重組球菌和球蟲多表位抗原的表達及特性研究

摘要： 本研究旨在設計針對牛鏈球菌和牛球蟲的聯合多表位疫苗. 通過生物信息學篩選兩種病原體的T/B 細胞優勢表位基因序列，串聯拼接后引入霍亂毒素B 亞單位（CTB）作為分子內佐劑，設計得到多表位重組抗原CARR（CTB-AMA1-RodA-RodA）. 經密碼子優化后，將CARR 基因克隆至pET28a（+）質粒，轉化至大腸桿菌BL21（DE3），成功構建了穩定的表達工程菌. SDS-PAGE 顯示工程菌可高效表達約90 kDa 目標蛋白，Western blot 驗證表達蛋白能與抗CTB 及抗牛鏈球菌抗體特異性結合，且20代內工程菌質粒保有率超80%. 純化后的CARR蛋白免疫蛋雞，7 wk 后ELISA 檢測顯示特異性IgY 抗體效價達1∶12800. 體外中和實驗證實，該抗體顯著抑制牛鏈球菌生長，說明其具備功能性中和活性. 結果表明，CARR 重組蛋白可有效快速激發宿主體液免疫應答，是牛鏈球菌和牛球蟲聯合疫苗的有效候選抗原靶點.

關鍵詞： 牛鏈球菌； 牛艾美爾球蟲； 重組多表位抗原； 表達特性； 中和抗體

中圖分類號： R392. 1 文獻標志碼： A DOI： 10. 19907/j. 0490-6756. 240260

1引言

牛鏈球菌（Streptococcus bovis）和牛球蟲分屬細菌和原蟲，其中S. bovis 是一種兼性厭氧的革蘭染色陽性細菌，屬于Ｄ群鏈球菌，該細菌能使牛發生酸中毒，并能導致奶牛乳腺炎、犢牛肺炎，嚴重降低肉牛質量以及奶牛產奶量，同時該細菌還能感染人類，導致感染性心內膜炎、菌血癥等疾病［1，2］. 近年來S. bovis 感染的發病率呈上升趨勢，抗生素的使用也導致耐藥菌株不斷產生，尤其是對克拉霉素以及其他大環內酯類抗生素產生耐受［3］，其危害不容忽視，開發設計S. bovis 疫苗具有較大的臨床價值. 牛球蟲是一種胞內寄生蟲，其中牛艾美耳球蟲（Eimeria bovis）是最具致病性的球蟲之一. 受感染的牛可通過糞便排除大量未孢子化的球蟲卵囊，導致卵囊在環境中大量存在，傳播給未感染個體，尤其是犢牛和幼牛幾乎不能避免.感染E. bovis 的犢牛可能會出現嚴重的腹瀉甚至死亡［4，5］，研究E. bovis 疫苗可保護犢牛免受E. bo?vis 感染帶來的損害，增加犢牛的存活率. 有研究表明，母牛體內的E. bovis 抗體可以通過初乳傳遞給犢牛［6，7］，這表明給成年雌性個體接種E. bovis 疫苗仍具有較大的現實意義. 上述兩種病原體均可寄生于牛的消化道中，且均能在受感染動物的糞便中檢出病原體，其在易感動物間的流行不僅對畜牧業造成損失，還對牧區居民及工作人員的健康造成了嚴重威脅，因此對于S. bovis 和牛球蟲的防治是至關重要的.

目前，有效控制牛球蟲病和S. bovis 感染嚴重依賴于管理措施以及抗球蟲和抗菌藥物，而妥善的管理需要耗費較大的人力物力，且藥物的長期使用也使耐藥性成為球蟲病和S. bovis 感染治療的潛在威脅［2，3］，所以新的防治方法仍需探索. 表位疫苗由于其具有精準免疫、安全性高、效果理想，且能降低免疫逃逸的風險等諸多優勢，所以無論在人類醫學和畜牧醫學中都是新型疫苗研究熱點［8，9］. 例如口蹄疫表位疫苗因具有安全性好、易操作、可控等優勢，已經成為畜牧業中預防口蹄疫病毒的關鍵手段之一［9］. 因此設計S. bovis-牛球蟲融合多表位疫苗有利于從細菌和原蟲兩個方面減少易感動物所受到的威脅，減少疫苗所帶來的不良反應，在促進畜牧業發展的同時也保障了人類的健康. 本研究通過比對蛋白關鍵性、抗原性、可獲得性、理論有效性，最終篩選出了S. bovis 的桿狀決定蛋白（rod shape-determining" "protein， RodA）和牛球蟲的頂膜抗原（apical membrane antigen-1，AMA-1）、免疫定位蛋白1（immune" mapped protein1， IMP-1）作為多表位疫苗的靶蛋白，RodA 參與細菌肽聚糖的合成，影響細菌形態，結構分析顯示RodA 具有抗原性的可能性較高［10，11］；AMA-1、IMP-1 參與寄生蟲對機體的免疫刺激［12，13］，已有研究顯示AMA-1 刺激機體產生的抗體對包括瘧原蟲在內的頂復門寄生蟲均有保護作用，是作為疫苗開發和診斷應用的一個有前景的靶標［14，15］.

本研究將從S. bovis 的RodA 基因和牛球蟲的IMP-1、AMA-1 基因中篩選得到的優勢表位基因序列以不同順序串聯，再與霍亂毒素B 亞單位（Cholera toxin subunit B， CTB）相連，篩選構建并表達了重組S. bovis-牛球蟲多表位疫苗CARR，并對CARR 的免疫反應性、免疫原性進行了初步研究，以及對融合蛋白刺激產生的抗體的抑菌效果做了初步檢測.

2材料和方法

2.1主要材料

E. coli BL21（DE3）購自TansGen； pET28a（+）購自Novagen； His 標簽蛋白純化試劑盒、鼠抗Histag 多抗、HRP 標記的羊抗鼠IgG 購自碧云天公司；鼠抗CTB 單抗、鼠抗S. bovis 多抗由課題組自制，羊抗雞IgG、TMB 雙組分顯色試劑盒購自索萊寶有限公司；產蛋雞由四川農業大學提供.

2. 2方法

2. 2. 1 S. bovis-牛球蟲雙基因融合抗原的設計及特性分析 通過對比篩選蛋白關鍵性、抗原性、可獲得性、理論有效性，最終選擇了牛球蟲的AMA-1、IMP-1 和S. bovis 的RodA 作為重組蛋白抗原的備選靶蛋白，在NCBI 上獲取艾美耳球蟲AMA-1 和IMP-1 以及牛球蟲的RodA 的氨基酸序列和對應的基因序列. 運用BepiPred 2. 0、IEDB網站（http：//www. iedb. org/）進行對應備選蛋白的T、B 細胞表位預測并篩選優勢表位，將篩選得到的細胞表位以不同順序連接，加入或不加入CTB 序列，得到不同的融合蛋白序列，對各融合蛋白三維穩定性、分子量、等電點、表位個數、親水性、特異性等多參數綜合分析后選出最佳序列，并通過vectorbuilder 網站優化密碼子，最終由生工生物技術公司合成目的序列.

2. 2. 2 CARR表達菌的構建 通過雙酶切將合成的目的序列插入到pET28a（+）可表達區域，轉化至E. coli BL21（DE3），以抗性LB 平板（卡那霉素，50 μg/mL）篩選，并對陽性克隆的質粒進行酶切及測序鑒定.

2. 2. 3重組質粒 pET28a（+）-CARR 穩定性研究 方法參照王保寧等［16］質粒保有率實驗方法.

2. 2. 4 CARR誘導表達與表達形式分析 鑒定正確的工程菌種接種至抗性LB 液體培養基（卡那霉素，50 μg/mL）中，適當培養，然后以1∶50 的比例進行傳代. 在培養到對數生長階段時，添加IPTG，使其濃度達到1 mmol/L，在34 ℃和200 r/min下誘導8 h，收集細菌沉淀物并進行超聲波破碎，破碎后的沉淀物被用含有尿素的Binding 緩沖液溶解. SDS-PAGE /Western blot 分析上清和沉淀（由于重組蛋白含有6× 組氨酸標簽，因此Westernblot 選擇His tag 多抗進行初步鑒定）.

2. 2. 5鎳柱純化CARR 按照試劑盒操作說明書進行純化.

2. 2. 6Western blot 分析CARR 的免疫反應性分別用鼠抗CTB 單抗和自制鼠抗S. bovis（ATCC33317）多抗作為一抗，HRP 標記的羊抗鼠IgG 作為二抗，同時設置空載質粒重組菌為對照，分析CARR 的免疫反應性.

2. 2. 7 CARR 的免疫原性檢測 純化后的CARR融合蛋白與超聲破碎后的S. bovis（ATCC33317）抗原分別制備成蛋白終濃度為1 mg/mL 的抗原液備用，分別免疫1 只產蛋雞，抗原于雞大腿兩側、翅根、背部肌肉多點注射，首次注射600 μg 抗原（與弗氏不完全佐劑等體積混合），在第一次免疫后每隔14 d 進行1 次600 μg 單獨抗原免疫，在第一次免疫后每隔6～8 d 從每個組中收集雞蛋備用，持續8wk，采用鹽析法提取抗體，間接ELISA 法檢測IgY的效價.

2. 2. 8特異性IgY 對S. bovis 的生長抑制活性經傳代后的S. bovi（s ATCC33317）用LB液體培養基稀釋至OD600＝0. 08，設置9 個組別（IgY-ATCC處理組：加入使培養體系里的IgY 濃度分別為2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL；IgY-CARR 處理組：加入使培養體系里的IgY 濃度分別為2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL；阿莫西林（0. 1 μg/mL）處理組；非特異性IgY 處理組；空白對照組），于37 ℃、200 r/min 培養30 h，其間每隔3 h 進行取樣測量光密度值（OD600）.

3結果

3. 1 S. bovis- 牛球蟲雙基因融合抗原的設計及篩選

從AMA-1 和IMP-1、RodA 篩選得到的細胞表位以不同順序連接，加入或不加入CTB 序列，得到6 種融合蛋白序列，如下：

融合蛋白1：IMP-1-RodA-RodA（IRR）

融合蛋白2：AMA-1-RodA-RodA（ARR）

融合蛋白3： CTB-IMP-1-RodA-RodA（CIRR）

融合蛋白4： CTB-AMA-1-RodA-RodA（CARR）

融合蛋白5：IMP-1-RodA-RodA-CTB（IRRC）

融合蛋白6： AMA-1-RodA-RodA-CTB（ARRC）

各融合蛋白多參數分析篩選結果如表1，可見CARR （CTB-AMA-1-RodA-RodA） 和ARRC（AMA-1-RodA-RodA-CTB）更適合作為目標融合蛋白基因序列，由于CARR 前端含有CTB 的信號肽，分泌表達的可能性高，因此優先選擇CARR作為目標蛋白. 重組CARR 基因序列全長為2355 bp，蛋白理論分子量約90×103 Da. 利用工具vectorbuilder 進行密碼子優化后其適應指數由0. 62 增加至0. 91.

三維穩定性：蛋白中ɑ 螺旋越多，則其三維穩定性越高，使用過程越不容易異常降解，因此根據其三維結構中的ɑ 螺旋和β 折疊的比例綜合Expasy 分析中的不穩定指數（Instability index）分別計0～10 分；分子量：當蛋白的分子量過小時，其免疫原性較差，因此合適的抗原蛋白應有較大的分子量. 當融合蛋白分子量lt;35 kDa 時計0分，當融合蛋白分子量gt;35 kDa時計1～10 分；等電點：常用裂解液的pH 為7. 4-8. 0，因此融合蛋白的等電點（PI）應遠離此區間. 當融合蛋白PIlt;6. 0 或gt;10. 0 時計10 分，當6. 0lt;融合蛋白PIlt;7. 0 或10. 0gt;融合蛋白PIgt;9. 0 時計5 分，當7. 0lt;融合蛋白PIlt;9. 0 時計0 分；B 細胞表位個數：理論上融合蛋白中的B 表位個數越多，其免疫原性越好，因此融合蛋白中每含有一個B 細胞表位則計1 分，上不封頂；T 細胞表位個數：理論上融合蛋白中的T 表位個數越多越好，因此融合蛋白中每含有一個T 細胞表位則計1 分；親水性：融合蛋白的親水性越好，則其越容易發揮作用. 因此根據其親水性不同分別計0～10 分；特異性：融合蛋白的特異性越好，則發生不良反應的概率越低. 因此根據其特異性分別計0～10 分；結構圖：Phyre2 軟件對融合蛋白的三級結構預測圖.

3. 2

CARR 原核表達工程菌的構建與鑒定

pET28a（+）-CARR 經過雙酶切后，電泳結果出現一條2300 bp 左右的亮帶（圖1），聯合測序結果表明所構建的重組表達載體構建正確.

3. 3 CARR 工程菌質粒傳代穩定性CARR 工程菌質粒保有率結果如圖2 所示.

3. 4 CARR表達形式分析

經誘導表達后，電泳結果顯示在約90×10³ Da處出現相比于對照組更為明顯的蛋白條帶（圖3a泳道2 相比于泳道4），隨即以抗His tag 抗體進行Western blot 鑒定. 結果僅顯示工程菌沉淀包涵體裂解組在相對分子質量約90×10³ Da 出現明顯含組氨酸標簽的蛋白條帶（圖3b），因此CARR 的表達形式為包涵體表達，Image j 軟件分析顯示CARR 占菌體總蛋白20. 3%.

3. 5 CARR的免疫反應性分析

SDS-PAGE 顯示鎳柱純化效果良好，純化的CARR 分別以鼠抗S. bovis（ATCC33317）多克隆抗體（圖4a）、鼠抗CTB 單抗（圖4b）為一抗，進行Western blot，結果顯示在約90×10³ Da出現條帶，對照組無明顯條帶，說明所表達的CARR 抗原免疫反應性良好.

3. 6 CARR 的免疫原性分析

檢測首次免疫后8 wk 內收集雞蛋中的特異性IgY 效價，如圖5 所示，可見經過四次免疫，抗CARR-IgY 的效價逐漸升高，且相對于破碎抗原免疫的產蛋雞，CARR 刺激產生的特異性IgY 產生更快，且更早達到峰值，最終穩定在1∶12 800.

純化后的IgY SDS-PAGE 電泳結果如圖6 所示，可見分子量為66×10³ Da 左右的IgY 重鏈和25×10³ Da 左右的IgY 輕鏈.

3. 7特異性IgY 對S. bovis 的生長抑制活性

如圖7 所示，特異性IgY 對于S. bovis 的生長具有明顯的抑制作用，且存在一定的劑量效應關系，其中特異性抗CARR IgY 抗體的抑制作用略低于抗全菌破碎抗原IgY 抗體，且均小于阿莫西林的抑制作用，而非特異性的IgY 對于S. bovis 的生長沒有抑制作用.

4討論

S. bovis 和牛球蟲都是影響牛群健康的常見病原體，給牛群的養殖和生產帶來了嚴重的危害，糞便播散病原的方式以及病原在環境中的持續存在更是讓牧區對于兩種病原的防控難上加難. 而目前針對兩種病原體的防治缺乏高效且方便的方法，隨著新型疫苗的不斷發展，多表位疫苗的開發無疑是一個行之有效的方法. S. bovis 的RodA 在細菌的生長發育中至關重要，屬于SEDS 蛋白家族一員，其在革蘭陽性菌和革蘭陰性菌內均廣泛存在，但在不同的屬中相對保守［10，11］. 2008 年，Uehara等人研究表明RodA 的主要作用除了影響細菌的形態，還與細菌延伸等生命過程中的肽聚糖合成、降解密切相關［10］. 2018 年，Sjodt 等人報告了RodA的晶體結構，其含有三個巨大的外環，且外環中包含了許多功能必需的殘基，而細菌膜蛋白的外環則往往構成了很好的B 細胞表位. 此外，還有報告稱RodA 中存在極為保守的肽段，對這些保守肽段的誘導突變將導致菌體形態的改變并可能導致細菌裂解［11］. 因此，以RodA 作為S. bovis 疫苗靶點可能產生較好效果. 2011 年，Blake 等人鑒定出了艾美耳球蟲中能誘導保護性免疫反應的區域，并從中篩選出了兩個重要抗原基因——AMA-1 基因和IMP-1 基因［12］. AMA-1 是頂復門寄生蟲侵入宿主細胞時必不可少的一種蛋白質，也是頂復門寄生蟲的重要抗原，其誘導機體產生的抗體對包括瘧原蟲在內的頂復門寄生蟲均有保護作用［14，15］，敲除AMA-1 基因的蟲株不能形成穩定的克隆系［15］. 同時，已有研究表明，IMP-1 在球蟲屬內相對保守，與刺激機體免疫反應有關［12，13］，且該蛋白及其表位肽所激發機體產生的抗體具有良好的作用［13］，因此AMA-1 和IMP-1 是很有潛力的頂復門寄生蟲疫苗新靶點.

以往的研究顯示，CTB 具有顯著的免疫增強作用，可用作黏膜免疫增強劑，應用于疫苗開發［17］，本研究結果證明含分子內佐劑CTB 的CARR 確實有助于免疫反應的發生，加快特異性抗體的產生. 為了避免其他無效抗原對免疫應答的影響，選擇S. bovis 和牛球蟲關鍵蛋白的優勢表位進行融合抗原設計，并接入免疫佐劑分子，來誘發強烈和特異的免疫應答，達到預防或治療S. bo?vis 和牛球蟲感染的目的. 本研究篩選了S. bovis 和牛球蟲關鍵優勢表位，創新性地將細菌和寄生蟲兩大危害機體的微生物的優勢抗原融合表達，并進行了相應表達系統的密碼子優化，構建了CARR 蛋白原核表達工程菌，Western blot 證實了CARR 具有良好的免疫反應性，對產蛋雞的免疫以及間接ELISA 證明CARR 具有良好的免疫原性，且該融合蛋白刺激產生的抗體對S. bovis 的生長具有一定的抑制作用，后續應用推廣研究擬對CARR 作為疫苗的可能性進一步的探索，提升所構建的CARR 表達工程菌株CARR 蛋白表達量，探索中和抗體對球蟲的作用. 總而言之，本研究成功表達了S. bovis－牛球蟲多表位抗原CARR，為探討CARR 在牛體內預防、治療S. bovis 和牛球蟲感染的作用奠定了實驗基礎.