基于SSR分子標記的金銀花主栽品種及芽變品系遺傳多樣性分析

摘 要：研究金銀花及其近緣種的遺傳背景，旨在區分不同品種并篩選優質性狀，為金銀花品種改良提供理論支持。研究利用SSR分子標記技術進行PCR引物的篩選，采用POPGENE32軟件計算遺傳相似性系數，利用NTSYSpc2.1對金銀花擴增結果進行聚類分析，篩選出19對具有多態性的引物，其中高、中多態性位點達到94.7%，表明SSR分子標記可用于金銀花主栽品種及芽變品系遺傳多樣性分析。聚類分析結果顯示，26個品種（系）金銀花間遺傳相似性平均距離為0.374，金銀花品種“巨花1號”與“四季花”間遺傳一致性最低（為0.393），同一品種芽變系間遺傳一致性最低達到0.357，即芽變是金銀花品種選育的重要變異來源。

關鍵詞：金銀花；SSR；分子標記；遺傳多樣性；芽變

中圖分類號：S567.79" "文獻標志碼：B" "文章編號：1674-7909（2025）4-92-6

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2025.04.019

0 引言

《中華人民共和國藥典（2020年版）》記載，忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花稱為金銀花，具有清熱解毒、疏散風熱的功效。金銀花在全國各地均有分布，河南、山東、河北等省份的金銀花種質資源豐富［1］。近年來，金銀花作為常用中藥材，其使用量呈現增長趨勢，且在食品、香料、化妝品等多個行業均得到廣泛應用［2］，市場需求持續旺盛，導致其市場供應呈現相對緊張的狀態，市場上的金銀花貨缺價揚。在自然選擇和人工干預下，大量金銀花芽變基因型被篩選保留，并形成了一系列農家種和品種（系）。脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）分子標記可以從DNA水平上實現中藥材種質分型和種源追溯［3］。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記數量豐富、廣泛分布于整個基因組，具有較多的等位性變異，能夠鑒別出純合子和雜合子，且實驗重復性好、結果可靠。SSR標記已被大量的實驗證明是基于PCR擴增中最為高效可靠、應用最為廣泛的分子標記之一［4］。研究以26個金銀花品種及其芽變系為研究對象，通過SSR分子標記手段進行親緣關系分析，為金銀花芽變品系篩選鑒定和金銀花遺傳改良提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BIO-RAD聚丙烯酰胺電泳儀（美國伯樂），醫用膠片觀察燈（翼州市康泰爾醫療器械廠），水平搖床（北京市六一儀器廠），微孔板迷你離心機（上海恒一科學儀器有限公司），BiometraTprofessional梯度PCR儀、微量核酸蛋白測定儀、全自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司），微波爐（SANYO），JP-SPBT型水平電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.2 試劑

Oligo引物（通用生物安徽股份有限公司），6×DNA loading buffer（北京索萊寶科技有限公司），DNA Marker（寶日醫生物技術有限公司），premix（plus dye）（北京聚合美生物科技有限公司），核酸染料（北京索萊寶科技有限公司），丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和硼酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 樣品

試驗樣品為26個金銀花主栽品種及芽變品系的新鮮葉片（見表1）。供試材料分別于2023年9月采自河北省巨鹿縣、山東省臨沂市、河南省封丘縣、河南省新鄉市紅旗區、河南省漯河市等地。采集的新鮮葉片置于液氮中保存帶回，并將其保存在-80 ℃冰箱中備用。

2 試驗方法

2.1 DNA提取

取金銀花鮮葉，經液氮快速研磨成粉末，基因組DNA利用CTAB法［5］提取，經凝膠電泳檢測（1%瓊脂糖），獲得清晰條帶，?20 ℃保存備用。

2.2 PCR擴增體系的建立與凝膠電泳檢測

PCR擴增反應使用Taq Master Mix混合液，在PCR儀上進行。反應體系的總體積為10 μL，其中1 μL DNA，5 μL MIX混合液，正向和反向引物各0.5 μL，3 μL ddH2O。

PCR擴增程序：94 ℃預變性30 min；94 ℃變性24 s，根據引物不同設置不同退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃充分延伸5 min；4 ℃保存。

PCR產物利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，100 V電泳約35 min。電泳結束后進行銀染顯色。

2.3 數據獲取與分析

在種質資源的遺傳結構分析中，結合電泳Marker判斷目標條帶的大小，按照擴增產物的有或無，構建“0/1”標準矩陣。利用軟件NTSYSpc2.10繪制進化樹圖。基于NTSYSpc2.10軟件Matrixcomp.plot功能分析相似系數間的相關性，評價系統樹狀圖的質量。在居群內遺傳多樣性分析中，根據構建的“0/1”標準矩陣，應用POPGENE32軟件計算所用引物的有效等位基因數（Ne）、Nei's遺傳多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）。每個SSR位點的多態性信息含量（polymorphic information content，PIC）按公式（1）計算。

[PIC=1? fi2] （1）

式（1）中，fi表示i位點的基因頻率。

3 結果與分析

3.1 DNA提取

取5 μL DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，部分樣品DNA提取結果見圖1。由圖1可知，提取的DNA樣品在瓊脂糖凝膠上均有大于5 000 bp的條帶，且無拖帶現象，說明提取的DNA具有較高的純度和良好的完整性，無降解現象，能夠滿足后續試驗要求。

3.2 金銀花樣品SSR序列引物的篩選與確定

以百S-2、四季花、百S-7、百S-1等4個品種（系）全基因組DNA為模板，對查閱文獻［6-7］獲得的JYH-4等39對SSR引物（見表2）進行篩選，用8%聚丙烯酰胺凝膠進行鑒定，共篩選出19對重復性、多態性、穩定性均較好的引物（占所用引物的48.7%），共檢測到2～6個等位基因片段，擴增片段大小為100～500 bp（見圖2），可用于品種及芽變系鑒定。

3.3 SSR引物的多態性分析

利用前期篩選的19對引物對26個金銀花品種（系）進行PCR擴增，SSR多態性引物特征見表3。每對引物有效等位基因數范圍為1.148～1.865，平均值為1.580。Shannon信息指數范圍為0.230～0.656，平均值為0.513；Nei's遺傳多樣性指數范圍為0.121～0.463，平均值為0.341，說明遺傳多樣性在各個位點之間存在較大差異；多態性信息含量（PIC）是衡量基因豐富度的重要指標，SSR位點的PIClt;0.25為低度多態位點，0.25≤PIC≤0.50為中度多態位點，PICgt;0.50為高度多態位點［8］。根據BOSTSEIN［9］的研究，PIC是衡量等位信息含量和變異程度高低的理想指標。在此次研究中，各位點的多態性信息含量（PIC）變化范圍為0.221～0.862，平均值為0.517；其中，jp.ssr58等8個引物為高多態位點（占全部引物的42.1%），中多態位點為52.6%。這些位點在金銀花不同品種（系）及芽變材料中存在豐富的遺傳差異，可以作為區別金銀花不同基因型的有效標記（見圖3）。

3.4 金銀花不同品種（系）和芽變間親緣關系分析

由聚類分析圖（圖4）可知，26個金銀花品種（系）間遺傳相似性平均距離為0.374。遺傳距離數值越大，表明二者的遺傳相似性越低。在檢測的26個金銀花品種（系）和芽變材料中，河北省巨鹿縣的巨花1號與河南省封丘縣的四季花親緣關系最遠（遺傳距離為0.934），從河南省封丘縣農家種大毛花中選育的封花1號與巨花1號親緣關系較近，且封花1號芽變材料FH-1與巨花1號芽變材料BJ-8親緣關系也較近，遺傳一致性低于0.982 1。

4 討論與結論

4.1 在金銀花品種中可篩選獲得豐富的芽變

芽變選種是中藥材新品種選育的重要途徑之一。此次研究發現，金銀花新品種百金2號在大田栽培過程中產生了豐富的芽變，BJ-9號芽變株系與白金2號遺傳一致性較遠（為0.536），BJ-4號芽變株系與白金2號遺傳一致性最近（為0.875），其10個芽變株系遺傳距離最大可達1.030；當遺傳相似性系數為0.654時，10個芽變品種可以分為2大類，其中BJ-9號芽變株系單獨聚為一類，其他芽變株系聚為一類。在河南省新密市的農家種內，也發現了豐富的芽變，遺傳關系最大為0.890，其親緣關系甚至大于部分品種間的親緣關系。這些芽變為品種選育提供了豐富的變異資源，為金銀花優異種質的發掘與創新利用提供了參考。

4.2 金銀花主栽品種的親緣關系分析

雜交育種是豐富藥用植物基因型、培育優質高產藥用植物品種的有效途徑之一，而親本品種間存在較大的遺傳差異是新品種高效選育的基本原則之一。在此次研究檢測的6個金銀花主栽品種中，河北省巨鹿縣的巨花1號與河南省封丘縣的四季花親緣關系最遠，遺傳距離為0.934，從河南省封丘縣農家種大毛花中選育的封花1號與巨花1號親緣關系較近。其中，巨花1號花枝粗壯、花節稠密，便于采摘，綠原酸含量3%～4%，木犀草苷含量超過0.05%，每667 m2產干花150～200 kg［10-11］；四季花直立性強，抗性突出，花期長，花蕾中綠原酸等有效成分含量高，平均每667 m2產干花102.5 kg［12］。若以二者為親本進行雜交，則有望篩選出藥用成分含量高、株型合理、栽培管理難度低的優質新品種。

4.3 SSR用于金銀花遺傳分析適用性討論

金銀花的藥用價值極高，自古以來應用廣泛［13］。明確不同品種間的遺傳背景，對于有性繁殖選育優良品種至關重要。候立娜等［14］通過SSR分子標記技術，對來自4個省的35份藥用金銀花種質資源進行遺傳多樣性分析，成功分出35份種質資源的親緣關系遠近。徐石勇等［6］利用SSR分子標記構建指紋圖譜，對8個市售金銀花樣品進行分析，能夠區分出河北省、山東省、河南省等地的金銀花品種。以上研究均是利用SSR分子標記對金銀花品種的遺傳關系進行分析，篩選出遺傳多樣性較好的金銀花群體。此次研究利用SSR反應體系，檢測出19個多態性較好的引物，并利用SSR技術對26份金銀花種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，發現在遺傳相似系數為0.36時可將26份供試材料分為4大類群。在此次試驗中，可能因為長期的同地栽培，各品種具有相近的遺傳背景，所以各品種間體現了一定的親緣關系，其中BJ-8和FH-1的親緣關系最近。這也可能是因為此次試驗分子標記數量有限，未能完全將2個品種分開。此次試驗結果也表明，四季花品種與其他參試品種的遺傳差異均顯著。聚類分析圖直觀展示了各品種間的親緣關系，為新品種選育和道地藥材評價提供了關鍵信息。利用SSR分子標記構建指紋圖譜，可以實現不同品種金銀花的鑒別，為優良品種選育和種質資源的豐富提供分子生物學依據。

4.4 金銀花SSR遺傳多樣性

此次研究篩選的19個SSR標記多態性好，可以用于分析金銀花遺傳多樣性及鑒定不同金銀花種質資源的親緣關系。此次研究基于19對引物對26個金銀花群體的遺傳多樣性進行分析，發現有效等位基因數平均值為1.580，Nei's遺傳多樣性指數平均值為0.341，Shannon信息指數平均值為0.513。其中，Nei's遺傳多樣性指數是判斷群體間遺傳多樣性高低的重要指標，其值越大，說明群體的遺傳一致性越低，遺傳多樣性越高；Shannon信息指數在反映群體遺傳多樣性方面比Nei's遺傳多樣性指數更有說服力，Shannon信息指數越大，表明群體離散度越高，遺傳多樣性越高。此次研究結果中的Shannon信息指數大于Nei's遺傳多樣性指數，說明26份金銀花品種及芽變株系間遺傳多樣性豐富。

4.5 金銀花SSR遺傳相似性

在此次研究中，SSR擴增所得的26個金銀花品種（系）的遺傳相似系數變化范圍為0.03～0.99。孫稚穎等［15］利用分子標記技術對農家種及野生忍冬和近緣種忍冬共36個樣品進行遺傳多樣性分析，發現36個樣品間的遺傳相似系數變化范圍為0.50～0.90。侯立娜等［14］等利用開發的23對引物對35份藥用金銀花品種進行遺傳多樣性分析，發現其遺傳相似性系數變化范圍是0.13～0.91。與上述研究成果相比，此次研究的遺傳相似系數變化范圍更大，表明新鄉產區的金銀花在遺傳層面表現出顯著的多樣性。這將有助于篩選出具有道地產區特征的高產優質品種，可為金銀花的遺傳改良和育種工作奠定堅實基礎。由此可見，SSR分子標記可用于金銀花主栽品種及芽變品系遺傳多樣性分析。

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Genetic Diversity Analysis of Main Cultivars and Sport Strains of Lonicera japonica Based on SSR Molecular Markers

SHI Hanhan1 ZHAO Yuanzeng2 LI Yongchao2 MA Qindi2 ZHOU Aorun2 ZHANG Fanfan2WANG Xiangnan2 YANG Jing2

1. School of Agricultural， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China;

2. School of Life Sciences， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China

Abstract： This study investigates the genetic background of Lonicera japonica and its closely related species to differentiate between varieties and screen for superior traits， providing theoretical support for cultivar improvement. Using SSR molecular marker technology for PCR primer screening， we calculated genetic similarity coefficients with POPGENE32 software and performed cluster analysis of amplification results using NTSYSpc2.1. Nineteen pairs of polymorphic primers were identified， with high and moderate polymorphism loci accounting for 94.7%， demonstrating the effectiveness of SSR markers in analyzing genetic diversity among major cultivated varieties and bud sport mutants of Lonicera japonica. Cluster analysis revealed an average genetic distance of 0.374 among 26 varieties （lines）. The lowest genetic similarity （0.393） was observed between cultivars ''Juhua 1'' and ''Sijihua''， while the minimum similarity within bud sport strains of the same cultivar reached 0.357， indicating that bud sport mutations constitute a significant source of variation in Lonicera japonica breeding programs.

Key words： Lonicera japonica; SSR; molecular markers; genetic diversity; bud sport mutation

（欄目編輯：姜春艷）

基金項目：河南省重點研發專項（221111110300）；河南省科技攻關項目（232102310296，242102111092）。

作者簡介：史含含（1998—），女，碩士生，研究方向：藥用植物遺傳育種；趙元增（1974—），男，博士，副教授，研究方向：藥用植物種苗繁育；李勇超（1978—），男，博士，教授，研究方向：中藥材育種；馬欽迪（1997—），男，碩士生，研究方向：藥用植物生物技術；周澳潤（2003—），女，本科生，研究方向：藥用植物生物技術；章凡凡（2003—），男，本科生，研究方向：藥用植物生物技術；王香楠（2003—），女，本科生，研究方向：藥用植物生物技術。

通信作者：楊靖（1981—），女，博士，副教授，研究方向：藥用植物生物技術。