沉積物對普通小球藻生長影響的模擬實驗研究

摘要：為了揭示沉積物條件對普通小球藻生長的影響，采用純石英砂模擬水體沉積物，用正交實驗法分析了擾動速率、固液比和沉積物粒徑等3種因素對普通小球藻生長的影響。結果表明：① 擾動速率和固液比在0.05水平上對普通小球藻生物量均具有顯著性影響，擾動速率和粒徑在0.05水平上對普通小球藻特定生長率均具有顯著性影響。② 影響普通小球藻生物量達到最大的沉積物條件為100 r/min擾動速率、250 g/L固液比和10～20目粒徑，影響普通小球藻生物量達到最小的沉積物條件為50 r/min擾動速率、125 g/L固液比和30～40目粒徑。在一定的擾動速率下，粒徑和固液比可能對特定生長率存在較強交互作用影響。③ SEM顯示較強的擾動速率能使普通小球藻外在形態橢圓化，并對生物量的增長產生影響。因此，研究認為可以試圖通過改變水體擾動速率、固液比和沉積物粒徑等沉積物條件實現對普通小球藻生長的宏觀調控。

關 鍵 詞：普通小球藻； 生物量； 擾動速率； 固液比； 沉積物粒徑； 正交實驗

中圖法分類號： Q945 文獻標志碼： A

DOI：10.16232/j.cnki.1001-4179.2025.03.010

0 引 言

水體富營養化會造成藻類大量繁殖、水生植物擴散、氧氣耗盡和關鍵物種喪失，導致淡水生態系統持續性退化。普通小球藻（Chlorella vulgaris）是一種生長過程中幾乎無毒素分泌的3～8 μm綠藻，因對N/P具有較強的吸附（通過基團吸附在細胞表面）和吸收（通過營養獲取吸收進體內合成蛋白）常被用于富營養化水體的治理，其生物量濃度在水體治理過程中起到決定性作用。對于水體中普通小球藻的生長過程，研究多集中在溶解氧、pH、營養物質和光照等化學性質因素的影響上［1-5］。然而，水體中還有多種物理因素也會對普通小球藻的生長產生影響。

許多研究關注水動力條件對藻生長、絮凝等方面的影響［6］。如Yu等研究表明，水體中湍流和水深特征能夠反映優勢藻類的分布規律［7］，湖泊和水庫由于流速慢，沖洗時間長和自清潔能力低等因素使得水華更容易發生［8］。Long 等研究結果表明，水流流速在0.04 m/s左右最有利于藻類生長［9］。也有研究發現與靜態水相比，適度的湍流能夠促進藻類細胞的能量代謝和養分吸收，適度的剪切應力能降低藻細胞的氧化水平，改善藻細胞的形態。Sawant 等研究表明適度湍流和較強的對流，能維持生物質懸浮狀態［10］。從已有的研究來看，水動力條件對藻類生長有三方面的促進作用：低流速促進藻類生長；適當的剪切應力增加藻類產量和促進代謝；適度湍流增加藻類細胞的養分吸收。這些研究都為藻類生長的環境物理效應提供了基本參考。另外，在大部分水域，干季和濕季之間水流量的變化與流速的巨大差異都可能會改變普通小球藻對養分的利用效率，從而影響生物量的變化［11-12］。同時，這些條件能間接引起微生物和水之間的化學相互作用。

目前，普通小球藻在大規模實際應用上面臨宏觀控制其生物量變化的難題，且依靠改變光照強度、營養物質、水體pH等化學性質因素控制其生長的難度較大［3-4］。如在污染嚴重的流域和水庫控制其生物量增長難度大，使用化學藥品成本高、生態負影響大等，超量增殖的普通小球藻又難以回收并影響水體透光性。因此，為了避免富營養化水體的治理引發人為藻華，在流域水體中實現對普通小球藻的宏觀調控變得尤為重要，亟需探索較為經濟和易實現的普通小球藻生物量宏觀控制方法。通過水體擾動速率、固液比和沉積物粒徑等物理性質因素調控普通小球藻的生長，有利于普通小球藻應用于流域等大區域的富營養化治理，然而，水體擾動速率、固液比和沉積物粒徑等物理性質因素對普通小球藻增殖方面的影響機制還不清楚。

為了揭示水體擾動速率、固液比和沉積物粒徑等沉積物條件對普通小球藻生長的影響，本次研究采用正交實驗法，利用純石英砂模擬水體沉積物，研究了擾動速率、固液比和沉積物粒徑等3種物理性質因素對普通小球藻生物量和特定生長率的影響。通過ANOVA和極差分析法研究擾動速率、固液比和沉積物粒徑分別對普通小球藻生物量和特定生長率的影響，揭示水體物理性質因素對普通小球藻生長的影響作用，為實現通過擾動速率、固液比和沉積物粒徑宏觀調控普通小球藻在富營養化水體治理中的應用提供建議。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

儀器和設備：恒溫光照振蕩培養箱（HT Multitron，Infors）；安裝式生物光學顯微鏡（DM2000）；葉綠素熒光計（Aquafluor 805186）；離心機（TGL-16 G）；紫外分光光度計（Evolution 300）；高溫高壓滅菌鍋（mLS-3780）；pH計（PB-21）；標準篩；電子分析天平（JA3003N）；Mili-Q超純水機；稱量紙（75 mm×75 mm）；250 mL錐形瓶；可調量程移液槍（1，5，10 mL）；移液管（20，50，100 mL）；0.45 μm濾膜；500 mL聚乙烯尖嘴塑料瓶；量筒；容量瓶。

材料：5～7目、10～20目和30～40目的石英砂；無菌普通小球藻藻種（來自中國科學院淡水藻種庫）；BG-11標準培養基；300目軟篩網；250 mL錐形瓶；橡膠軟管。

1.2 實驗設計

石英砂的準備。用篩網分別篩出5～7，10～20，30～40目的石英砂，分離后分別用1 mol/L的H2O2和HCl溶液清洗3次，第4次用超純水沖洗，然后置于烘干箱烘干，烘干后分別裝于干燥玻璃瓶中待用。

實驗普通小球藻的準備。配置4L BG-11標準培養基待用。取200 mL穩定期普通小球藻置于離心機（10 ℃，5 000 r/min）中離心5 min，離心完畢倒掉上清液，用新制的培養基均勻分散細胞團聚塊于4L BG-11培養基中，用1 mol/L HCl或NaOH調節pH至7，測量新培養基中的生物量濃度，并預留待用。

影響因素參數設置。實驗中3個影響因素分別是擾動速率、沉積物粒徑和固液比，三因素的水平設定分別為擾動速率（50，100，150 r/min）、沉積物粒徑（5～7，10～20，30～40目）和固液比（5 g/200 mL=25 g/L，25 g/200 mL=125 g/L，50 g/200 mL=250 g/L）。以黃河流域水環境泥沙含量0.5～24 kg/m3（即0.5～24 g/L）作為最小參數設置［13］，實驗以25 g/L作為最小固液比，125 g/L和250 g/L作為增大變化量因素。固液比選取的固體粒徑對應了每組實驗的粒徑因素水平。為了盡可能模擬河流沉積物，實驗中粒徑參數設置參考了SL 42—2010《河流泥沙顆粒分析規程》［14］，其中5～7目（即2.8～4.0 mm）屬于礫石，10～20目（即1～2" mm）和30～40目（0.425～0.6 mm）屬于砂粒，故分別用這3種粒徑混合模擬河流沉積物。

實驗過程。實驗根據表1中經典正交分布點開展，同時由擾動速率的3個水平分三批次進行。以擾動速率為50 r/min的批次為例，用電子天平分別稱量5，25 g 和50 g的5～7，10～20目和30～40目的石英砂于6個250 mL錐形瓶中（其中3個為平行樣）待用，另準備一組對比空白樣2個（純普通小球藻細胞懸浮液），此批次實驗錐形瓶共計8個。然后用200 mL量筒分別取待用的普通小球藻細胞懸浮液200 mL于實驗錐形瓶中。測定初始生物量之后將所用實驗錐形瓶置于恒溫光照振蕩培養箱（HT Multitron，Infors），并調節光照度為2 000 lux，12 h/12 h晝/夜，溫度為25 ℃。實驗周期為7 d，從開始實驗的時間點算起，每天在相同的時間點測量普通小球藻生物量和特定生長率。第二批次（100 r/min）和第三批次（150 r/min）的實驗過程均與第一批次相同。額外增加實驗的對照組，其條件設置是去除擾動速率、沉積物粒徑和固液比等因素的相同培養條件，同樣有3個平行樣品。

1.3 測試與分析

通過正交實驗助手輔助設計實驗，分析測試采用分光光度計獲得小球藻微生物量濃度，為減小實驗誤差，每個實驗樣品的3個平行樣本均通過一致性操作。在統計分析方面以單因素方差分析對普通小球藻生長的影響因素開展檢驗。用掃描電鏡觀察普通小球藻細胞形態。實驗中擾動條件會造成已經絮凝沉降的普通小球藻細胞二次懸浮，這包含了擾動造成再次懸浮的生物量變化，并影響普通小球藻生物量濃度，為統一所有實驗生物量的測量，每次取樣均采用吸管吸取實驗錐形瓶中部樣品1 mL用于測量普通小球藻生物量。

（1） 生物量測定方法。在鏡下細胞計數框內計數，并用分光光度計測定吸光度后建立線性關系，其線性關系見式（1）。

式中：B為生物量，cell/mL;OD680表示分光光度計最大吸收波長為680 nm時的吸光度。

（2） 特定生長率的計算方法。特定生長率通過生物量和培養時間計算［15］，計算公式為

式中：S為特定生長率；X為普通小球藻在時間T的生物量濃度，1和2分別表示開始取樣時間和結束取樣時間。

2 實驗結果

2.1 普通小球藻生物量變化

水體擾動是河流和湖泊運移營養物質的動力之一，它能通過影響水體中營養物質遷移和微生物吸收的效率直接或間接地影響普通小球藻的生長［16-17］。水體中的懸浮普通小球藻細胞相對于河流沉積物而言是一個動態過程，因此沉積物顆粒粒徑的大小可能會對養分的吸收或藻類的增殖產生限制性作用，而固液比在一定程度上能夠促進或阻礙這一變化過程。在相同的化學條件（光照、pH、初始生物量和養分等）下，物理性質條件的不同組合可能會導致普通小球藻生物量上的較大差異。

正交實驗中，普通小球藻生物量變化如圖1所示。綜合圖1可以發現擾動速率、固液比和沉積物粒徑分別在150 r/min，250 g/L和5～7目時達到了普通小球藻生物量最大值，并且擾動速率、固液比和沉積物粒徑分別在150 r/min，125 g/L，30～40目時，達到了正交實驗中普通小球藻生物量最小，二者同時發生在擾動速率為150 r/min 的圖1（c）中。然而，從對照樣純普通小球藻的變化來看，生物量是隨著擾動速率的加強而升高的，這也說明了相同擾動速率條件下，沉積物粒徑和固液比對普通小球藻生長的潛在影響。

2.1.1 ANOVA分析

ANOVA分析用于兩個及兩個以上樣本均數差別的顯著性檢驗。表2是正交實驗中擾動速率、固液比和沉積物粒徑三因素影響普通小球藻生物量的ANOVA分析結果。從分析結果可以看出擾動速率和固液比對普通小球藻生物量的影響在0.05水平上是顯著的，即擾動速率和固液比對普通小球藻生物量的顯著性影響有95%的把握。

2.1.2 極差分析

極差Rj表示統計數據的變異范圍和離散程度，是其最大值與最小值之間的差距。在統計中常用極差來刻畫一組數據的離散程度，反映的是變量分布的變異范圍和離散幅度，在總體中任何兩個單位的標準值之差都不能超過極差。同時，它能體現一組數據波動的范圍。極差越大，離散程度越大，反之，離散程度越小。Rj越大，表示該影響因素在m水平上越重要。Rj由公式（3）計算得出，但Rj分析的缺點是不能確定出現區別的指標或實驗誤差，可以通過平行樣本進行均值化來盡可能消除這些誤差。

式中：Kj1，Kj2，Kj3分別表示第j個因素在第1水平、第2水平、第3水平對應的實驗指標；max（Kj1，Kj2，Kj3）和min（Kj1，Kj2，Kj3）分別表示3個指標中的最大值和最小值。

表3為正交實驗中三因素擾動速率、固液比和沉積物粒徑對普通小球藻生物量正交結果的平均值和極差Rj。根據Rj判斷三因素對普通小球藻生物量在m水平上的影響程度。根據初始生物量B0為4.17×105 cell/mL，由表3可以看出，影響因子擾動速率和固液比的Rj均反映出比較大的離散度，影響因子粒徑的Rj則反映出相對較小的離散度，因此擾動速率和固液比對生物量的影響是更加明顯的。從表3可以看出擾動速率、固液比和沉積物粒徑三因素在各水平的最高值分別為K12，K23和K32，可預測影響普通小球藻生物量的優勢條件為100 r/min，250 g/L和10～20目，這意味著在實際水域中可宏觀模擬沉積物條件促使普通小球藻生物量最大化，達到水處理最優效果。擾動速率、固液比和沉積物粒徑三因素在各水平的最低值分別為K11，K22和K33，可預測影響普通小球藻生物量的優勢條件為50 r/min，125 g/L和30～40目，在實際水域中水污染較輕的情況下，可宏觀模擬此水體沉積物條件促使普通小球藻生物量最小化。

2.2 特定生長率的變化

特定生長率越大，表示普通小球藻在生長過程中的增殖速率越快。普通小球藻特定生長率變化如圖2所示。由圖2可以發現，擾動速率、固液比和沉積物粒徑分別在150 r/min，250 g/L和5～7目時，普通小球藻特定生長率最高；在擾動速率、固液比和沉積物粒徑分別為150 r/min，125 g/L和30～40目時，普通小球藻特定生長率最低，二者同時發生在擾動速率為150 r/min時，這可能是因為固液比和沉積物粒徑對普通小球藻特定生長率存在較強的交互作用。從整體上看，特定生長率隨著擾動速率的增強而升高。結合圖1（c）能看出擾動速率、固液比和沉積物粒徑分別在150 r/min，125 g/L和30～40目時，生物量濃度小于對照組純藻，這說明適度水平下的三因素組合是影響生物量增長的關鍵，并非影響因素參數值越高越有利于普通小球藻的生長。尤其在擾動速率較強的環境下，普通小球藻細胞的懸浮狀和周邊的營養物質流動增強，這可能放大固液比和沉積物粒徑的影響。

2.2.1 ANOVA分析

表4是擾動速率、固液比和沉積物粒徑三因素對普通小球藻特定生長率影響的ANOVA分析。從分析結果可以看出擾動速率和粒徑對普通小球藻特定生長率在0.05水平上的影響是顯著的，即擾動速率和沉積物粒徑對普通小球藻特定生長率的顯著性影響有95%的把握。

2.2.2 極差分析

表5為正交實驗中三因素對普通小球藻特定生長率的正交結果的平均值和極差Rj。由表5可以看出，影響因子擾動速率和固液比的Rj均反映出比較大的離散度，影響因子沉積物粒徑的Rj則是相對較小的離散度，因此，擾動速率和固液比對普通小球藻特定生長率的影響是相對明顯的。另外，通過Kjm可以判斷影響普通小球藻特定生長率的3個因素優勢條件分別為150 r/min，250 g/L和5～7目。

2.3 SEM分析

在實際流域中，湍流、渦流、對流等水體擾動隨著豐水季和枯水季有較強或較弱的表現，這也會影響水體中藻的生長。為了探究擾動速率對普通小球藻形態的影響，對最終樣品進行掃描電鏡分析。圖3是普通小球藻在不同擾動速率下的SEM形態。可以觀察到150 r/min的擾動速率下，普通小球藻外在形態發生明顯變形，并呈現橢圓形，而50，100 r/min的擾動速率下并沒有發現明顯的外在形態變化。這意味著較強的擾動速率能夠通過改變普通小球藻外在形態而影響其自身生長。同樣，這也可能會通過改變其對營養物質的吸收效率而影響生物量生產。

3 結 論

為揭示水體沉積物條件對普通小球藻生長的影響作用，研究利用純石英砂模擬河流沉積物，研究了擾動速率、固液比和沉積物粒徑等物理性質因素對普通小球藻生物量和特定生長率的影響，發現水體擾動速率和固液比對普通小球藻生物量增長具有顯著影響，擾動速率和沉積物粒徑對普通小球藻特定生長率具有顯著影響。這對通過調節擾動速率、固液比和沉積物粒徑從而有效調控普通小球藻生長提供了科學依據。結果表明在相同擾動速率下，固液比和沉積物粒徑的交互作用可能對普通小球藻的生長存在較強影響。通過極差分析可知，影響普通小球藻生物量的優勢條件為100 r/min擾動速率、250 g/L固液比和10～20目粒徑，影響普通小球藻特定生長率的優勢條件分別為150 r/min擾動速率、250 g/L固液比和5～7目粒徑。本研究缺乏三因素的交互作用分析，并且影響因素水平有限，因此，優勢條件可能存在誤差。SEM分析發現較強的擾動速率能夠改變普通小球藻的細胞形態，這對其吸收營養物質和效率會產生直接或間接性影響，進而影響普通小球藻生長。因此，利用擾動速率、固液比和沉積物粒徑等水體條件對普通小球藻生長進行宏觀調控是可行的，與調節營養物質、水體pH、微量元素等因素相比更具有經濟性，未來也可考慮通過化學性質條件和水體物理性質條件共同調控流域微藻的生長，以達到微藻精確調控的理想狀態。與實際流域水環境相比，小型實驗模擬由于誤差等影響會有差異，因此，在實際環境下的應用有待進一步驗證及優化。

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（編輯：黃文晉）

Simulated test study on effect of sediment on growth of Chlorella vulgaris

HE Lile ZHU Xiaoxue3，ZHANG Zhenhua1，2

（1.Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota，Northwest Institute of Plateau Biology of" Chinese Academy of Science，Xining 810008，China； 2.Qinghai Haibei National Field Research Station of Alpine Grassland Ecosystem，Northwest Institute of Plateau Biology of Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China； 3.School of Biology Resources and Food Engineering，Qujing Normal University，Qujing 655011，China）

Abstract： In order to reveal the influence of water sediment conditions on growth of Chlorella vulgaris，pure quartz sand was used to simulate water sediments，and the orthogonal experimental method was used to analyze effects of disturbance rate，solid-liquid ratio，and sediment particle size on the growth of Chlorella vulgaris.The results showed that：① the disturbance rate and solid-liquid ratio had significant effects on the biomass of Chlorella vulgaris at a level of 0.05，and the disturbance rate and particle size had significant effects on the specific growth rate of Chlorella vulgaris at a level of 0.05.② The dominant conditions affecting the maximum biomass of Chlorella vulgaris were disturbance rate of 100 r/min，solid-liquid ratio of 250 g/L，particle size of 10～20 mesh.The dominant conditions affecting the minimum biomass of Chlorella vulgaris were disturbance rate of 50 r/min，solid-liquid ratio of 125 g/L，particle size of 30～40 mesh.Particle size and solid-liquid ratio may have a strong interaction effect on specific growth rate at a certain disturbance rate.③ SEM showed that a strong disturbance rate could make the external morphology of Chlorella vulgaris elliptical，which would have an impact on the growth of biomass.Therefore，changing water sediment conditions such as disturbance rate，solid-liquid ratio，and sediment size is suggested for macro-control of Chlorella vulgaris growth.

Key words： Chlorella vulgaris； biomass； disturbance rate； solid-liquid ratio； sediment particle size； orthogonal experiment

收稿日期：2023-05-06 ；接受日期：2024-01-23

基金項目：云南省基礎研究計劃項目-青年項目（2019FD105）；中科院-青海省三江源國家公園聯合研究專項（LHZX-2021-01）

作者簡介：何立樂，男，助理研究員，博士，主要從事環境與生態方面的工作。E-mail：helile@nwipb.cas.cn

通信作者：張振華，女，研究員，博士，研究方向為全球變化生態學。E-mail：zhenhua@nwipb.cas.cn