石莼多糖通過抑制黑色素合成降低蘋果炭疽葉枯菌分生孢子的侵染

摘要：炭疽葉枯病是蘋果生產上主要的早期落葉病，石莼多糖能提升蘋果對炭疽葉枯病的抗性。本研究通過室內接種、孢子萌發和實時熒光定量PCR方法探究石莼多糖對炭疽葉枯菌侵染的抑制作用及機制。結果表明，石莼多糖處理后接種和先接種后石莼多糖處理的蘋果葉片和果實的平均發病率分別為19.35%和18.50%，而對照和接種后24 h后再用石莼多糖處理的葉片和果實的平均發病率分別為36. 50%和46. 83%，病原菌侵入早期石莼多糖處理可降低炭疽葉枯病的發生率：石莼多糖促進分生孢子芽管持續伸長，不能形成黑化的附著胞，也不能形成有效的侵染釘；組織學觀察表明石莼多糖處理后的附著胞在葉片上僅部分形成侵染釘，但沒有進一步發育和刺破寄主表皮細胞：實時熒光定量PCR表明石莼多糖處理6、12、24 h時黑色素合成相關基因CfSCD相對表達量分別降至對照的18.2%、31.3%、47.6%。綜上，石莼多糖通過促進炭疽葉枯菌分生孢子芽管生長，減少附著胞的形成，抑制黑色素合成，從而降低分生孢子對寄主的侵染。本研究結果為石莼多糖在炭疽葉枯病防治中的應用探明了方向，可為炭疽葉枯病的綠色防治提供技術途徑。

關鍵詞：石莼多糖：蘋果炭疽葉枯病；分生孢子；侵染；附著胞

中圖分類號：S436.611.12 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0152-06

炭疽葉枯病是目前蘋果生產上主要的早期落葉病之一，造成‘嘎啦’、‘金冠’等感病蘋果品種的大量落葉，影響蘋果的品質，降低產量。炭疽葉枯病的流行性極強，自2010年首次在江蘇、山東報道以來，呈逐年擴散態勢，目前已擴散到我國除云貴川外的蘋果產區，對蘋果生產影響巨大，導致感病品種的大面積減少。蘋果炭疽葉枯病由炭疽菌屬（Colletotrichum）的多種病原菌造成，病原菌寄主范圍廣，遺傳多樣性豐富，變異速度快。目前，炭疽葉枯病的防治主要靠化學藥劑，吡唑醚菌酯是生產上最有效的藥劑。但病原菌的抗藥性發展迅速，生產上已進化出抗藥性菌株且所占比率急速上升，亟需替代藥來防治炭疽葉枯病。

石莼多糖是石莼屬綠藻的細胞壁多糖，約占綠藻干重的9%～36%，是一類含有硫酸根的酸性多糖，主要有鼠李糖、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和木糖。石莼多糖對生物體有豐富的生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降血脂和調節免疫等。研究發現，石莼多糖能夠提升蘋果對炭疽葉枯病的抗性，還能促進炭疽葉枯菌分生孢子萌發，抑制附著胞形成，降低炭疽葉枯病發生，但其作用機制尚不明確。本研究通過室內接種、孢子萌發和實時定量PCR方法探究石莼多糖提升蘋果對炭疽葉枯病抗性的組織學和分子生物學機制，以期為病害的綠色防控提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蘋果炭疽葉枯菌菌株GC20190701于2019年7月分離自青島農業大學現代農業示范園，經多基因聯合鑒定為Colletotrichum aenig-mo，-80℃保存。利用察氏培養基誘導炭疽葉枯菌分生孢子，接種菌絲塊后搖培3d，用4層滅菌紗布過濾，將濾液5 000 r/min離心5 min，用純水懸浮沉淀的孢子配制孢子懸浮液。采用血球計數板計數，調整孢子濃度為1×105個/mL。孢子懸浮液隨配隨用。供試蘋果樹品種為‘嘎啦’，樹齡5年，栽植于青島農業大學校內實驗用果園，正常肥水管理，果園內不噴施化學藥劑。供試石莼多糖純度為50%，購于上海源葉生物科技有限公司，生產批號為C17J12Y138029。

1.2 石莼多糖對蘋果炭疽葉枯病發病的影響

采用分生孢子懸浮液人工接種離體組織的方法測定。設3個處理，T1：先接種孢子懸浮液，1h后噴施10 mg/mL石莼多糖溶液；T2：先噴施10mg/mL石莼多糖溶液，1h后接種孢子懸浮液；T3：先接種孢子懸浮液，保濕24 h后再噴施10mg/mL石莼多糖溶液。以僅接種孢子懸浮液為對照。分別接種于葉片、幼果和成熟果實，每處理3個重復。各處理樣品密封于保濕盒中并保持相對濕度100%，置于25℃培養箱中培養。接種3d觀察葉片發病癥狀，接種Sd觀察果實發病癥狀，統計病斑數，測量病斑面積。

1.3 石莼多糖對蘋果炭疽葉枯菌分生孢子萌發及附著胞發育的影響

在分生孢子懸浮液中加入石莼多糖，使其最終濃度分別為5 mg/mL和10 mg/mL；以加入純水的分生孢子懸浮液為對照（CK）。將50μL配制好的分生孢子懸浮液滴在載玻片兩端，每端1個接種點，培養條件同1.2。每處理9個載玻片，分別于接種后6、12、24 h各取出3張載玻片，在顯微鏡下觀察分生孢子的萌發及附著胞的形成，并計算孢子萌發率及附著胞黑化率。重復3次。

1.4 炭疽葉枯菌分生孢子侵染蘋果葉片的組織學觀察

設置先接種孢子懸浮液、th后噴施5 mg/mL石莼多糖溶液和先噴施5 mg/mL石莼多糖溶液、th后接種孢子懸浮液2個處理，以只接種分生孢子懸浮液的葉片為對照，每處理3個重復。培養條件同1.2。培養24 h后取出葉片，用打孔器從每張葉片上隨機打取4個直徑10 mm的葉盤，浸入冰醋酸、酒精混合液（體積比3：1）中透明24 h。將透明葉盤取出，用蒸餾水沖洗后置于5% KOH溶液，水浴鍋中煮沸10～20 min使葉盤完全透明。用蒸餾水浸泡20 min，取出葉盤置于載玻片上，用兩張載玻片將上下表皮搓開，取有上表皮的玻片，滴加0.1%的甲基藍溶液染色10 min，經蒸餾水漂洗脫色后以甘油作浮載劑在光學顯微鏡下觀察。重復3次。

1.5 炭疽葉枯菌黑色素合成相關基因表達分析

配制含10 mg/mL石莼多糖的分生孢子懸浮液，以純水的分生孢子懸浮液為對照，每處理3個重復。將處理好的分生孢子懸浮液在25℃搖床180 r/min搖培，分別在培養0、6、12、24 h后取出，用滅菌紗布過濾后離心富集。利用柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒提取真菌總RNA;使用HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）合成cDNA；在Light Cycler 96 System RealtimePCR儀（羅氏公司）上用Tap Pro Universal SYBRQpcr Master Mix系統進行實時熒光定量PCR，上述試劑均為上海生工生物工程有限公司產品。以alpha-tubulin基因作為內參基因，基因相對表達量采用2-ΔΔCt計算。3次生物學重復。

1.6 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2019軟件和SPSS 21.0軟件對試驗數據進行統計分析，用LSD法進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 石莼多糖對蘋果炭疽葉枯病發病的影響

由圖1可知，接種1h后石莼多糖處理（T1）和石莼多糖處理th后接種（T2）的葉片和果實平均發病率分別為18.50%和19.35%，而CK和接種24 h后再用石莼多糖處理（T3）的葉片和果實平均發病率分別為36.50%和46. 83%，后兩組的發病率顯著高于前兩組（P＜0.05），表明石莼多糖在病原菌侵入早期對蘋果炭疽葉枯菌分生孢子有明顯的抑制作用。但T3處理葉片和果實的發病率與CK沒有顯著差異，對分生孢子的侵入沒有明顯的抑制作用。以上結果表明，石莼多糖能在蘋果炭疽葉枯菌分生孢子侵入早期起到抑制作用，而當分生孢子完成侵入后，石莼多糖對病原菌侵入后病害潛育和顯癥無明顯作用。

2.2 石莼多糖對蘋果炭疽葉枯菌分生孢子萌發及附著胞發育的影響

由圖2可見，分生孢子在濃度為5 mg/mL和10 mg/mL石莼多糖溶液中均能正常萌發，并且石莼多糖促進了分生孢子的萌發和芽管的伸長，但抑制了附著胞內黑色素的積累。接種6h后，CK及各處理條件下分生孢子均可萌發產生芽管和附著胞，石莼多糖溶液處理下芽管的平均長度大于對照組，對照組的分生孢子附著胞內黑色素積累并開始黑化，但石莼多糖處理中附著胞內未見明顯的黑色素積累；接種12 h和24 h后，對照組的分生孢子產生的附著胞內黑色素持續積累，附著胞高度黑化，變成完全不透光的黑點：接種24 h時，對照組的附著胞中心出現一個氣泡狀亮點，為產生的侵染釘；但在5 mg/mL和10 mg/mL石莼多糖處理中，分生孢子在接種12 h和24 h后芽管持續伸長，附著胞內僅有少量黑色素積累，不能形成黑化的附著胞，也不能形成侵染釘。

2.3 炭疽葉枯菌分生孢子侵染蘋果葉片的組織學觀察

為了進一步明確石莼多糖對病原菌分生孢子侵染的影響機制，采用組織學技術觀察分生孢子在蘋果葉片上的侵入。設置先接種后噴石莼多糖溶液和先噴石莼多糖溶液后接種兩個處理，培養24 h后觀察（圖3）發現，石莼多糖處理和對照的分生孢子都能萌發產生芽管和附著胞，并且附著胞內都有黑色素積累，但對照組的分生孢子附著胞黑化程度較石莼多糖處理高：處理組附著胞形狀變化較大、不規則；對照組附著胞上有清晰的侵染釘，呈現氣泡狀，而石莼多糖處理組的分生孢子僅部分附著胞上有侵染釘，呈現黑點狀，沒有觀察到進一步的發育和侵入到寄主表皮細胞的組織：先接種后噴石莼多糖和先噴石莼多糖后接種兩種處理間分生孢子附著胞形成和黑化沒有顯著差異。

2.4 石莼多糖處理對黑色素合成相關基因CfSCD表達的影響

為驗證石莼多糖對黑色素合成的調控作用，通過實時熒光定量PCR測定了CfSCD基因的表達動態。結果（圖4）表明，對照處理中，CfSCD相對表達量在處理6h內迅速升高，至12 h顯著下降，之后又緩慢上升；石莼多糖處理中，CjSCD的表達較對照受到較大程度的抑制，6h時降至對照的18.2%，12 h時降至對照的31.3%，24 h時降至對照的47.6%。在石莼多糖處理樣品中，CfSCD表達量隨時間延長增加緩慢，在6h至12 h之間增加不顯著。

3 討論與結論

蘋果炭疽葉枯病是由炭疽菌屬（ColLetotri-chum spp.）病原菌引起的流行性非常強的早期落葉病，生產上以化學防治為主，但由于病害潛育期短，防治窗口期較短。吡唑醚菌酯是一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，對炭疽葉枯病防治效果較好，但炭疽葉枯菌容易對其產生抗藥性，目前生產上已經出現了高比例的抗藥性菌株。因此，亟需尋找吡唑醚菌酯的替代藥劑以制定更合理的炭疽葉枯病防控方案。

綠藻含有豐富的多糖物質，是我國重要的海洋經濟海藻之一。石莼多糖是綠藻水溶性硫酸多糖，在生物材料學、抗病毒、抗氧化、抗高血脂、免疫刺激和功能性食品等方面有廣闊的應用前景。有報道表明，石莼多糖能提高寄主對炭疽葉枯病的抗性，影響炭疽葉枯菌分生孢子的早期侵染結構。本研究結果顯示，在分生孢子侵入早期，石莼多糖能顯著降低炭疽葉枯菌分生孢子對嘎啦蘋果葉片的侵染，葉片和果實上葉枯病的抑制率平均達50%以上，但石莼多糖并不影響分生孢子的萌發，反而刺激芽管的伸長，減少附著胞形成，抑制黑色素積累，可能是因為石莼多糖誘導病原菌將能量主要應用于促進病原菌生長的生理活動，降低了黑色素合成過程能量分配，進而影響了黑色素的合成。

侵染葉片是炭疽葉枯菌等真菌典型的直接侵入方式。分生孢子萌發產生芽管，在芽管頂端形成附著胞，隨著黑色素積累，附著胞黑化。在與寄主的接觸點，黑化附著胞產生侵染釘，作為侵入結構穿透寄主表皮細胞，隨后病原菌產生染囊泡和初級菌絲，與寄主建立寄生關系。附著胞內黑色素積累對病原菌完成侵染至關重要，侵染釘侵入寄主細胞需要極大的壓力，附著胞黑化后才能承受侵入過程的膨壓。本研究組織學觀察發現，石莼多糖處理后附著胞不能形成有效的侵染釘，未能穿透寄主表皮細胞。因此，石莼多糖抑制了黑色素的積累，導致病原菌不能成功侵入寄主。

CfSCD基因是黑色素合成相關基因之一，該基因缺失后黑色素不能合成。本研究對CfSCD的表達進行了實時熒光定量PCR檢測，結果表明石莼多糖處理后CfSCD基因的表達量較對照明顯降低，暗示石莼多糖通過抑制黑色素合成相關基因的表達抑制黑色素的合成。本研究還發現在接種24 h后，分生孢子完成侵染，再用石莼多糖處理，并不能抑制炭疽葉枯病的發生，間接表明病原菌侵染成功后石莼多糖不能誘導寄主產生顯著的抗病性。

綜上，石莼多糖通過促進分生孢子芽管生長減少附著胞的形成、抑制黑色素合成，降低分生孢子對寄主的侵染。本研究結果為石莼多糖在炭疽葉枯病防治中的應用探明了方向，可為炭疽葉枯病的綠色防治提供技術途徑。

基金項目：國家重點研發計劃項目（2023YFD1401404）；國家蘋果產業技術體系項目（CARS - 27）；山東省自然科學基金項目（ZR2020MC114）