雌雄青楊組織培養(yǎng)和PcXTH22基因過表達(dá)及敲除

摘要：為能通過基因工程手段對青楊（Populus cathayana Rehd.）進(jìn)行遺傳改良，本研究以雌雄青楊為材料建立了適用于不同性別的組培再生體系，確定了青楊雌株分化、增殖和生根階段最佳培養(yǎng)基分別為：MS+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.1mg/LTDZ+0.3mg/LIBA，MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA，WPM+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂+0.1mg/LIBA+0.2mg/LNAA；青楊雄株分化、增殖和生根階段的最優(yōu)培養(yǎng)基分別為：WPM+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.1mg/LTDZ+0.3mg/LNAA，MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，WPM+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂+0.2mg/LIBA+0.02mg/LNAA.隨后使用繼代培養(yǎng)1mo的青楊雌株葉片作為遺傳轉(zhuǎn)化受體，根癌農(nóng)桿菌菌液侵染10～15min后，共培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)入含10mg/L潮霉素和200mg/L特美汀的各階段培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng).定量PCR發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系中PcXTH22的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平提高了40～824倍，轉(zhuǎn)化率為100%.在CRISPR-Cas9轉(zhuǎn)化成功的5個株系中發(fā)現(xiàn)1個株系的兩個等位基因同時發(fā)生移碼突變而蛋白翻譯提前終止（即純合株系），編輯效率為20%.因此，該研究為使用我國特有鄉(xiāng)土樹種進(jìn)行遺傳改良提供了優(yōu)秀的范例.

關(guān)鍵詞：青楊；雌雄植株；組織再生；遺傳轉(zhuǎn)化體系；PcXTH22；CRISPR-Cas9基因編輯

中圖分類號：Q94 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19907/j.0490-6756.240302

1引言

楊樹由于適應(yīng)性強、分布廣泛、再生能力強、樹干直、成材快、基因組相對較小等特點在全球范圍內(nèi)都有大量種植.在產(chǎn)于北美洲的毛果楊（Populustrichocarpa）基因組于2006首次測序完成后，楊樹一直被作為林木分子生物學(xué)研究的模式植株［1］.組培技術(shù)是快速獲得大量無性系植株的有效手段之一，同時也是獲得完整的遺傳轉(zhuǎn)化植株的基礎(chǔ).楊樹是最早通過規(guī)模化無性繁殖實現(xiàn)了無性系育種的，被選育出了大批優(yōu)良單株繁殖而來的優(yōu)良無性系，包括歐美楊（P.canadensis）、小葉楊（P.simonii）、美洲黑楊（P.deltoides）、84K楊（P.alba×P.tremula var.glandulosa）、三倍體毛白楊等［2-5］.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化的嘗試工作最早是在黑楊派與青楊派雜交種中展開的.Parsons等首次利用兩種根癌農(nóng)桿菌A281和A348分別侵染雜交楊（P.trichocarpa×P.deltoides）莖段，雖未成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，卻證實了楊樹是農(nóng)桿菌的宿主植物［6］.此后，研究者發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌同樣可成功侵染楊樹誘導(dǎo)不定根，并且成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株［7，8］.此后30多年時間里，國內(nèi)外建立了大量的不同楊樹樹種的遺傳轉(zhuǎn)化體系，受體材料的選擇有莖段［6-8］、葉盤［9］、愈傷組織［10］和種子下胚軸［11］.CRISPR/Cas9基因編輯是精準(zhǔn)育種強有力的便捷工具，在植物基因工程育種和基因功能研究中被廣泛應(yīng)用［12］.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)出現(xiàn)之前，楊樹轉(zhuǎn)基因都是以基因的過表達(dá)為主，但是近年來存在很多CRISPR/Cas9介導(dǎo)的楊樹基因的成功編輯案例.Bae等利用CRISPR/Cas9突變84K楊八氫番茄紅素去飽和酶1（Pag?PDS1）基因，在總共110個轉(zhuǎn)基因雜交楊株系中，82株系表現(xiàn)出明顯的表型，PagPDS1基因的表型突變效率約為74.5%［13］.Azeez等利用CRISPR技術(shù)敲除轉(zhuǎn)早花基因的雌性（717-FT，P.tremula×alba）和雄性（353-FT，P.tremula×tremuloides）楊樹基因型中的PopSAP基因，獲得了不育的楊樹雌雄株，為解決轉(zhuǎn)基因污染問題提供了新思路［14］.Shen等發(fā)現(xiàn)敲除硝酸鹽誘導(dǎo)基因PdGNC會增加氣孔開度，降低楊樹的耐干旱能力［15］.但是，CRISPR基因編輯技術(shù)目前只在具備高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，如三倍體毛白楊、717雜交楊、山新楊和84K楊中被成功應(yīng)用［16］.

青楊（P.cathayana）性喜濕潤寒冷的氣候，木材紋理直，結(jié)構(gòu)細(xì)，易加工，是我國優(yōu)良的鄉(xiāng)土樹種，在我國各地常作人工林和行道樹種植，在保障國家木材安全戰(zhàn)略儲備中具有重要地位［17，18］.同時青楊也面臨著干旱、增溫和環(huán)境污染等各種挑戰(zhàn)，通過育種獲得性狀優(yōu)良的青楊品種對于提高青楊人工林成林速度，提高人工林產(chǎn)量具有重要意義［19-21］.研究發(fā)現(xiàn)，青楊雌雄植株在各種生物和非生物脅迫中具備顯著的性別差異，是典型的性別二態(tài)性樹種.例如，青楊雌株比雄株在干旱、高UV-B、高溫條件下表現(xiàn)得更加敏感［20-22］，青楊雌雄株與根際和葉際微生物具有不同的互作模式［23，24］，對氮、磷、鉀等營養(yǎng)缺乏具備不同的應(yīng)對策略［25-27］，青楊雌雄株對重金屬Cd和Zn具有不同的攝取、易位和解毒機制［28，29］等.然而，這些研究都局限于生理和組學(xué)層面，并未更深層次地揭示導(dǎo)致這些差異的分子機制.2023年青楊的基因組數(shù)據(jù)被公布，使得青楊成為一種非常合適的用于研究雌雄異株木本植株性別二態(tài)性的植物材料［30］.但是至今還未見有關(guān)的青楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的報道，因此，急需建立穩(wěn)定高效的青楊遺傳轉(zhuǎn)化體系，為青楊在分

子水平遺傳改良提供理論依據(jù)和技術(shù)保障，對于生產(chǎn)實踐具有重要意義.

2材料與方法

2.1實驗材料

植物材料：青楊原變種雌雄株扦插條采自青海省貴德縣（經(jīng)度：101.42，緯度：36.04）.使用上口平切下口斜切的方式將扦插條切成約10cm長，使用生根粉和多菌靈浸泡2h，插入泥炭∶蛭石=3∶1的無菌土中，覆蓋保鮮膜保濕促進(jìn)萌芽，培養(yǎng)室溫度約為25℃，光照強度為10000lx，光暗周期為12h/12h.培養(yǎng)1mo后的幼嫩葉片或莖段用于后續(xù)的組培再生實驗.

植物表達(dá)載體：pCXSN，原核抗性為卡那霉素（Kan），真核抗性為潮霉素（Hyg）.CRISPR-Cas9敲除系統(tǒng)系列載體：pYLsgRNA-AtU3b，pYLsgRNA-AtU3d，pYLsgRNA-AtU6-1，pYLsgRNA-AtU6-29，原核克隆載體，抗性為氨芐青霉素（Amp），用于擴增U3-sgRNA-gRNA或U6-sgRNA-gRNA表達(dá)盒；pYLCRISPRCas935s-H雙元表達(dá)載體，原核抗性為Kan，真核抗性為Hyg，作為表達(dá)多靶點序列和Cas9蛋白的載體骨架.植物激素：噻苯隆（Thidiazuron，TDZ），6-芐氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA），玉米素（Zeatin，ZT），3-吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA），萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D）.

菌株：大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌EHA105.

2.2方法

2.2.1合適的外植體選擇和消毒方法 選擇1個月的扦插苗頂端2～3片幼嫩葉片或者頂端5cm左右的幼嫩莖段作為外植體，用流水沖洗30min；然后于超凈工作臺中轉(zhuǎn)移到無菌瓶中，75%乙醇消毒30s，無菌水清洗2～3遍，1%NaClO（有效氯含量）消毒5min，無菌水清洗5～6遍，用濾紙吸干表面水分；最后用無菌的解剖刀將葉片切割成大小約為0.5cm×0.5cm的小塊，并在背面切割數(shù)個細(xì)小傷口備用；將莖段切成約1cm左右小段，并在表面劃數(shù)個傷口備用.

2.2.2 各階段培養(yǎng)基的選擇 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)：將經(jīng)過消毒處理的青楊雌株和雄株外植體接種到無菌的固體培養(yǎng)基上，其中葉片接種時近軸面向上正置于培養(yǎng)基上，莖段接種時形態(tài)學(xué)上端向上正插入培養(yǎng)基中，露一半在外，于人工氣候箱中暗培養(yǎng)30d，溫度25℃，濕度70%.青楊雌株誘導(dǎo)培養(yǎng)基的主要成分為：MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+TDZ（0.1～0.3mg/L）+IBA（0.3～0.5mg/L）.青楊雌株誘導(dǎo)培養(yǎng)基的主要成分為：MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+TDZ（0.1～0.3mg/L）+IBA（0.3～0.7mg/L）.青楊雄株葉片和莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基的主要成分為：WPM+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+TDZ（0.1～0.3mg/L）+IBA（0.3～0.5mg/L）或WPM+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+TDZ（0.1～0.3mg/L）+NAA（0.3～0.5mg/L）或WPM+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+6-BA（1.0mg/L）+2，4-D（0.5～1.0mg/L）或WPM+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+ZT（2.0mg/L）+NAA（1.0mg/L）或WPM+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+6-BA（0.5～1.5mg/L）+NAA（0.8～1.5mg/L）.所有培養(yǎng)基調(diào)pH=5.8.

分化培養(yǎng)：誘導(dǎo)培養(yǎng)20～30d后將獲得的愈傷組織從培養(yǎng)瓶中取出，剔掉多余培養(yǎng)基，切除褐化部分，轉(zhuǎn)接到新鮮的分化培養(yǎng)基上，于人工氣候箱中培養(yǎng).培養(yǎng)條件為：溫度25℃，濕度70%，照明10000Lux，光暗周期為14h/10h.青楊雌株分化培養(yǎng)基的主要組成成分為：MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L）+6-BA（0.1～0.7mg/L）+IBA（0.1～0.7mg/L）.青楊雄株分化培養(yǎng)基的主要組成成分為：MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L）+6-BA（1.0～1.5mg/L）+NAA（0.1～1.0mg/L）.生根培養(yǎng)：分化培養(yǎng)30d左右后，將叢生不定芽取出，切下2～3cm左右的芽轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)條件同分化培養(yǎng)階段.青楊雌株

生根培養(yǎng)基成分為：1/2MS+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）+IBA（0.1～0.3mg/L）+NAA（0～0.2mg/L）或WPM+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）+IBA（0～0.3mg/L）+NAA（0～0.2mg/L），pH=5.8.青楊雄株生根培養(yǎng)基成分為：WPM+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）+IBA（0.1～0.2mg/L）+NAA（0.02～0.2mg/L），pH=5.8.

2.2.3超表達(dá)載體構(gòu)建 首先構(gòu)建具備Hyg抗性標(biāo)記基因的過表達(dá)重組載體，使用植物雙元載體pCXSN，以35S強啟動子驅(qū)動目的基因

PcXTH22表達(dá).使用凍融法將載體pCXSNPcXTH22轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，挑選含目的載體的陽性克隆于-80℃保存?zhèn)溆?

2.2.4 CRISPR-Cas9敲除載體構(gòu)建 首先通過擴增測序確定青楊PcXTH22編碼基因的準(zhǔn)確堿基序列，根據(jù)該序列設(shè)計敲除靶點.靶點設(shè)計時，盡量使其位置位于目的基因的前兩個外顯子上以使其在發(fā)生基因編輯后出現(xiàn)移碼突變造成提前終止.使用網(wǎng)站CRISPOR（http：//crispor.gi.ucsc.edu）評估sgRNA的打靶效率和脫靶概率.針對設(shè)計好的靶點合成sgRNA引物對，經(jīng)過退火后獲得sgRNA雙鏈片段，通過巢式PCR擴增獲得AtU3-sgRNA-gRNA或AtU6-sgRNA-gRNA表達(dá)盒，然后使用DNA純化試劑盒（艾德萊）純化回收PCR產(chǎn)物.利用入門克隆的方法將上述表達(dá)盒串聯(lián)到載體骨架pYLCRISPRCas9P35s-H上.

2.2.5青楊雌株葉片抗生素耐受性和農(nóng)桿菌抑制測試 使用Hyg對青楊進(jìn)行抗性篩選建立殺滅曲線，Hyg的濃度梯度為0、2、5、10、20、100、200mg/L.將野生型青楊雌株無菌苗葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，將其背面向下貼放在含上述濃度Hyg的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察10d內(nèi)青楊葉片的存活情況.使用頭孢噻肟鈉（Cef）或特美汀（Tim）對農(nóng)桿菌進(jìn)行抑制，10d后觀察葉片生長情況和農(nóng)桿菌抑制效果.

2.2.6農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化青楊葉片 準(zhǔn)備農(nóng)桿菌浸染液：將低溫保存的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105劃線接種于含50mg/LKan和20mg/L利福平（Rif）的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1～2d，直至長出大小均勻的單菌落；挑取單菌落接種于1mL含有50mg/LKan、20mg/LRif的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩過夜培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8；取500μL二活菌液轉(zhuǎn)到50mL新鮮的YEP培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)6～8h，至OD600為0.6～0.8；4℃離心收集菌體，用30mLMS重懸液（含MS，30g/L蔗糖，100μmol/L乙酰丁香酮），放入28℃搖床中避光振蕩培養(yǎng)1～2h即可用于轉(zhuǎn)化.

青楊雌株葉片浸染：選取無菌苗頂端的幼嫩葉片，在超凈工作臺上將其切成0.5cm×0.5cm的小塊，放入已重懸好的菌液（OD600為0.8）中浸染10～15min，期間每隔2min不斷搖晃菌液使其與葉片充分接觸.將浸染過的材料用鑷子小心夾出放在含有無菌濾紙的平板上吸干菌液，將葉片背面向下平鋪在MS共培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3d.共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為：MS+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.1mg/LTDZ+0.3mg/LIBA+100μmol/L乙酰丁香酮，pH=5.8.

愈傷選擇培養(yǎng)：3d后將轉(zhuǎn)化過的外植體移到愈傷選擇培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)約2wk，其間每周更換1次培養(yǎng)基.選擇培養(yǎng)基成分為：MS+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.1mg/LTDZ+0.3mg/LIBA+100μmol/L乙酰丁香酮+10mg/LHyg+200mg/LTim.

生芽選擇培養(yǎng)：2wk后，葉片傷口處出現(xiàn)白色塊狀疏松愈傷組織時，將其移入生芽選擇培養(yǎng)基上，在25℃，光照為10000lx條件下的光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)生芽，時間約4～5wk，每周更換1次培養(yǎng)基.生芽選擇培養(yǎng)基成分為：MS+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.3mg/L6-BA+0.7mg/LIBA+10mg/LHyg+200mg/LTim.

生根選擇培養(yǎng)：當(dāng)不定芽長至約2～3cm時，切下并轉(zhuǎn)入生根選擇培養(yǎng)基中，10d左右即可生根.生根選擇培養(yǎng)基成分為：WPM+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂+0.2mg/LIBA+0.2mg/LNAA+10mg/LHyg+200mg/LTim.

2.2.7轉(zhuǎn)基因株系鑒定 經(jīng)選擇培養(yǎng)后，取篩選得到Hyg抗性無菌幼苗葉片提取DNA.以該DNA為模板，野生型葉片DNA作為陰性對照，分別使用以下引物進(jìn)行PCR擴增：1）18SrRNA-F（CCAAGTGTACCCCAGCCAAT）/18SrRNAR（ACTCACCAAGACTGCTTCCG），此對引物用于檢測青楊DNA是否被成功提取；2）Hyg-F（GTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCC）/Hyg-R（GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG），此對引物用于檢測潮霉素抗性基因的正確插入與否；3）Cas9-F（AAGCCCATCAGAGAGCAGG）/Cas9-R（TGTCGCCTCCCAGCTGAG），此對引物用于檢測Cas9蛋白編碼基因的正確插入與否；4）35S-F（GACGCACAATCCCACTATCC）/XTH22jc-R（AATGGAAATGACTTCAGCATGAC），用于檢測目的基因的正確插入與否；5）XTH22jc-F（ATGGCGTGCTCTTATCTTGG）/XTH22jc-R，用于擴增靶基因待編輯片段.對于PCR檢測陽性的株系，提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測過表達(dá)目的基因轉(zhuǎn)錄水平相較野生型的變化，測序比對CRISPR/Cas9編輯基因的序列與野生型序列的變化.

2.2.8移栽煉苗 將高約5cm的再生苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，移栽到無菌土中（營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1），覆蓋保鮮膜保濕，7d后開始逐漸部分掀開保鮮膜，直到葉片完全暴露在空氣中不會脫水時，正常移栽到需要的條件下進(jìn)行培養(yǎng).

2.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理 增值倍數(shù)=出芽數(shù)量/外植體總數(shù)量，生根率=生根不定芽數(shù)量/不定芽總數(shù)量×100%.

3結(jié)果與分析

3.1青楊愈傷組織誘導(dǎo)

消毒處理后的青楊葉片在不同激素組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30d后進(jìn)行觀察.從圖1可以看到，各組均有一定的愈傷組織誘導(dǎo)，部分有一定數(shù)量的出芽，尤其集中出現(xiàn)在葉脈切口處.細(xì)胞分裂素TDZ和生長素IBA的含量共同決定愈傷組織大小和不定芽的發(fā)生.濃度為0.1～0.3mg/L的TDZ能夠大量促進(jìn)青楊雌株葉片愈傷組織形成且能夠繼續(xù)分化得到少量不定芽，但TDZ濃度越高越不利于不定芽分化.較高濃度的TDZ有助于不定芽的發(fā)生，但會一定程度抑制愈傷組織的形成.濃度為0.3mg/L的IBA有利于促進(jìn)愈傷組織形成，IBA濃度過高會抑制不定芽甚至導(dǎo)致愈傷組織不正常發(fā)育，使其發(fā)生褐化.所以，青楊雌株葉片誘導(dǎo)愈傷時，使用培養(yǎng)基MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+TDZ（0.1mg/L）+IBA（0.3mg/L）為最佳.

葉片雖然是最簡單易得的外植體材料，但是青楊雄株葉片在多種培養(yǎng)條件下生長情況都不佳，可能不是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體（表2，圖2g～2h）.而同樣較易獲得的青楊雄株幼嫩莖段在試驗組1～7均能夠快速被誘導(dǎo)出愈傷組織，其中以試驗組3中愈傷組織生長速度最快，能夠在短期內(nèi)獲得最大的愈傷組織塊（表2，圖2a～2f）.因此，青楊雄株莖段愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（6g/L）+TDZ（0.1mg/L）+NAA（0.3mg/L）為最佳.

3.2 青楊不定芽增殖培養(yǎng)

因為MS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分更加豐富，青楊雌株不定芽在MS培養(yǎng)基上生長比WPM培養(yǎng)基上更佳.而濃度在0.1～0.7mg/L范圍內(nèi)的6-BA能夠提高青楊雌株不定芽分化的數(shù)量，但當(dāng)6-BA濃度越高時，不定芽抽莖效果越差，芽越矮小.濃度在0.1～0.7mg/L范圍內(nèi)的IBA能夠促進(jìn)青楊雌株不定芽抽莖，且濃度越高抽莖效果越好，不定芽越高壯（表3，圖3）.由于不定芽數(shù)量越多越利于獲得大量再生植株，但是矮小不定芽不利于后續(xù)生根，為了不再另外進(jìn)行壯苗培養(yǎng)延長培養(yǎng)周期和增加成本，在培養(yǎng)時一般選擇出芽率和抽莖率相對較高的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，也就是使用MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L）+6-BA（0.1mg/L）+IBA（0.5mg/L）.

青楊雄株在分化培養(yǎng)階段使用WPM培養(yǎng)基時，愈傷組織易褐化，所以都使用MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).與青楊雌株不定芽分化時相似，6-BA促進(jìn)青楊雄株不定芽分化的數(shù)量，但是濃度為1.5mg/L的6-BA會抑制不定芽伸長，而NAA濃度在0.1～1.0mg/L范圍內(nèi)時對青楊雄株不定芽生長情況的影響差異不大（表4，圖4），在節(jié)約成本的條件下，使用培養(yǎng)基MS+蔗糖（30g/L）+瓊脂（7g/L）+6-BA（1.0mg/L）+NAA（0.1mg/L）進(jìn)行分化培養(yǎng)即可.

3.3 青楊不定芽生根培養(yǎng)

培養(yǎng)基種類對青楊雌株不定芽生根率影響不大，但是往往在WPM培養(yǎng)基中生根較快且多.濃度為0.1～0.3mg/L的IBA能夠促進(jìn)青楊雌株側(cè)根的生長，0.05～0.2mg/L的NAA能夠促進(jìn)青楊雌株主根生長，兩者組合使用更加有利于得到大量且粗壯的根，促進(jìn)青楊再生苗生長，有利于提高后續(xù)煉苗移栽的成活率，所以，一般培養(yǎng)條件下使用組合WPM+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）+IBA（0.1mg/L）+NAA（0.2mg/L）生根效果最佳（表5，圖5a～5f）.

適當(dāng)濃度的IBA同樣可以促進(jìn)青楊雄株側(cè)根的生長，而適當(dāng)濃度的NAA促進(jìn)主根生長.但是青楊雄株對IBA和NAA的敏感程度與青楊雌株不同.青楊雄株對NAA更加敏感，濃度為0.02mg/L的NAA便能夠促進(jìn)青楊雄株生根，而濃度大于0.1mg/L的NAA會對青楊雄株根的生長造成明顯抑制作用.使用培養(yǎng)基組合WPM+蔗糖（20g/L）+瓊脂（7g/L）+IBA（0.2mg/L）+NAA（0.02mg/L）時，能夠快速得到大量根生長健壯的再生苗（表6，圖5e～5h）.

3.4 青楊雌株葉片Hyg耐受性測試

分別使用含Hyg的濃度梯度為0、2、5、10、20、100、200mg/L的培養(yǎng)基對青楊無菌苗葉片進(jìn)行培養(yǎng)，10d后觀察葉片生長情況.結(jié)果顯示，10d后，10mg/mL的Hyg足以使青楊雌株葉片全部死亡（圖6）.因此，在青楊雌株遺傳轉(zhuǎn)化過程中，使用10mg/mL的Hyg對抗性芽進(jìn)行篩選.

在侵染后的選擇培養(yǎng)階段，分別使用200mg/LCef，400mg/mLCef和200mg/mLTim農(nóng)桿菌抑制劑，在更換培養(yǎng)基10d后觀察農(nóng)桿菌和受體材料生長情況.結(jié)果表明，200mg/LCef無法有效抑制農(nóng)桿菌的大量增殖，即使增加培養(yǎng)基的更換頻率也無法抑制農(nóng)桿菌增長.400mg/mLCef能夠有效抑制農(nóng)桿菌增殖，但同時受體葉片生長受到限制，生長緩慢且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象.200mg/mLTim能夠在不影響青楊雌株葉片脫分化和生長的同時有效的抑制農(nóng)桿菌的增殖，是理想的農(nóng)桿菌抑制劑（圖7）.

3.5 青楊雌株轉(zhuǎn)化PcXTH22基因與鑒定

使用攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌對青楊進(jìn)行轉(zhuǎn)化.對獲得的7個抗性單株進(jìn)行PCR鑒定，7個株系均為陽性株系（圖8），這些株系中PcXTH22基因表達(dá)水平提高了40～824倍.

3.6 青楊雌株XTH22基因敲除與鑒定

對青楊PcXTH22的基因組DNA序列設(shè)計特異性的基因編輯靶點共4個，靶點序列分別為：T1（CCTTCATCAAAGGATATAAT），T2（AATCTGGTCATGTACAGAGA），T3（TATCTCTAGATGAGAGGACA），T4（TCTCAGGACTTATACCTACA），在PcXTH22基因序列上位置如圖8所示.對于Hyg篩選獲得的抗性株系提取基因組DNA，檢測Hyg抗性基因和Cas9編碼基因的插入情況，所鑒定的株系中，轉(zhuǎn)化成功率高達(dá)100%（圖9）.對這些陽性株系使用引物PcXTH22-F/PcXTH22-R擴增PcXTH22基因靶點附近片段，然后對獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序.將轉(zhuǎn)化株系同野生型株系測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果一致表明未發(fā)生編輯，如在靶點附近出現(xiàn)堿基插入或缺失，或者存在測序雙峰的情況則表明存在基因編輯.本實驗獲得的株系中存在4個株系在靶點附近發(fā)生了編輯.對于測序雙峰的樣品pcxth22-ko#3進(jìn)行克隆測序，檢測該株系中PcXTH22基因組序列發(fā)生的不同編輯形式.克隆測序結(jié)果如圖9所示：pcxth22-ko#3株系中出現(xiàn)了兩種不同形式的編輯，表明其兩個等位基因編輯形式不同.其中pcxth22-ko#3Allel1在T1附近缺失2個堿基，在T2附近缺失2個堿基，在T4附近插入堿基T，在T3處未發(fā)生編輯.pcxth22-ko#3Allel2在T1和T4之間發(fā)生了一整段堿基序列（243bp）的倒置，導(dǎo)致內(nèi)含子無法正確剪切.這些堿基序列的變化均導(dǎo)致了相似的結(jié)果，即XTH22蛋白翻譯的提前終止（圖9）.此突變株系可用于研究PcXTH22的具體生物學(xué)功能.

4討論

青楊具備扦插易成活的特點，非常適用于扦插繁殖以營造人工林［17］.但是青楊莖葉的組培再生能力有限，這在一定程度上限制了青楊的遺傳轉(zhuǎn)化，不利于對青楊基因功能研究和遺傳改良.植物組織脫分化和再分化過程是細(xì)胞分裂素和生長素共同作用的結(jié)果，不同物種、同一物種的不同組織對于細(xì)胞分裂和生長素的敏感性均不相同，因此，外植體在含不同植物激素的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出不同的分化潛力［31］.本試驗中對雌雄青楊的葉片和莖段在不同培養(yǎng)基中進(jìn)行分化和增殖測試，獲得了較優(yōu)化的分化和增殖條件.這將被應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗中，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是廣泛利用的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，具備操作簡單，不依賴大型試驗設(shè)備的優(yōu)點［32］.而轉(zhuǎn)基因受體材料的分化率和增值倍數(shù)往往是影響其遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素［33］.楊樹葉片和莖段都曾被作為轉(zhuǎn)基因受體材料，但是由于葉片分化率通常較莖段更高，總是作為優(yōu)先選擇的受體材料［2，5-10］.本試驗中，同樣以青楊雌株葉片作為受體材料獲得了較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率.但由于雌雄青楊的性別二態(tài)性，雄株葉片具有顯著區(qū)別于雌株葉片的形態(tài)特征，同樣也具備顯著不同于雌株葉片的分化潛力.使用不同細(xì)胞分裂素、生長素和培養(yǎng)基的組合進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)青楊雄株葉片的分化率極低，甚至不分化直至死亡.我們將繼續(xù)嘗試使用青楊雄株的莖段作為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化.

侵染過程在遺傳轉(zhuǎn)化過程中起重要的作用，研究表明，農(nóng)桿菌侵染時菌液OD值通常在0.6～1.0之間，侵染時間為10～30min［32，33］.在青楊雌株葉片的侵染過程保持在這個濃度和時間區(qū)間內(nèi)就能保持較高的侵染效率.而在農(nóng)桿菌侵染后，對抗性芽的選擇和對農(nóng)桿菌的抑制過程十分重要.潮霉素、新霉素和卡那霉素等是常用的植物抗性篩選標(biāo)記基因［33］.在篩選過程中抗生素過高將顯著降低轉(zhuǎn)化效率，而過低將降低轉(zhuǎn)化的陽性率［33］.因此，在選擇培養(yǎng)前需要對受體材料的抗生素本底耐受水平進(jìn)行測試，找到最低致死濃度.本試驗發(fā)現(xiàn)潮霉素對青楊雌株葉片最低致死濃度為10mg/mL，這與已報導(dǎo)的84K楊、毛白楊等基本一致［4，5］.在侵染過程中農(nóng)桿菌過量繁殖往往會導(dǎo)致受體材料生長受阻或死亡，因此，選擇合適的農(nóng)桿菌抑制劑至關(guān)重要.常用的農(nóng)桿菌抑制劑主要有頭孢霉素和特美汀等，一般400mg/mL頭孢霉素和200mg/mL特美汀為常用的濃度［33］.但是本試驗發(fā)現(xiàn)，頭孢霉素在抑制農(nóng)桿菌的同時也會顯著抑制青楊雌株葉片的分化和生長，因此，特美汀是更為合適的選擇.

基因工程育種由于其基因編輯效率高、周期短的優(yōu)勢，成為了許多農(nóng)作物遺傳改良重要技術(shù)手段，在林木育種中也具有廣泛的應(yīng)用前景.已報導(dǎo)的研究中有許多利用基因工程成功對楊樹進(jìn)行抗蟲、抗鹽、耐澇遺傳改良的例子，包括轉(zhuǎn)抗蟲基因的741抗蟲毛白楊［34］，轉(zhuǎn)耐鹽基因PagERF072的84K楊［35］等.以上研究的共同點在于所使用的轉(zhuǎn)化材料均為楊樹某一性別的無性系，至今還未見有同一種楊樹不同性別的組培體系同時被報導(dǎo)的.因此，建立雌雄青楊的遺傳轉(zhuǎn)化體系將有望作為研究木本植物性別二態(tài)性的模式植物，同時也為獲得遺傳改良品種提供可能.