戊糖片球菌GZ0620的益生作用及對結(jié)腸炎的改善研究

摘要： 從天然發(fā)酵酸辣子食品中分離得到一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）GZ0620，探究該菌的益生性能及對動物結(jié)腸炎的影響．體外評估試驗顯示該菌株不具有溶血現(xiàn)象，同時對參與測試的克拉霉素等6 種抗生素均呈敏感（S）或中介（I）．該菌株在模擬胃液中3h平均存活率為90. 91%，在模擬腸液中6h平均存活率為76. 27%，對人結(jié)直腸癌細胞（HT-29）的平均黏附力為18. 55%．體外抑菌試驗表明，該菌株對空腸彎曲菌、大腸埃希氏菌、大腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌等常見腸道致病菌的生長具有明顯的抑制能力．通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導建立小鼠結(jié)腸炎模型試驗表明，益生菌處理組小鼠便血癥狀減輕，4種血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 指標明顯下降，該菌株對DSS 誘導的小鼠結(jié)腸炎有預防治療作用．綜上所述，戊糖片球菌（P. pentosaceus）GZ0620具有良好抑菌抗炎作用，在人和動物功能性食品中具有應用潛力．

關(guān)鍵詞： 發(fā)酵食品；戊糖片球菌；益生性；DSS誘導；結(jié)腸炎

中圖分類號： TS201. 3 文獻標志碼： A DOI：10. 19907/j. 0490-6756. 240160

1引言

動物腸道微生物（Gut Microbiome，GM）在維持宿主健康方面發(fā)揮著重要作用，其通過代謝產(chǎn)物、模式識別和免疫調(diào)節(jié)等途徑對宿主產(chǎn)生影響［1］．腸道微生物有助于維持腸道通透性和功能，在碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸的代謝中起著重要作用［2］，并作為腸腦功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一通過腸腦軸對宿主行為等產(chǎn)生影響［3］．越來越多研究表明腸道菌群的失衡在人和動物的腸胃類疾病中發(fā)揮作用［4］．炎癥性腸病（Inflammatory BowelDiseases，IBD）是一種慢性炎癥性胃腸道疾病，以腹瀉、直腸出血、間歇性惡心、腹痛等為主要癥狀，但其發(fā)病機制目前尚不明確［5］，其中腸道微生物及其代謝物在IBD 的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用［6］．近年來，IBD 的發(fā)病趨勢在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢［7-9］．盡管與全球水平相比，中國目前的IBD患病率較低，但發(fā)病率呈現(xiàn)增長趨勢［10］，需要針對IBD 采取更加安全有效的治療策略以幫助IBD患者．

益生菌（Probiotics）作為健康食品及膳食補充劑，可以減少胃腸道中不同病原體的發(fā)展，其代謝物可以調(diào)節(jié)腸道屏障，調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)［11］，不僅可以改善人和動物腸道健康，還可以對人肥胖、2型糖尿病、高血脂等心血管疾病等疾病的治療起到積極作用［12］．研究表明通過益生菌干預IBD 模型小鼠，有助于調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群及炎癥情況［13］，同時避免了抗生素治療造成的抗生素相關(guān)性腹瀉［14］等問題，從而為IBD 的治療提供一項安全策略．而酸菜等食品在天然發(fā)酵過程中，其發(fā)酵環(huán)境有利于乳酸菌類益生菌的生長．解文利［15］通過16S 擴增子宏基因組分析結(jié)果表明，發(fā)酵蔬菜中乳桿菌屬（Lactobacillus）等益生菌豐度較高，并從中分離出了41 株乳酸菌進行篩選評估．張?zhí)鸬龋?6］也從發(fā)酵食品中分離出了具有益生潛力的菌株以進行篩選利用． 同時，食品源益生菌具有更高的食用安全性，因此具有很高的開發(fā)利用價值．

本研究針對一株從天然發(fā)酵酸辣子食品中分離篩選得到的編號為GZ0620 的戊糖片球菌（P.pentosaceus），對其安全性、在模擬腸胃液中的存活率、對HT-29細胞的黏附性、抑菌能力進行了體外評估．此外，通過構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型，對其抗炎作用進行了體內(nèi)試驗評估，為該菌株的進一步開發(fā)利用及其在人和動物功能性食品中的應用打下基礎(chǔ)．

2材料與方法

2. 1主要材料

戊糖片球菌（P. pentosaceus）GZ0620 菌株分離篩選自貴州省黎平縣果利寨農(nóng)家天然發(fā)酵自制酸辣子食品，該菌株于2022年10月13日被中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏收錄（編號CGMCCNo. 25906，專利號：ZL202211489854. 1［17］）．

試驗所用其他菌株信息如表1 所示．體內(nèi)試驗所用模式動物為無特定病原體級別4 周齡雄性昆明小鼠（成都達碩），實驗動物所用途徑皆遵循四川大學動物試驗倫理要求．

2. 2方法

2. 2. 1溶血性及抗生素敏感性 將戊糖片球菌GZ0620 菌株復蘇培養(yǎng)后用接種環(huán)蘸取菌液在哥倫比亞血平板上劃線接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察有無溶血環(huán)的出現(xiàn)．以溶血葡萄球菌作為陽性對照，LGG 作為陰性對照．

采用紙片擴散法（K-B 法）進行藥物敏感試驗．無菌棉球浸于20 μL 1×106 CFU/mL 菌懸液中，涂布于平板上，每三分之一固體培養(yǎng)基固定一張藥敏紙片，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑（mm），試驗設置3 次重復．判定標準參考CLSI 標準中藥物敏感性判定方法．

2. 2. 2模擬胃、腸液耐受性測定 模擬胃液由氯化鈉、稀酸和胃蛋白酶組成，胃蛋白酶濃度為3. 2 g/L，最終pH 為2. 5；模擬腸液由磷酸鹽、胰蛋白酶和0. 3% 的膽鹽組成，胰蛋白酶濃度為0. 464 g/L，最終pH 為6. 8．參考前人研究方法［18］并依據(jù)試驗條件稍作修改進行．調(diào)整菌懸液活菌數(shù)至1×108 CFU/mL，加入9 mL 模擬胃液中，通過10 倍梯度稀釋法對活菌數(shù)量進行計數(shù)，于37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h 后采用上述方法計活菌數(shù)；模擬腸液存活率測定采用同樣的方法，分別于0 h 和6 h 時進行10 倍梯度稀釋并計活菌數(shù)．試驗設置三次重復，LGG 作為對照．用如下公式計算存活率：

2. 2. 3菌株對HT-29細胞的黏附性測定 參考實驗室已發(fā)表試驗方法稍作修改進行［19］．對結(jié)腸癌細胞HT-29 復蘇、傳代，待細胞貼壁生長至70%～80%，吸出細胞培養(yǎng)液并用無菌PBS 沖洗1～2 次，取1 mL 1×10⁶ CFU/mL GZ0620 菌懸液加入細胞板中，取20μL 菌液用10 倍梯度稀釋法計活菌數(shù)，記為N1，置于37 ℃培養(yǎng)箱中2 h．吸出菌懸液并用PBS 洗滌2～3 次． 向細胞板中加入0. 7 mL 0. 25% 胰蛋白酶并放置10 min，吸取0. 3mL RPMI-1640 培養(yǎng)基加入細胞板中終止消化過程，采用上述方法進行平板計數(shù)，記為N₂．試驗設置3次重復，LGG 作為對照． 用如下公式計算存活率.

其中，N為黏附率（% ）；N₁ 為0h 時起始活菌數(shù)（CFU）；N₂為2h時黏附活菌數(shù)（CFU）.

2. 2. 4菌株的抑菌試驗 調(diào)整致病菌菌懸液活菌數(shù)至1×10⁸ CFU/mL，待固體培養(yǎng)基為40～50 ℃時，以致病菌菌懸液∶瓊脂培養(yǎng)基=1∶5 的比例向培養(yǎng)基中加入致病菌菌懸液，混勻后分裝至培養(yǎng)皿中． 待培養(yǎng)基凝固后用直徑為6 mm 的打孔器在平板中打孔． GZ0620 菌液離心后收集發(fā)酵上清液，吸取50 μL 發(fā)酵上清液至瓊脂板孔內(nèi)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中24 h 后測量抑菌圈直徑．試驗設置3 次重復，LGG 作為對照．

2. 2. 5小鼠結(jié)腸炎模型試驗 參考前人研究方法［20］修改調(diào)整進行．

4周齡無特定病原體雄性昆明小鼠以每籠3 只隨機分為9籠，正常飼養(yǎng)7d后將27 只小鼠以每組3 籠，每籠3 只隨機分為CK 對照組、DSS 模型組和GZ0620 處理組．采用4%（W/V）葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）建立小鼠結(jié)腸炎模型，GZ0620 處理組在試驗期間采用濃度為5×10⁹ CFU/mL 的GZ0620 菌懸液灌胃處理．試驗周期和處理如表2所示．

血清炎癥因子檢測：分別在預防期和治療期結(jié)束時，每籠隨機選取1 只小鼠進行眼眶取血，將所得血液于3000 r/min 下離心10 min 后收集小鼠血清，立即送成都里來生物科技有限公司進行血清炎癥因子檢測，采用ELISA 試劑盒測定血清中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α4個炎癥因子指標．

2. 2. 6數(shù)據(jù)分析 用IBM SPSS Statistics 27. 0軟件統(tǒng)計分析結(jié)果，使用T 檢驗進行兩組數(shù)據(jù)間的比較，使用單因素ANOVA 進行兩組以上數(shù)據(jù)間的比較（兩兩比較使用LSD 法）．

3結(jié)果與分析

3.1安全性初步評估

菌株首先必須對人和動物安全才能進行后續(xù)益生性狀試驗及開發(fā)利用，安全性通常以溶血性和抗生素抗性作為重要指標．如圖1 所示，經(jīng)溶血性檢測，對照菌株LGG 未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，溶血葡萄球菌出現(xiàn)透明溶血環(huán)，而戊糖片球菌GZ0620 菌株在血平板上也沒有溶血現(xiàn)象． 藥敏試驗表明，克拉霉素和氯霉素對GZ0620 產(chǎn)生的抑菌圈在敏感（S）范圍內(nèi)，其對上述兩種抗生素敏感；而四環(huán)素、氨芐西林、頭孢曲松、克林霉素對GZ0620 產(chǎn)生的抑菌圈在中介（I）范圍內(nèi)，其對上述四種抗生素中介（表3）．

3. 2菌株對動物胃腸環(huán)境適應能力評估

益生菌要充分發(fā)揮其益生作用，首先要能適應人和動物胃腸中較強的酸性及多種酶的存在等環(huán)境． 本研究人工模擬胃液和腸液試驗表明，GZ0620 菌株在模擬胃液中處理3 h 平均存活率為90. 91% 且顯著高于對照菌株LGG 存活率75. 87%（Plt;0. 05）．在人工模擬腸液中處理6 h后，GZ0620 菌株的平均存活率為76. 27%，略低于對照菌株LGG的存活率81. 53%，二者無顯著差異（Pgt;0. 05）（圖2）．

本研究黏附試驗表明（圖3），GZ0620 菌株對HT-29 細胞的平均黏附率顯著高于對照菌株LGG（Plt;0. 05），為18. 55%．其具有較好的黏附能力，有利于該菌在腸胃環(huán)境中的定植，從而幫助抑制病原菌生長．

3. 3菌株抑菌能力

本研究抑菌試驗表明，GZ0620菌株對以下6種常見腸道有害菌均產(chǎn)生抑菌圈（表4），其對于以下腸道有害菌的生長繁殖均有一定抑制作用．GZ0620 菌株對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌以及大腸彎曲菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑與LGG 相比較有顯著差異，其中對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑大于LGG，說明該菌株對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的生長抑制能力較強，其有助于抑制腸道病原細菌滋生，保持腸道健康．

3. 4小鼠結(jié)腸炎模型試驗

本試驗采用自由飲用4% 葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）水溶液方法構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型．試驗結(jié)果表明，試驗小鼠在連續(xù)飲用DSS 水溶液7 天后表現(xiàn)出活動力下降、便血等癥狀．預防期結(jié)束時，與CK 組相比，DSS 組小鼠血清中4 種炎癥因子指標明顯增加，且IL-1β、IL-6、IL-8 均極顯著高于CK 組（Plt;0. 01）．GZ0620 組小鼠IL-1β、IL-6、IL-8 水平均極顯著低于DSS 組（Plt;0. 01），其中IL-1β 和IL-6 與CK 組相比具有顯著差異（Plt;0. 05），此外IL-8和TNF-α 與CK 組相比無顯著差異，且GZ0620 組小鼠血清炎癥因子水平更接近于CK 組小鼠（表5）． DSS 組小鼠較GZ0620 組小鼠便血情況比較嚴重，GZ0620 灌胃組小鼠便血情況明顯減輕或無明顯便血情況．小鼠便血情況觀察及預防期炎癥因子測定表明小鼠結(jié)腸炎模型造模成功．

治療期結(jié)束時，DSS 組小鼠血清中各炎癥因子水平均顯著高于CK 組小鼠（Plt;0. 05），從炎癥因子水平來看，DSS 組小鼠在治療期停止灌胃DSS 后無明顯自愈情況． GZ0620 組小鼠血清炎癥因子水平在治療期結(jié)束時更接近于CK 組小鼠且IL-1β、IL-6 水平極顯著低于DSS 組小鼠（Plt;0. 01）．綜合對比不同時期小鼠炎癥因子水平來看，戊糖片球菌GZ0620 干預后對DSS 誘導的小鼠結(jié)腸炎具有緩解治療作用．

4討論

發(fā)酵食品發(fā)展歷史悠久，研究表明其在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生生物活性肽、胞外多糖等物質(zhì)，對腸道健康具有積極影響［21］． 同時，發(fā)酵食品中含有大量多樣的微生物，其中乳桿菌屬、片球菌屬等乳酸菌含量豐富［22］．發(fā)酵食品作為含有豐富益生菌且食用安全性較高的來源具有益生菌開發(fā)方面的潛力，近年來有許多研究從發(fā)酵蔬菜等食品中分離出了具有益生潛力的菌株［23-25］，拓展了微生物資源庫． 在益生菌菌株中，戊糖片球菌（P. pento?saceus）具有抑菌抗炎、抗癌、抗氧化等多種應用潛力，其作為益生菌和生物制劑具有進一步發(fā)展的可能性［26］．因此從具有本土特色的發(fā)酵食品中挖掘益生菌株，不僅可以應用于疾病防治等方面，還可以進一步豐富微生物資源庫、拓展微生物研究材料．

本研究中從貴州傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸辣子中分離出的一株編號為GZ0620 的戊糖片球菌表現(xiàn)為不溶血，且對六種抗生素大類中的常見抗生素：克拉霉素（大環(huán)內(nèi)酯類）、氯霉素（酰胺醇類）、頭孢曲松（頭孢菌素類）、克林霉素（林可酰胺類）、四環(huán)素（四環(huán)素類）、氨芐西林（β-內(nèi)酰胺類）抗生素均表現(xiàn)為敏感（S）或中介（I），具有良好的安全性，排除了一定的安全隱患，有利于其功能性益生潛力的進一步探究和開發(fā)利用． 戊糖片球菌GZ0620 表現(xiàn)出對克拉霉素和氯霉素較高的敏感度，因此其在作為益生菌制劑開發(fā)利用過程中，應避免與上述六種抗生素，特別是與克拉霉素和氯霉素同時使用，以免影響其益生功能的發(fā)揮． 以往研究中益生菌在人工腸胃液存活率范圍在23. 36%～89. 17%［27］，而本研究中該菌株在模擬腸胃液中的存活率均在73% 以上，表現(xiàn)出了較高的生存能力，更有益于其在腸胃環(huán)境中的定植從而發(fā)揮其益生功能．通常情況下，人和動物胃液pH 范圍在1. 5-5. 0 左右，前人研究表明分離得到的益生菌菌株在pH 值達2. 0 的模擬胃液中幾乎無法存活，因此益生菌一般建議避免空腹食用［28］，而該菌株在pH 值達2. 5 的酸性環(huán)境中其存活率依然達90% 左右，可能是由于食品的發(fā)酵的環(huán)境使得菌株的耐酸能力得到了一定的馴化，表現(xiàn)出了對人和動物胃腸環(huán)境較強的適應能力，這提示發(fā)酵食品中具有耐酸性菌株開發(fā)的巨大潛力．益生菌對腸壁細胞的附著能力也會影響其益生功能的發(fā)揮，戊糖片球菌GZ0620 表現(xiàn)出的黏附性顯著高于對照菌株（Plt;0. 05），為其在腸胃系統(tǒng)中存活定植及益生作用的發(fā)揮提供了基礎(chǔ)，較高的黏附性也可以幫助其與病原菌競爭定植位點從而抑制病原菌的生長［29］． 此外，本研究中該菌株可能通過產(chǎn)生細菌素、有機酸等抑菌物質(zhì)來拮抗病原菌［30］，從而表現(xiàn)出了對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌、大腸彎曲菌生長的抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果較為明顯，其代謝物中可能含有對這兩種致病菌生長抑制有效的細菌素，可以作為特定致病菌抗菌劑進一步探究． 本研究動物試驗中發(fā)現(xiàn)DSS 組小鼠在停止灌胃DSS后，其便血情況和炎癥因子指標在無干預情況下的過程中并沒有產(chǎn)生明顯變化，降低了其本身自愈能力對于灌胃菌株效果觀察的影響．前人研究發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵食品中分離得到的益生菌對于調(diào)節(jié)由DSS 誘導的小鼠炎癥反應和氧化應激，以及小鼠腸道菌群有積極作用［31，32］．本研究體內(nèi)動物試驗也表明戊糖片球菌GZ0620 可以緩解由DSS 誘導的結(jié)腸炎炎癥狀況，灌胃GZ0620 的小鼠便血情況明顯減輕或無明顯便血情況，并且IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 四種炎癥因子指標明顯低于DSS 組并且更接近于CK 組小鼠，小鼠活動狀態(tài)與炎癥因子變化與前人研究呈現(xiàn)出類似趨勢［33］，表明戊糖片球菌GZ0620 及其代謝物可能通過參與信號及代謝通路產(chǎn)生一定的抗炎效果，從而對DSS 誘導的結(jié)腸炎小鼠具有緩解治療作用．

本研究從貴州傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸辣子中分離出的一株編號為GZ0620 的戊糖片球菌（P. pentosa?ceus），并通過安全性、功能性以及其抑菌抗炎作用進行了評估，特別是驗證了其在建立的小鼠結(jié)腸炎模型中的作用，從而為食品源益生菌的開發(fā)提供思路，同時為微生物組調(diào)節(jié)劑治療腸胃疾病方面途徑提供了材料，拓展了具有本土特色的微生物資源庫．未來還需要進一步研究該菌株其他方面的益生性能，以及其發(fā)揮益生性能的作用機制；并通過全基因組測序技術(shù)等探究其功能以及在疾病方面的應用，從而進行進一步開發(fā)利用以進一步發(fā)揮益生菌在調(diào)節(jié)人體及其他動物健康方面的優(yōu)勢．