基于全基因組關聯分析和代謝組學篩選奶牛體細胞數性狀關鍵基因

摘要：體細胞數性狀是奶牛生產及育種中的重要經濟性狀之一，篩選該性狀相關的重要功能基因、挖掘關鍵分子標記，對奶牛體細胞數性狀的遺傳改良具有重要意義。本研究通過全基因組關聯分析（GWAS）和代謝組學聯合分析篩選影響體細胞數性狀的重要基因及關鍵代謝物。首先，使用Illumina Bovine 50K SNP芯片鑒定2 709頭荷斯坦奶牛的基因型，利用奶牛體細胞數性狀的基因組估計育種值（genomic estimated breeding val-ue，GEBV）進行GWAS，篩選到ⅣPFFR2、ZNF831、SLC4A4、SLM02、SKAP1和CBX1六個候選基因；KEGG通路分析發現，候選基因主要富集在神經活性配體與受體的相互作用、胰腺分泌、膽汁分泌、近端小管碳酸氫鹽再生和Rapl倍號通路等生物過程。其次，選擇高體細胞數（Hscc）和低體細胞數（Lscc）兩種極端表型的奶牛，基于液相色譜串聯質譜（LC -MS/MS）進行血漿代謝組學分析，篩選出71種血漿顯著差異代謝物；相較于Hscc組，Lscc組有皮質醇、醛固酮和桂皮酸乙酯等57種差異代謝物表達量上調，牛磺脫氧膽酸、相酸等14種差異代謝物表達量下調；KEGG富集分析發現顯著差異代謝物主要在醛固酮調節的鈉重吸收、膽汁分泌、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、酮體的合成與降解等通路顯著富集。GWAS與代謝組學聯合分析表明，膽汁分泌是調控體細胞數性狀的重要通路，影響膽汁分泌過程的SLC4A4基因與膽汁分泌代謝物皮質醇可作為影響奶牛體細胞數性狀的關鍵基因和代謝物。本研究結果可為奶牛體細胞數性狀的遺傳改良提供重要候選基因和分子標記。

關鍵詞：奶牛體細胞數；SLC4A4基因：全基因組關聯分析：代謝組學分析；血漿差異代謝物

中圖分類號：S823.91： Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0158-08

牛奶是世界上重要的乳制品來源，奶牛業是世界經濟的重要組成部分。牛奶中體細胞數是反映奶牛健康和評估乳品質量的重要指標。乳汁中體細胞數增加通常與乳腺炎相關，這不僅影響奶牛健康，也影響乳品的安全性和經濟價值。培育生產體細胞數較低乳汁的奶牛，提高乳品質量，增強乳腺健康，一直是奶牛飼養者和育種學家長期追求的目標。然而，由于體細胞數性狀是數量性狀，受多個微效基因調控，其遺傳改良仍需要持續挖掘關鍵基因。近年來，全基因組關聯分析（GWAS）、代謝組學等技術為進一步挖掘性狀相關候選基因、解析性狀形成的分子機制提供了更有效的分析手段。

GWAS已成為研究遺傳變異與復雜特征之間關系的重要方法，通過對大規模樣本進行全基因組關聯分析，能夠鑒定出與特定表型相關的基因和突變。GWAS的引入極大地促進了對復雜性狀遺傳基礎的理解，其中混合線性模型（line-ar mlxed models，LMM）是進行GWAS的常見方法之一，該模型結合了固定效應和隨機效應，能夠控制潛在的群體結構和親緣關系對數據的影響，幫助解決樣本間的遺傳異質性和相關性，提高研究的可靠性。此外，它還可以對遺傳變異的貢獻進行建模，評估每個位點對表型特征的影響。

代謝組學研究旨在通過多種代謝組學技術，如質譜（MS）和核磁共振（NMR），檢測和量化生物液體中的小分子。整合多種代謝組學技術能更準確地識別代謝產物。液相色譜—質譜（LC-MS）是一種靈敏度高、選擇性強的技術，其檢測靈敏度優于高分辨率核磁共振技術。近年來，LC-MS被廣泛應用于篩選血液代謝物的生物標志物，對發現亞臨床營養疾病和代謝性疾病具有重要作用。目前通過代謝組學挖掘血液生物標志物用于臨床診斷和改善飼養管理的研究較多，但運用代謝組學挖掘跟奶牛體細胞數有關的生物標志物的研究較少。

本研究利用美國奶牛育種委員會的基因組遺傳評估系統計算出體細胞數性狀的基因組估計育種值（genomic estimated breeding value，GEBV）進行GWAS，篩選與奶牛體細胞數顯著相關的候選基因，然后采集體細胞數存在差異的奶牛血漿，采用代謝組學分析血漿中的差異代謝物，通過差異代謝物富集分析篩選與奶牛體細胞數相關代謝通路，以期為中國奶牛的基因組選擇和分子標記輔助育種提供有價值信息。

1 材料與方法

1.1 全基因組關聯分析樣品采集

試驗于2023年3-8月進行，從全國11個牧場采集2 709頭6月齡荷斯坦奶牛的毛囊樣品，各牧場所在地和試驗牛數見表1。

1.2 樣品基因型鑒定及體細胞數GEBV獲取

使用Illumina Bovine SNP50芯片，委托紐勤生物科技（上海）有限公司對所采集的毛囊樣品進行基因型測定。SNP質控條件設置為SNP位點檢出率≥95%、在奶牛群體中的缺失率≤5%。使用美國奶牛育種委員會（Council on Dairy CattleBreeding，CDCB）的奶牛基因組遺傳評估系統（ht-tps：//uscdcb.com/genetic-evaluations/）對體細胞數性狀進行基因組遺傳評估，獲得每個個體的體細胞數性狀GEBV。

1.3 基于GEBV的體細胞數性狀的全基因組關聯分析

采用GEMMA v0.98.5軟件中的單變量線性混合模型（LMM）對各SNP位點與表型之間的相關性進行檢測，該模型中包括固定效應與隨機效應，具體模型如下：

y= a+bx+g+e。

式中，y為表型值，a為群體均值；b為固定效應，包括場效應、出生年效應；x是SNP基因型指示變量，取0、1或2；g為剩余多基因效應，服從正態分布N（0，kσ2），其中k表示親緣關系矩陣，σ2表示SNP標記解釋的加性遺傳方差：e為隨機殘差效應。為避免假陽性，采用控制錯誤發現率法（1 discovery rate，FDR）對關聯分析結果進行校正。

1.4 血漿樣品采集及血漿代謝物提取測定

本試驗于2022年10月-2023年8月在山東省德州市視界牧業奶牛場開展，收集同一牛舍內體況、泌乳天數相近奶牛連續10個月的體細胞數數據。最終篩選出高體細胞數[Hscc，（48. 28±17.76）萬個/mL]和低體細胞數[Lscc，（2.80±0.81）萬個/mL]奶牛各6頭。晨飼前，使用肝素鈉抗凝管采集上述12頭奶牛的全血樣本，4℃下3 000 r/min離心10 min分離血漿并分裝于1.5mL離心管，液氮速凍15 min后轉移至-80 0C冰箱保存。

測定前，將血漿樣品在4℃下解凍，向100μL樣品中加入700μL萃取劑（甲醇、乙腈、水按體積比4：2：1混合），冷藏2h后25 000xg離心15min，將沉淀干燥后重新溶于甲醇和水的混合溶液中，再次離心取上清液。使用Waters 2777C UPLC和Q Exactive HF質譜儀對代謝物進行分離和檢測。色譜分析采用BEH C18色譜柱，正離子模式的流動相為含0.1%甲酸的水溶液和甲醇，負離子模式使用含10 mmol/L甲酸銨的水溶液和95%甲醇，在一級和二級質譜模式下分離和檢測代謝物。得到的質譜數據導入Compound Discoverer 3.3軟件（Thermo Fisher Scientific，USA）分析，設置參數包括母離子質量偏差＜5×10-6、碎片離子質量偏差＜10×10-6、保留時間偏差＜0.2 min。結合ChemS-pider、BMDB和mzCloud數據庫鑒定代謝物，獲得峰面積數據。

1.5 代謝組數據的PLS -DA分析、OPLS -DA分析與差異代謝物鑒定

使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和監督模型正交偏最小二乘判別分析（OPLS - DA）對代謝組數據進行分析。應用t檢驗鑒定Hscc組和Lscc組間的差異代謝物，運用Benj amini - Hoch-berg算法對P值進行校正，用Padjust評估兩組之間代謝物的顯著性水平，以差異倍數FC≥2（即|log2FC |≥1）、Pajust ＜0.05為標準篩選差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 基因型數據

經質量控制和缺失數據過濾后，共獲得含47 843個SNP標記位點的基因型數據，基因型檢出率為95%，SNP基因型缺失率為5%。

2.2 體細胞數GEBV的頻數分布及描述性統計量

如圖1所示，2 709頭荷斯坦奶牛毛囊樣品的體細胞數GEBV近似正態分布。奶牛體細胞數GEBV平均值為2.93萬個/mL，標準差為0.13萬個/mL，最小值為2.55萬個/mL，最大值為3.37萬個/mL（表2）。

2.3 體細胞數GEBV的全基因組關聯分析

使用GEMMA軟件的LMM模型，設置FDR顯著性閾值為0．05，對奶牛體細胞數GEBV與SNPs進行關聯分析，共篩選到24個SNPs（圖2，表3）與奶牛體細胞數顯著相關，其中，大部分SNPs位于6、13、19、23號染色體上。共注釋到6個基因，分別為NPFFR2、ZNF831、SLC4A4、S/-M02、SKAP1和CBX1，其中，NPFFR2和SLC4A4位于6號染色體上，ZNF831和SLM02位于13號染色體上，SKAP1和CBX1位于19號染色體上。注釋到的基因最顯著位點為chr6_89051385，物理位置為6：89051385，FDR為7.69E-09。

2.4 候選SNPs位點的功能分析

查閱GO和KEGG數據庫，獲取候選基因參與的生物過程以及影響到的通路，如表4所示，候選基因主要參與信號轉導、G蛋白偶聯受體信號通路、神經肽信號通路、鈉離子運輸和陰離子運輸等生物過程，主要影響神經活性配體與受體的相互作用、胰腺分泌、膽汁分泌、近端小管碳酸氫鹽再生和Rapl信號通路。

2.5 候選基因SLC4A4顯著SNP位點基因型統計

在SLC4A4上存在2個SNP位點：Bovine-HD0600024201（chr6： 88494442A＞G）與Bovine-HD0600024213（chr6： 88527916C ＞T）。兩個SNP位點基因型GEBV均值見表5，其中位點Bovine-HD0600024201基因型A/A、A/G、C／G的GEBV均值分別為2. 96、2.94、2.90，位點Bovine-HD0600024213基因型T/T、T/C、C/C的GEBV分別為2.96、2.94、2.91，可作為該SNP優勢基因型。體細胞數GEBV值越小表明體細胞數值越低，因此Bo-vineHD0600024201和BovineHD0600034213的優勢等位基因分別為G和C。

2.6 代謝組數據的PLS-DA分析和OPLS-DA分析

對Hscc組和Lscc組樣品的代謝組數據進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），結果（圖3A）顯示，組內樣品間聚類趨勢明顯，組間樣品分離趨勢明顯，表明樣品的重復性較好：主成分1可以解釋兩組樣品間20.86%的變異，主成分2可以解釋兩組樣品間9.4%的變異。進一步采用監督模型正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對完整數據集進行概述，并區分組間差異，結果（圖3B）顯示，兩組樣品有明顯分離趨勢：其中R2Y=0.991，表明模型有較好的解釋率；Q2（cum）=0.522，表明該模型有較好的預測能力。

2.7 高、低體細胞數組間差異代謝物及富集分析

以Padjust ＜0.05、|log2FC|≥1為標準篩選Hscc組和Lscc組奶牛血漿差異代謝物，共得到71種差異代謝物（圖4）；相較于Hscc組，Lscc組有皮質醇、醛固酮和桂皮酸乙酯等57種差異代謝物表達量上調，牛磺脫氧膽酸、相酸等14種差異代謝物表達量下調。KEGG富集分析（圖4B）發現，這些差異代謝物主要在醛固酮調節的鈉重吸收、膽汁分泌、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、酮體的合成與降解等通路顯著富集（P＜0.05）。顯著富集到的差異代謝物有皮質醇、醛固酮、乙醇酸和檸檬酸鹽等（P＜0.05），其中，顯著富集到膽汁分泌通路上的差異代謝物為皮質醇（表6）。

3 討論與結論

本研究利用全基因組關聯分析和代謝組學分析方法篩選影響奶牛體細胞數性狀的關鍵基因和代謝物。篩選出NPFFR2、ZNF831、SLC4A4、SL-M02、SKAP1和CBX1六個候選基因與奶牛體細胞數顯著相關。其中，SLC4A4與奶牛乳腺炎相關。SLC4A4基因編碼一種鈉／碳酸氫鹽共轉運蛋白（NBCel），在許多組織中發揮著重要作用，特別是在肝臟中調節酸-堿平衡。研究表明，酸堿平衡可調節肝細胞內外的離子平衡，特別是氫離子和鈉離子的平衡，這些離子的濃度變化可以影響肝細胞的代謝活性和膽汁的合成，SLC4A4可能通過調節酸堿平衡，進一步調節膽汁分泌。然而SLC4A4對奶牛乳腺炎的影響及其作用機制尚不明確。

進一步利用代謝組學技術，篩選出不同體細胞數奶牛間的71種血漿顯著差異代謝物，其中，相比于高體細胞數樣品，低體細胞數組有皮質醇、醛固酮和桂皮酸乙酯等57種差異代謝物表達量上調，牛磺脫氧膽酸、相酸等14種差異代謝物表達量下調：KEGG富集分析發現顯著差異代謝物主要在醛固酮調節的鈉重吸收、膽汁分泌、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、酮體的合成與降解等通路顯著富集。有研究發現，皮質醇可作為抗炎因子調節奶牛乳腺炎。膽汁酸（TCDCA）通過增加細胞外信號調節激酶（ERK）的磷酸化、激活SIPR2和甾體生成因子SF-1，促進腎上腺皮質細胞中甾體生成相關基因的表達，從而顯著增加皮質醇的分泌水平，其作用可通過抑制SIPR2或逆轉SF-1的激活而減少。本試驗中，相比于Hscc組，Lscc組血液中皮質醇水平顯著上調，富集到膽汁分泌通路。

結合全基因組關聯分析和代謝組學分析，推測SLC4A4可能通過調節細胞內外離子濃度影響膽汁酸堿平衡，膽汁酸通過調節ERK信號通路和SF-1的活性影響腎上腺皮質醇的合成和釋放。與高體細胞數奶牛相比，低體細胞數奶牛血液中皮質醇水平顯著上調，抑制了炎癥反應。SLC4A4顯著SNP位點分析發現，BovineHD0600024201的優勢等位基因為G，BovineHD0600024213的優勢等位基因為C，可作為對奶牛體細胞數性狀進行遺傳改良的候選分子標記位點。

綜上所述，本研究利用全基因組關聯分析和代謝組學方法篩選出SLC4A4為影響奶牛體細胞數性狀的候選基因，并提供SLC4A4基因有價值的分子標記位點。下一步將重點針對SLC4A4開展基因功能驗證和分子育種利用，為優化奶牛生產管理以及培育健康產優質奶的奶牛品種提供新思路和依據。

基金項目：中央引導地方科技發展專項（YDZX2022153）；現代農業（奶牛）產業技術體系建設項目（CARS-36）；寧夏回族自治區重 點研發計劃項目（202IBEF01001，2022BBF02017）