基于全基因組關(guān)聯(lián)分析和代謝組學(xué)篩選奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀關(guān)鍵基因

摘要：體細(xì)胞數(shù)性狀是奶牛生產(chǎn)及育種中的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，篩選該性狀相關(guān)的重要功能基因、挖掘關(guān)鍵分子標(biāo)記，對(duì)奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀的遺傳改良具有重要意義。本研究通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）和代謝組學(xué)聯(lián)合分析篩選影響體細(xì)胞數(shù)性狀的重要基因及關(guān)鍵代謝物。首先，使用Illumina Bovine 50K SNP芯片鑒定2 709頭荷斯坦奶牛的基因型，利用奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀的基因組估計(jì)育種值（genomic estimated breeding val-ue，GEBV）進(jìn)行GWAS，篩選到ⅣPFFR2、ZNF831、SLC4A4、SLM02、SKAP1和CBX1六個(gè)候選基因；KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，候選基因主要富集在神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、胰腺分泌、膽汁分泌、近端小管碳酸氫鹽再生和Rapl倍號(hào)通路等生物過(guò)程。其次，選擇高體細(xì)胞數(shù)（Hscc）和低體細(xì)胞數(shù)（Lscc）兩種極端表型的奶牛，基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC -MS/MS）進(jìn)行血漿代謝組學(xué)分析，篩選出71種血漿顯著差異代謝物；相較于Hscc組，Lscc組有皮質(zhì)醇、醛固酮和桂皮酸乙酯等57種差異代謝物表達(dá)量上調(diào)，牛磺脫氧膽酸、相酸等14種差異代謝物表達(dá)量下調(diào)；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)顯著差異代謝物主要在醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收、膽汁分泌、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、酮體的合成與降解等通路顯著富集。GWAS與代謝組學(xué)聯(lián)合分析表明，膽汁分泌是調(diào)控體細(xì)胞數(shù)性狀的重要通路，影響膽汁分泌過(guò)程的SLC4A4基因與膽汁分泌代謝物皮質(zhì)醇可作為影響奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀的關(guān)鍵基因和代謝物。本研究結(jié)果可為奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀的遺傳改良提供重要候選基因和分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：奶牛體細(xì)胞數(shù)；SLC4A4基因：全基因組關(guān)聯(lián)分析：代謝組學(xué)分析；血漿差異代謝物

中圖分類號(hào)：S823.91： Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025） 03-0158-08

牛奶是世界上重要的乳制品來(lái)源，奶牛業(yè)是世界經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。牛奶中體細(xì)胞數(shù)是反映奶牛健康和評(píng)估乳品質(zhì)量的重要指標(biāo)。乳汁中體細(xì)胞數(shù)增加通常與乳腺炎相關(guān)，這不僅影響奶牛健康，也影響乳品的安全性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。培育生產(chǎn)體細(xì)胞數(shù)較低乳汁的奶牛，提高乳品質(zhì)量，增強(qiáng)乳腺健康，一直是奶牛飼養(yǎng)者和育種學(xué)家長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。然而，由于體細(xì)胞數(shù)性狀是數(shù)量性狀，受多個(gè)微效基因調(diào)控，其遺傳改良仍需要持續(xù)挖掘關(guān)鍵基因。近年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）、代謝組學(xué)等技術(shù)為進(jìn)一步挖掘性狀相關(guān)候選基因、解析性狀形成的分子機(jī)制提供了更有效的分析手段。

GWAS已成為研究遺傳變異與復(fù)雜特征之間關(guān)系的重要方法，通過(guò)對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，能夠鑒定出與特定表型相關(guān)的基因和突變。GWAS的引入極大地促進(jìn)了對(duì)復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的理解，其中混合線性模型（line-ar mlxed models，LMM）是進(jìn)行GWAS的常見(jiàn)方法之一，該模型結(jié)合了固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)，能夠控制潛在的群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系對(duì)數(shù)據(jù)的影響，幫助解決樣本間的遺傳異質(zhì)性和相關(guān)性，提高研究的可靠性。此外，它還可以對(duì)遺傳變異的貢獻(xiàn)進(jìn)行建模，評(píng)估每個(gè)位點(diǎn)對(duì)表型特征的影響。

代謝組學(xué)研究旨在通過(guò)多種代謝組學(xué)技術(shù)，如質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR），檢測(cè)和量化生物液體中的小分子。整合多種代謝組學(xué)技術(shù)能更準(zhǔn)確地識(shí)別代謝產(chǎn)物。液相色譜—質(zhì)譜（LC-MS）是一種靈敏度高、選擇性強(qiáng)的技術(shù)，其檢測(cè)靈敏度優(yōu)于高分辨率核磁共振技術(shù)。近年來(lái)，LC-MS被廣泛應(yīng)用于篩選血液代謝物的生物標(biāo)志物，對(duì)發(fā)現(xiàn)亞臨床營(yíng)養(yǎng)疾病和代謝性疾病具有重要作用。目前通過(guò)代謝組學(xué)挖掘血液生物標(biāo)志物用于臨床診斷和改善飼養(yǎng)管理的研究較多，但運(yùn)用代謝組學(xué)挖掘跟奶牛體細(xì)胞數(shù)有關(guān)的生物標(biāo)志物的研究較少。

本研究利用美國(guó)奶牛育種委員會(huì)的基因組遺傳評(píng)估系統(tǒng)計(jì)算出體細(xì)胞數(shù)性狀的基因組估計(jì)育種值（genomic estimated breeding value，GEBV）進(jìn)行GWAS，篩選與奶牛體細(xì)胞數(shù)顯著相關(guān)的候選基因，然后采集體細(xì)胞數(shù)存在差異的奶牛血漿，采用代謝組學(xué)分析血漿中的差異代謝物，通過(guò)差異代謝物富集分析篩選與奶牛體細(xì)胞數(shù)相關(guān)代謝通路，以期為中國(guó)奶牛的基因組選擇和分子標(biāo)記輔助育種提供有價(jià)值信息。

1 材料與方法

1.1 全基因組關(guān)聯(lián)分析樣品采集

試驗(yàn)于2023年3-8月進(jìn)行，從全國(guó)11個(gè)牧場(chǎng)采集2 709頭6月齡荷斯坦奶牛的毛囊樣品，各牧場(chǎng)所在地和試驗(yàn)牛數(shù)見(jiàn)表1。

1.2 樣品基因型鑒定及體細(xì)胞數(shù)GEBV獲取

使用Illumina Bovine SNP50芯片，委托紐勤生物科技（上海）有限公司對(duì)所采集的毛囊樣品進(jìn)行基因型測(cè)定。SNP質(zhì)控條件設(shè)置為SNP位點(diǎn)檢出率≥95%、在奶牛群體中的缺失率≤5%。使用美國(guó)奶牛育種委員會(huì)（Council on Dairy CattleBreeding，CDCB）的奶牛基因組遺傳評(píng)估系統(tǒng)（ht-tps：//uscdcb.com/genetic-evaluations/）對(duì)體細(xì)胞數(shù)性狀進(jìn)行基因組遺傳評(píng)估，獲得每個(gè)個(gè)體的體細(xì)胞數(shù)性狀GEBV。

1.3 基于GEBV的體細(xì)胞數(shù)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用GEMMA v0.98.5軟件中的單變量線性混合模型（LMM）對(duì)各SNP位點(diǎn)與表型之間的相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)，該模型中包括固定效應(yīng)與隨機(jī)效應(yīng)，具體模型如下：

y= a+bx+g+e。

式中，y為表型值，a為群體均值；b為固定效應(yīng)，包括場(chǎng)效應(yīng)、出生年效應(yīng)；x是SNP基因型指示變量，取0、1或2；g為剩余多基因效應(yīng)，服從正態(tài)分布N（0，kσ2），其中k表示親緣關(guān)系矩陣，σ2表示SNP標(biāo)記解釋的加性遺傳方差：e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。為避免假陽(yáng)性，采用控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率法（1 discovery rate，F(xiàn)DR）對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行校正。

1.4 血漿樣品采集及血漿代謝物提取測(cè)定

本試驗(yàn)于2022年10月-2023年8月在山東省德州市視界牧業(yè)奶牛場(chǎng)開(kāi)展，收集同一牛舍內(nèi)體況、泌乳天數(shù)相近奶牛連續(xù)10個(gè)月的體細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)。最終篩選出高體細(xì)胞數(shù)[Hscc，（48. 28±17.76）萬(wàn)個(gè)/mL]和低體細(xì)胞數(shù)[Lscc，（2.80±0.81）萬(wàn)個(gè)/mL]奶牛各6頭。晨飼前，使用肝素鈉抗凝管采集上述12頭奶牛的全血樣本，4℃下3 000 r/min離心10 min分離血漿并分裝于1.5mL離心管，液氮速凍15 min后轉(zhuǎn)移至-80 0C冰箱保存。

測(cè)定前，將血漿樣品在4℃下解凍，向100μL樣品中加入700μL萃取劑（甲醇、乙腈、水按體積比4：2：1混合），冷藏2h后25 000xg離心15min，將沉淀干燥后重新溶于甲醇和水的混合溶液中，再次離心取上清液。使用Waters 2777C UPLC和Q Exactive HF質(zhì)譜儀對(duì)代謝物進(jìn)行分離和檢測(cè)。色譜分析采用BEH C18色譜柱，正離子模式的流動(dòng)相為含0.1%甲酸的水溶液和甲醇，負(fù)離子模式使用含10 mmol/L甲酸銨的水溶液和95%甲醇，在一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜模式下分離和檢測(cè)代謝物。得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.3軟件（Thermo Fisher Scientific，USA）分析，設(shè)置參數(shù)包括母離子質(zhì)量偏差＜5×10-6、碎片離子質(zhì)量偏差＜10×10-6、保留時(shí)間偏差＜0.2 min。結(jié)合ChemS-pider、BMDB和mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定代謝物，獲得峰面積數(shù)據(jù)。

1.5 代謝組數(shù)據(jù)的PLS -DA分析、OPLS -DA分析與差異代謝物鑒定

使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和監(jiān)督模型正交偏最小二乘判別分析（OPLS - DA）對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用t檢驗(yàn)鑒定Hscc組和Lscc組間的差異代謝物，運(yùn)用Benj amini - Hoch-berg算法對(duì)P值進(jìn)行校正，用Padjust評(píng)估兩組之間代謝物的顯著性水平，以差異倍數(shù)FC≥2（即|log2FC |≥1）、Pajust ＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型數(shù)據(jù)

經(jīng)質(zhì)量控制和缺失數(shù)據(jù)過(guò)濾后，共獲得含47 843個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)，基因型檢出率為95%，SNP基因型缺失率為5%。

2.2 體細(xì)胞數(shù)GEBV的頻數(shù)分布及描述性統(tǒng)計(jì)量

如圖1所示，2 709頭荷斯坦奶牛毛囊樣品的體細(xì)胞數(shù)GEBV近似正態(tài)分布。奶牛體細(xì)胞數(shù)GEBV平均值為2.93萬(wàn)個(gè)/mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.13萬(wàn)個(gè)/mL，最小值為2.55萬(wàn)個(gè)/mL，最大值為3.37萬(wàn)個(gè)/mL（表2）。

2.3 體細(xì)胞數(shù)GEBV的全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用GEMMA軟件的LMM模型，設(shè)置FDR顯著性閾值為0．05，對(duì)奶牛體細(xì)胞數(shù)GEBV與SNPs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共篩選到24個(gè)SNPs（圖2，表3）與奶牛體細(xì)胞數(shù)顯著相關(guān)，其中，大部分SNPs位于6、13、19、23號(hào)染色體上。共注釋到6個(gè)基因，分別為NPFFR2、ZNF831、SLC4A4、S/-M02、SKAP1和CBX1，其中，NPFFR2和SLC4A4位于6號(hào)染色體上，ZNF831和SLM02位于13號(hào)染色體上，SKAP1和CBX1位于19號(hào)染色體上。注釋到的基因最顯著位點(diǎn)為chr6_89051385，物理位置為6：89051385，F(xiàn)DR為7.69E-09。

2.4 候選SNPs位點(diǎn)的功能分析

查閱GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取候選基因參與的生物過(guò)程以及影響到的通路，如表4所示，候選基因主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、神經(jīng)肽信號(hào)通路、鈉離子運(yùn)輸和陰離子運(yùn)輸?shù)壬镞^(guò)程，主要影響神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、胰腺分泌、膽汁分泌、近端小管碳酸氫鹽再生和Rapl信號(hào)通路。

2.5 候選基因SLC4A4顯著SNP位點(diǎn)基因型統(tǒng)計(jì)

在SLC4A4上存在2個(gè)SNP位點(diǎn)：Bovine-HD0600024201（chr6： 88494442A＞G）與Bovine-HD0600024213（chr6： 88527916C ＞T）。兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型GEBV均值見(jiàn)表5，其中位點(diǎn)Bovine-HD0600024201基因型A/A、A/G、C／G的GEBV均值分別為2. 96、2.94、2.90，位點(diǎn)Bovine-HD0600024213基因型T/T、T/C、C/C的GEBV分別為2.96、2.94、2.91，可作為該SNP優(yōu)勢(shì)基因型。體細(xì)胞數(shù)GEBV值越小表明體細(xì)胞數(shù)值越低，因此Bo-vineHD0600024201和BovineHD0600034213的優(yōu)勢(shì)等位基因分別為G和C。

2.6 代謝組數(shù)據(jù)的PLS-DA分析和OPLS-DA分析

對(duì)Hscc組和Lscc組樣品的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），結(jié)果（圖3A）顯示，組內(nèi)樣品間聚類趨勢(shì)明顯，組間樣品分離趨勢(shì)明顯，表明樣品的重復(fù)性較好：主成分1可以解釋兩組樣品間20.86%的變異，主成分2可以解釋兩組樣品間9.4%的變異。進(jìn)一步采用監(jiān)督模型正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對(duì)完整數(shù)據(jù)集進(jìn)行概述，并區(qū)分組間差異，結(jié)果（圖3B）顯示，兩組樣品有明顯分離趨勢(shì)：其中R2Y=0.991，表明模型有較好的解釋率；Q2（cum）=0.522，表明該模型有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.7 高、低體細(xì)胞數(shù)組間差異代謝物及富集分析

以Padjust ＜0.05、|log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選Hscc組和Lscc組奶牛血漿差異代謝物，共得到71種差異代謝物（圖4）；相較于Hscc組，Lscc組有皮質(zhì)醇、醛固酮和桂皮酸乙酯等57種差異代謝物表達(dá)量上調(diào)，牛磺脫氧膽酸、相酸等14種差異代謝物表達(dá)量下調(diào)。KEGG富集分析（圖4B）發(fā)現(xiàn)，這些差異代謝物主要在醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收、膽汁分泌、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、酮體的合成與降解等通路顯著富集（P＜0.05）。顯著富集到的差異代謝物有皮質(zhì)醇、醛固酮、乙醇酸和檸檬酸鹽等（P＜0.05），其中，顯著富集到膽汁分泌通路上的差異代謝物為皮質(zhì)醇（表6）。

3 討論與結(jié)論

本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和代謝組學(xué)分析方法篩選影響奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀的關(guān)鍵基因和代謝物。篩選出NPFFR2、ZNF831、SLC4A4、SL-M02、SKAP1和CBX1六個(gè)候選基因與奶牛體細(xì)胞數(shù)顯著相關(guān)。其中，SLC4A4與奶牛乳腺炎相關(guān)。SLC4A4基因編碼一種鈉／碳酸氫鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NBCel），在許多組織中發(fā)揮著重要作用，特別是在肝臟中調(diào)節(jié)酸-堿平衡。研究表明，酸堿平衡可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡，特別是氫離子和鈉離子的平衡，這些離子的濃度變化可以影響肝細(xì)胞的代謝活性和膽汁的合成，SLC4A4可能通過(guò)調(diào)節(jié)酸堿平衡，進(jìn)一步調(diào)節(jié)膽汁分泌。然而SLC4A4對(duì)奶牛乳腺炎的影響及其作用機(jī)制尚不明確。

進(jìn)一步利用代謝組學(xué)技術(shù)，篩選出不同體細(xì)胞數(shù)奶牛間的71種血漿顯著差異代謝物，其中，相比于高體細(xì)胞數(shù)樣品，低體細(xì)胞數(shù)組有皮質(zhì)醇、醛固酮和桂皮酸乙酯等57種差異代謝物表達(dá)量上調(diào)，牛磺脫氧膽酸、相酸等14種差異代謝物表達(dá)量下調(diào)：KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)顯著差異代謝物主要在醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收、膽汁分泌、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、酮體的合成與降解等通路顯著富集。有研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇可作為抗炎因子調(diào)節(jié)奶牛乳腺炎。膽汁酸（TCDCA）通過(guò)增加細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化、激活SIPR2和甾體生成因子SF-1，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中甾體生成相關(guān)基因的表達(dá)，從而顯著增加皮質(zhì)醇的分泌水平，其作用可通過(guò)抑制SIPR2或逆轉(zhuǎn)SF-1的激活而減少。本試驗(yàn)中，相比于Hscc組，Lscc組血液中皮質(zhì)醇水平顯著上調(diào)，富集到膽汁分泌通路。

結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析和代謝組學(xué)分析，推測(cè)SLC4A4可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子濃度影響膽汁酸堿平衡，膽汁酸通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路和SF-1的活性影響腎上腺皮質(zhì)醇的合成和釋放。與高體細(xì)胞數(shù)奶牛相比，低體細(xì)胞數(shù)奶牛血液中皮質(zhì)醇水平顯著上調(diào)，抑制了炎癥反應(yīng)。SLC4A4顯著SNP位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，BovineHD0600024201的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，BovineHD0600024213的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃，可作為對(duì)奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀進(jìn)行遺傳改良的候選分子標(biāo)記位點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和代謝組學(xué)方法篩選出SLC4A4為影響奶牛體細(xì)胞數(shù)性狀的候選基因，并提供SLC4A4基因有價(jià)值的分子標(biāo)記位點(diǎn)。下一步將重點(diǎn)針對(duì)SLC4A4開(kāi)展基因功能驗(yàn)證和分子育種利用，為優(yōu)化奶牛生產(chǎn)管理以及培育健康產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶的奶牛品種提供新思路和依據(jù)。

基金項(xiàng)目：中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)（YDZX2022153）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-36）；寧夏回族自治區(qū)重 點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202IBEF01001，2022BBF02017）