，E-mail： 1131440070@qq.com

*通信作者：王曉杜，主要從事動物病毒學研究，E-mail：xdwang@zafu.edu.cn；董婉玉，主要從冠狀病毒入侵及復制機理的研究，E-mail： wanyudong@zafu.edu.cn

Effect of lncRNA 18850 on Porcine Epidemic Diarrhea Virus Replication

YU" Xinya1， HE" Haijian2， WANG" Lei1， NI" Yuchen1， DU" Jing1， ZHOU" Yingshan1， DONG" Wanyu^1*， WANG" Xiaodu^1*

（1.Key Laboratory of Applied Biotechnology on Animal Science amp; Veterinary Medicine of

Zhejiang Province， Zhejiang Engineering Research Center for Veterinary Diagnostics amp; Advanced

Technology， Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary

Medicine and Health Management， China-Australia Joint Laboratory for Animal Health Big

Data Analytics， Belt and Road International Joint Laboratory for One Health and Food Safety，

College of Veterinary Medicine of Zhejiang Aamp;F University， Hangzhou 311300， China;

2.Agriculture College， Jinhua University of Vocational Technology， Jinhua 321017， China）

Abstract：" Long-stranded non-coding RNAs （lncRNAs） are a class of RNAs longer than 200 bp that lack protein-coding ability. lncRNAs have been shown to play important biological roles in viral replication. This study analyzed changes of lncRNAs in cells infected with porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） and their effect on PEDV replication. Transcriptome sequencing was performed on Vero-E6 cells infected with PEDV at different time points. lncRNA 18850 was selected， and its overexpression plasmid was constructed. The effects of lncRNA 18850 overexpression on PEDV replication in Vero-E6 cells were analyzed by Western blot， qPCR and TCID50 methods. Transcriptome sequencing was also used to detect gene changes in Vero-E6 cells overexpressing lncRNA 18850， as well as lncRNA 18850 target genes and differential protein interactions. The results showed that the expression of multiple lncRNAs in PEDV-infected Vero-E6 cells changed significantly， especially the expression of lncRNA 18850， which showed an upward trend at both 24 and 48 hours after viral infection. Overexpression of lncRNA 18850 significantly promoted the replication of PEDV compared with the control group. The genes LIF， IL11， EPHA2， CCND1， DUSP5， and CCN2 in Vero-E6 cells have target relationships with lncRNA 18850. The findings indicate that PEDV infection upregulates the expression of lncRNA 18850 in Vero-E6 cells， and lncRNA 18850 may promote viral replication by regulating multiple target genes， providing new perspectives and insights for a deeper understanding of the replication mechanism of PEDV as well as for exploring the potential therapeutic strategies against it.

Keywords： long non-coding RNA; porcine epidemic diarrhea virus; RNA-seq; apelin signaling pathway

*Corresponding authors：" WANG Xiaodu， E-mail： xdwang@zafu.edu.cn; DONG Wanyu， E-mail： wanyudong@zafu.edu.cn

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，主要通過糞口途徑傳播，近年來也被發現可以通過空氣傳播感染鼻黏膜。不同日齡豬對PEDV均易感，其臨床癥狀表現出明顯的年齡差異，七日齡以下的仔豬臨床癥狀尤為嚴重，出現嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀，死亡率可達100%^［1］。PEDV在全球均有流行，據報道，我國29個省的腹瀉豬群樣品中近一半檢出PEDV陽性，可見該病在我國傳播之廣，危害之深^［2］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度超過200 bp，不編碼蛋白質的RNA，在全基因組中所占數量遠超編碼蛋白質的mRNA。lncRNA與mRNA都由RNA聚合酶II轉錄，具有相似的進化保守性。雖然不編碼蛋白質，但近年來研究發現，lncRNA可通過多種方式調控編碼基因的表達，在細胞生命活動、病毒感染、疾病發生發展進程等生命活動中調控各種信號通路中關鍵基因的表達^［3］。

隨著研究的深入，lncRNA被發現在抗病毒的先天免疫中起到關鍵調控作用，其通過多種方式調控炎性細胞因子信號通路的基因表達。例如lncRNA NKILA通過形成NF-κB/IκB-NKILA穩定復合物，抑制乙型肝炎病毒（HBV）感染導致的IκB磷酸化和NF-κB活化，進一步調控炎癥反應和細胞凋亡的發生^［4］；甲型流感病毒（IAV）感染上調宿主細胞lncRNA MxA，其通過與干擾素β（IFN-β）啟動子片段形成RNA-DNA三聯體，使IFN-β的轉錄激活受阻，抑制視黃酸（維甲酸）誘導基因蛋白I（RIG-I）受體介導的抗病毒免疫反應^［5］。此外，有研究表明流感病毒蛋白還可以通過與宿主或自身基因組中的lncRNA結合，直接調控病毒復制，如流感病毒感染會導致宿主細胞lncRNA PAAN表達上調，lncRNA PAAN與病毒的PA蛋白結合從而促進病毒RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）的活性，促進病毒復制^［6］；lncRNA IPAN與病毒蛋白PB1結合，抑制PB1降解從而調控病毒復制。因此，宿主lncRNA可以直接被病毒利用，拮抗宿主細胞抗病毒反應^［7］。

盡管關于lncRNA的研究逐漸深入，但PEDV感染過程中lncRNA調控的相關機制研究仍然較少。Qin等學者^［8］分析了PEDV感染仔豬7 d后8 386個差異表達的lncRNA，感染死亡組與未感染組相比有2 797個lncRNA顯著變化，感染后死亡組和感染后未死亡組相比有397個lncRNA顯著變化。PEDV感染仔豬腸道上皮細胞中lncRNA 446顯著上調，其與ALG-2相互作用蛋白X（Alix）結合，抑制了E3泛素化連接酶TRIM25介導的Alix泛素化降解，參與腸道上皮細胞的緊密連接調控，從而修復PEDV感染后的腸道屏障損傷^［9］。為了進一步挖掘PEDV感染過程中參與調節的lncRNA，本研究利用高通量轉錄組測序技術篩選出PEDV感染后差異表達的lncRNA 18850，研究其對PEDV復制的調控作用，并分析了lncRNA 18850調控宿主細胞內基因的靶向關系，為進一步研究PEDV感染宿主的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、抗體、質粒

Vero-E6細胞購自上海細胞庫，用含10% FBS的DMEM（Gibco）于37 ℃、5% CO2條件下培養。PEDV毒株2017/YJH/F25由本實驗室分離保存，接種細胞后用含5 μg·mL^-1胰酶的DMEM維持。Mouse抗PEDV-N抗體由本實驗室制備，β-actin、Flag抗體購自Abclonal。Goat-anti-Rabbit、Goat-anti-Mouse二抗購自JACKSON。pcDNA3.1質粒由本實驗室保存。

1.2 實時熒光定量PCR分析

用TRIzol（賽默飛）提取細胞總RNA，用試劑盒HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect（諾唯贊）進行逆轉錄。引物使用NCBI設計，所有引物均驗證其熔解曲線R2為0.99，由浙江有康生物科技有限公司合成。實時熒光定量PCR程序為：預變性95 ℃ 30 s；循環反應95 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環40次。以2^-ΔΔCt計算靶基因表達水平，數據歸一化處理內參為GAPDH，結果使用GraphPad Prism 8進行分析。引物序列見表1。

1.3 lncRNA 18850過表達載體的構建與轉染

用Snapgene4.1.9設計PCR引物，從Vero-E6細胞中擴增lncRNA 18850全長，利用酶切酶連法將全長構建到pcDNA3.1質粒中。使用jetPRIME（ployplus）將pcDNA3.1- lncRNA 18850過表達及空載體質粒轉染到Vero-E6細胞中。

1.4 TCID50測定

將Vero-E6細胞鋪于96孔細胞板中，待其生長至單層后，將病毒液以10^-1～10^-10的比例進行梯度稀釋并依次接種至細胞中（100 μL·孔^-1），一個稀釋比進行8個生物學重復。于37℃、5% CO2條件下培養，5 d后觀察并記錄細胞病變（CPE）情況。使用Reed-Muench方法計算TCID50。

1.5 Western blot檢測

用含蛋白酶抑制劑（Bimake）的RIPA裂解液裂解細胞，BCA試劑盒（碧云天）檢測上清蛋白濃度后加入4×loading進行處理，95 ℃加熱變性10 min，立即使用或于-80 ℃保存。SDS-PAGE用于分離樣品，后轉移到硝化纖維素濾膜（MILLIPORE）上。使用5%脫脂奶粉（Sangon Biotech）封閉1 h，一抗孵育1 h，二抗孵育1 h，更換抗體時使用TBST清洗，加入底物在化學發光儀器進行曝光。結果使用ImageJ進行灰度分析。

1.6 轉錄組分析

PEDV感染Vero-E6細胞后lncRNA變化的轉錄組測序服務來自上海歐易生物醫學科技有限公司。Vero-E6細胞中lncRNA 18850過表達后基因變化的轉錄組測序服務來自于杭州聯川生物技術股份有限公司。皮爾森法（pearson）分析基因共表達，篩選條件為lncRNA與mRNA表達量變化相關系數不低于0.8且存在顯著差異（Plt;0.05）。RIsearch-2.0進行Trans分析，篩選條件為lncRNA和mRNA核酸直接互作堿基數不少于10個，堿基結合自由能不大于-209.29 kJ·mol^-1。

1.7 統計分析

所有數據用GraphPad Prism 8進行統計分析，每組進行三次生物學重復，差異分析方法使用t檢驗（雙尾），Plt;0.05為顯著性差異，Plt;0.01為極顯著差異。

2 結 果

2.1 PEDV感染顯著上調lncRNA 18850表達

將感染PEDV（0.01MOI）不同時間點的Vero-E6細胞進行轉錄組測序，共篩選和分析了10 621個lncRNA，結果發現在病毒感染24 h時差異表達的lncRNA中有40個上調，54個下調；48 h時有34個上調，43個下調（圖1 A、B）。其中表達差異顯著性前十的lncRNA為lncRNA 2 694.1、lncRNA 3 977.1、lncRNA 15720、lncRNA 18325、lncRNA 18785、lncRNA 18850、lncRNA 19918、lncRNA 22604、lncRNA 28431、lncRNA 31733（圖1 C）。以表達量（FPKM）大于0.1、試驗組與對照組表達變化在2倍以上為條件進行進一步篩選，韋恩圖結果顯示lncRNA 18850在PEDV感染不同時間點時均滿足以上條件（圖1 D）。通過qPCR檢測PEDV感染后Vero-E6細胞中lncRNA 18850變化，結果顯示其表達上升，與轉錄組測序結果一致（圖1 E）。因此，PEDV感染Vero-E6細胞lncRNA 18850的表達水平極顯著上調（Plt;0.01）

2.2 過表達lncRNA 18850顯著促進PEDV復制

為了進一步探究lncRNA 18850對PEDV復制的影響，本研究構建了pcDNA3.1-lncRNA 18850質粒并轉染至Vero-E6細胞，qPCR結果顯示，lncRNA 18850在Vero-E6細胞中的表達量顯著性升高，且轉染后24 h仍有較高的表達水平（圖2 A）。在Vero-E6細胞中分別轉染pcDNA3.1空載和pcDNA3.1-lncRNA 18850質粒，12 h后感染PEDV（0.01 MOI），病毒感染24 h后收取樣品。間接免疫熒光、Western blot、qPCR、TCID50結果顯示，與空載體對照組相比，lncRNA 18850過表達組的CPE顯著加劇，病毒滴度上升，細胞中PEDV N蛋白表達量及mRNA水平均上升（圖2 B～G）。這些結果表明lncRNA 18850過表達能促進PEDV的復制。

2.3 lncRNA 18850調控多條信號通路及基因

2.3.1 lncRNA 18850過表達后的基因差異表達

為了進一步探究lncRNA 18850調控病毒復制的機制，將lncRNA 18850過表達的Vero-E6細胞進行轉錄組測序分析，差異表達聚類分析結果顯示，與對照組相比，lncRNA 18850過表達24 h后有72個基因上調，7個基因下調（圖3 A、B）。差異基因火山圖結果表明TFPI2、ITGA7等基因表達差異顯著（圖3 C，標注了顯著性差異表達前20的基因）。

2.3.2 qPCR驗證差異表達的mRNA

根據基因的表達量（FPKM＞0.1）及表達差異性篩選出7個差異顯著基因（TFPI2、NOTCH3、CXCL8、PTN、RRAD、CCN2、ITGA7），qPCR檢測結果表明，相比對照組，lncRNA 18850過表達組的NOTCH3并無顯著變化，而TFPI2、CXCL8、PTN、RRAD、CCN2、ITGA7表達均上調表達（圖3 D、E），其中CCN2變化差異極顯著（Plt;0.001）。

2.3.3 KEGG富集分析

KEGG富集分析顯示，差異表達的基因主要富集在環境信息處理和人類疾病分類中，值得關注的是富集基因數排名第五的通路為冠狀病毒疾病COVID-19相關通路（圖4 A）。進一步分析P值最小的前20個KEGG通路，可以看出變化的基因主要集中在Apelin信號通路中（圖4 B）。

2.3.4 lncRNA和mRNA共表達分析與trans分析

從表達差異顯著的基因中篩選與lncRNA 18850存在共表達與直接調控的基因（圖4 C）。結果顯示共有108個差異表達的基因與lncRNA 18850存在共表達和直接調控關系。

2.3.5 差異基因蛋白互作網絡分析

使用STRING蛋白質互作數據庫進行差異基因蛋白互作網絡分析，可以發現與lncRNA 18850存在靶向關系的基因之間存在蛋白互作關系，根據功能選擇了LIF、IL11、EPHA2、CCND1、DUSP5、CCN2進行進一步討論（圖4 C）。

3 討 論

lncRNA作為不編碼蛋白的RNA分子，最初被認為是基因組轉錄的“噪音”。越來越多研究表明，lncRNA作為信號、誘餌、引導或支架幾乎能參與基因表達調控的每一步，包括劑量補償、印跡、表觀遺傳調控、轉錄、mRNA剪接和翻譯等，也是病毒與宿主相互作用過程中的重要調節因子^［10］。一方面，某些病毒可自身表達lncRNA，如卡波濟氏肉瘤病毒（KSHV）編碼的lncRNA PAN，可調節KSHV復制、病毒和宿主基因表達以及免疫反應^［11-12］。另一方面，病毒感染也可誘導宿主細胞內的多種lncRNA表達，如寨卡病毒（ZIKV）感染人類神經前體細胞（hNPC）后149個lncRNA差異表達，參與調控細胞周期、細胞凋亡、免疫反應和基因表達相關的多條信號通路^［13］。一項關于PEDV的研究發現，lncRNA 446抑制PEDV感染細胞內Alix的泛素化降解，調控上皮細胞緊密連接的完整性，并可能修復PEDV感染后腸屏障的損傷^［8］。總之，lncRNA越來越成為病毒與宿主相互作用機制研究的熱點。自2010年以來，PEDV變異毒株（PEDV GII）暴發給全球養殖業造成了巨大的經濟損失，而PEDV的感染機制更亟待闡明。本研究利用轉錄組測序篩選出了PEDV感染的Vero-E6細胞中多個差異表達lncRNA，PEDV感染24 h時40個上調，54個下調；感染48 h時34個上調，43個下調。lncRNA 18850是PEDV感染宿主細胞表達水平較高的lncRNA之一，lncRNA 18850過表達可以顯著增加Vero-E6細胞內PEDV N蛋白表達量及其基因的表達水平，提高了病毒滴度，加劇PEDV誘導的CPE。lncRNA 18850過表達可調控多個基因表達（72個上調、7個下調），如CCN2、TFPI2、CXCL8、PTN、RRAD、ITGA7等。因此，lncRNA 18850調控宿主基因的表達參與了PEDV復制。

PEDV與COVID-19同屬于冠狀病毒科，lncRNA 18850過表達參與調控冠狀病毒疾病COVID-19相關通路、Apelin信號通路。Apelin是一種內源性神經肽，與G蛋白偶聯受體（APJ）結合，參與心臟、肺和其他外周器官的各種生理過程。Park等學者^［14］研究發現，Apelin直接與血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合抑制SARS-CoV-2感染，同時激活Apelin/APJ信號可以恢復因病毒感染而受損的肺部。轉錄組trans分析表明CCN2、LIF、IL11、EPHA2、CCND1和DUSP5等可能是lncRNA 18850調控PEDV復制的潛在候選靶點。CCN2又稱為結締組織生長因子（CTGF），參與Apelin信號通路而調節結締組織纖維化^［15］。CCN2也可通過增強促炎因子的產生和免疫細胞的遷移來促進炎癥反應^［16］。有研究表明，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）的NSP1通過阻斷豬巨噬細胞中的ERK-AP-1軸抑制CCN1和CCN2的產生，進而發揮抗炎作用^［17］。CCN2和INHBA可增強TGFβ誘導的Smad3磷酸化水平^［18］，后者已被證實可與SARS-CoV-2 N蛋白結合，通過Smad3依賴性G1細胞周期阻滯機制誘導急性腎損傷（AKI），有望成為治療COVID-19相關AKI的新靶點^［19］。lncRNA 18850過表達可上調CCN2和INHBA的表達，lncRNA 18850是否通過Smad3信號通路參與PEDV復制還有待進一步的驗證。其他多個候選靶點參與調控細胞抗病毒免疫反應相關通路，CCND1被認為是細胞周期調控的關鍵因子，下調CCND1會導致細胞周期停滯在G1期并誘導細胞凋亡，并受到NF-κB信號通路調控^［20］；LIF和IL-11都是白細胞介素6（IL-6）細胞因子家族中的成員，可被激活并調控JAK1/STAT3信號通路^［21-22］，而DUSP5則對IL-1β誘導的NF-κB信號通路激活起到負調節作用^［23］；EPHA2也被證明可以調控STAT3和MAPK通路，可增強炎性細胞因子的釋放，調控細胞凋亡^［24-26］。NF-κB、JAK1/STAT3等信號通路在PEDV感染過程中都發揮重要作用，其受到PEDV感染調控，同時也可以調控PEDV的復制^［27-28］。NF-κB等信號通路的激活常與PEDV和豬傳染性胃腸炎病毒TGEV等冠狀病毒感染引起細胞凋亡有關^［29-30］。細胞凋亡是機體抗病毒免疫的手段之一，細胞利用凋亡抑制病毒的復制、繁殖和擴散傳播，而病毒可以反向利用細胞凋亡促進自身復制。例如宿主細胞凋亡信號引發的caspase級聯反應特異性催化裂解SARS-CoV-2的核殼蛋白，產生具有拮抗干擾素作用的片段，進而抑制干擾素效應因子功能，達到促進病毒復制的作用^［31］。該機制同樣存在于SARS-CoV-1和MERS-CoV感染過程中，表明冠狀病毒具有逃逸宿主先天免疫反應的應對機制。

4 結 論

PEDV感染可上調Vero-E6細胞lncRNA 18850的表達，lncRNA 18850過表達能促進PEDV復制，CCN2、LIF、IL11、EPHA2、CCND1和DUSP5等可能是lncRNA 18850潛在靶點，可參與細胞凋亡和免疫反應等PEDV感染的生物學過程，但其具體機制還有待進一步深入研究。

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（編輯 白永平）