小麥×玉米遠緣雜交誘導(dǎo)小麥雙單倍體育種技術(shù)的研究與進展

摘要：小麥常規(guī)育種存在自交不親和、育種及繁殖周期長、基因純合度低等問題，小麥×玉米遠緣雜交雙單倍體育種技術(shù)為小麥快速創(chuàng)制新種質(zhì)提供了新的途徑和技術(shù)保障，有利于縮短育種周期，提升育種進程，提高選擇效率，是小麥快速且有效育種的方法之一。針對小麥×玉米遠緣雜交的育種技術(shù)研究現(xiàn)狀，總結(jié)了單倍體產(chǎn)生、單倍體胚培養(yǎng)、染色體加倍技術(shù)及其影響因素的研究進展，可為小麥遺傳育種提供技術(shù)和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥×玉米；單倍體育種；遠緣雜交；雙單倍體

Research and Progress on Breeding Techniques of Induced Wheat Double Haploid by Wheat × Maize Distant Hybridization

ZENG Tianyun，LIN Xia，GUO Zongzong，ZHANG Wentao，ZHU Yu

（Shihezi Academy of Agricultural Sciences，Shihezi 832000，Xinjiang）

雙單倍體育種是選育植物新品種的重要技術(shù)之一，其核心原理是利用植物配子（花粉或胚珠）培育成單倍體植株，再通過染色體加倍技術(shù)快速獲得雙單倍體純合植株，具有縮短育種周期以及提高育種效率和質(zhì)量等優(yōu)點[1-3]。雙單倍體育種技術(shù)因其簡化誘導(dǎo)程序、提高單倍體誘導(dǎo)頻率的優(yōu)勢，備受育種家青睞。產(chǎn)生雙單倍體的方法有輻射花粉誘導(dǎo)法[4]、孤雌生殖、組織培養(yǎng)、藥劑處理[5]、遠緣雜交[6-7]等。小麥單倍體主要通過雄核發(fā)育或雌核發(fā)育產(chǎn)生[8]，獲得單倍體植株后，常用秋水仙素處理使染色體加倍獲得雙單倍體植株并正常結(jié)

實[9]。其他作物，如馬鈴薯主要通過花粉誘導(dǎo)或子房離體培養(yǎng)獲得雙單倍體[10]；水稻主要通過微孢子培養(yǎng)或花藥培養(yǎng)獲得雙單倍體[11]；玉米主要通過藥劑誘導(dǎo)孤雌生殖獲得雙單倍體，除此之外也可通過單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)種內(nèi)雜交產(chǎn)生雙單倍體[5]。小麥常用的雙單倍體誘導(dǎo)方法是花藥培養(yǎng)法和玉米花粉誘導(dǎo)法[12]。花藥培養(yǎng)法能夠高效獲得單倍體，且操作過程比較簡單，缺點是培育成本高、愈傷誘導(dǎo)率不高、成苗率和染色體加倍率低[13-14]。玉米花粉誘導(dǎo)法的主要流程是通過玉米花粉的誘導(dǎo)使小麥產(chǎn)生單倍體胚，并在單倍體胚生長到一定時期時進行幼胚挽救[15]。該方法優(yōu)點是對小麥基因型的要求并不嚴格，此外，玉米花粉誘導(dǎo)法單倍體胚的誘導(dǎo)率更高，單倍體植株不會產(chǎn)生白化苗，成苗率高，從而顯著提高植株的培養(yǎng)效率，獲得更多的小麥單倍體植株[16]。因此，玉米花粉誘導(dǎo)法相較于花藥培養(yǎng)法具有更廣闊的應(yīng)用前景和更廣泛的應(yīng)用范圍。本文通過對小麥×玉米遠緣雜交誘導(dǎo)小麥雙單倍體育種技術(shù)的主要影響因素進行比較和論述，分析具體操作參數(shù)優(yōu)缺點，旨在為小麥雙單倍體育種技術(shù)工作提供參考，推進小麥快速育種工作的進程。

1 遠緣雜交誘導(dǎo)小麥單倍體發(fā)展歷程

遠緣雜交包括種間雜交、屬間雜交[17]。早在1970年就有學(xué)者通過球莖大麥和普通小麥雜交產(chǎn)生高頻率單倍體小麥的報道。英國學(xué)者Laurie等[18-19]證明，受精作用可以發(fā)生在普通小麥和玉米之間。1988年Laurie等[20-21]首次利用小麥與玉米雜交獲得小麥單倍體苗，且雜交得胚率比球莖大麥×普通小麥高出百倍。此后，研究人員陸續(xù)發(fā)表了普通小麥與黑麥、高粱、鴨茅狀摩擦禾等雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生小麥單倍體的研究論文[22-24]。這些研究極大地推動了利用遠緣雜交誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的理論與技術(shù)的發(fā)展。我國1973年首次從小麥花粉中誘導(dǎo)出單倍體苗，自此我國單倍體育種技術(shù)道路逐漸開辟出來[25-26]。截至目前，小麥×玉米屬間遠緣雜交已經(jīng)是最廣泛和成功的單倍體誘導(dǎo)應(yīng)用技術(shù)，在全世界小麥雙單倍體品種中約占75%[27-28]。

2 小麥×玉米單倍體誘導(dǎo)率的主要影響因素

2.1 基因型對小麥單倍體的影響 小麥和玉米基因型對小麥×玉米單倍體誘導(dǎo)率均具有一定影響。Kour等[29]認為不同小麥品種或基因型對產(chǎn)生單倍體有極大影響。Matzk等[30]研究報道稱小麥×玉米產(chǎn)生單倍體對小麥基因型選擇并不敏感，通過此方法獲得單倍體，對小麥品種選擇差異不顯著，1993年他們在四倍體硬粒小麥的研究中得出，不同基因型或不同類型小麥均可產(chǎn)生單倍體，通過花藥離體培養(yǎng)能成功獲得單倍體，說明誘導(dǎo)單倍體的產(chǎn)生對小麥基因型無特殊的選擇性。喬祥梅等[31]對9個F2小麥材料與2種玉米類型授粉研究得出，小麥基因型、玉米基因型以及二者互作效應(yīng)對單倍體誘導(dǎo)率均有極顯著影響，但玉米基因型的影響更大，是小麥基因型的4.85倍。趙翠榮等[32]用4個玉米基因型對5個小麥晚播材料進行花粉誘導(dǎo)，最高誘導(dǎo)得胚率可達22.2%。Suenaga等[33]利用4個玉米單交品種對1個小麥材料授粉，得胚率最高可達31.9%，組合間差異顯著。陳新民等[34]利用3個玉米單交品種對小麥材料授粉，得胚率達13.3%～33.1%，且組合間差異顯著。丁明亮等[35]利用8個玉米品種對6個小麥DH系進行雙單倍體誘導(dǎo)，得胚率最高可達38.17%。所以，篩選得胚率高的玉米基因型，可顯著提高單倍體誘導(dǎo)效率。

2.2 環(huán)境條件對小麥單倍體的影響 環(huán)境條件如空氣濕度、溫度、授粉環(huán)境、土壤營養(yǎng)或營養(yǎng)液成分等對單倍體胚的發(fā)育均有不同程度的影響，其中空氣濕度的影響較大。1998年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院進行小麥×玉米雜交試驗發(fā)現(xiàn)，得胚率在相同授粉條件下產(chǎn)生顯著差異，溫室雜交平均得胚率（29.2%）比大田高8倍，這可能是由于單倍體胚生長發(fā)育更適于溫室的光照、溫度和濕度條件，特別是對溫度和濕度的要求更敏感，這也是導(dǎo)致大田試驗不同年份間得胚率差異較大的因素[36]。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的相關(guān)報道也得出類似結(jié)論，授粉后立即澆水比不澆水得胚率提高3%～7%，飽粒率提高19%；授粉后空氣濕度gt;85%和lt;70%兩類天氣下得胚率和結(jié)實率分別較低空氣濕度下提高13.39%和30.32%；說明授粉后充足的土壤水分和適當(dāng)?shù)目諝鉂穸瓤纱蟠筇岣叩门呗蔥37]。但地區(qū)環(huán)境差異較大，在一些氣候干燥地區(qū)，即便在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，濕度同樣是相對難調(diào)控的因素之一。濕度在同一培養(yǎng)周期內(nèi)均勻調(diào)控，且最大濕度調(diào)整到75%～85%，在實際操作中較難實現(xiàn)，因此濕度忽高忽低將極大地降低單倍體誘導(dǎo)率。

2.3 授粉方式對小麥單倍體的影響

2.3.1 授粉方法 授粉方法不同對得胚率有顯著影響。1997年我國學(xué)者對3種授粉方法包括不去雄授粉技術(shù)、改良版垂直剪穎剪藥技術(shù)和常規(guī)去雄授粉技術(shù)比較發(fā)現(xiàn)，得胚率之間具有顯著差異[36]。Inagaki等[38]通過對常規(guī)去雄授粉技術(shù)、割穗離體培養(yǎng)+常規(guī)去雄授粉技術(shù)及割穗離體培養(yǎng)+熱水殺雄技術(shù)3種方法進行比較發(fā)現(xiàn)，得胚率并無顯著差異，但采用熱水殺雄可統(tǒng)一管理，3min快速殺雄，與常規(guī)去雄授粉技術(shù)相比速度快幾倍，且割穗離體培養(yǎng)可人為調(diào)節(jié)植株生長發(fā)育條件，節(jié)省空間，有效提高試驗效率。常規(guī)授粉技術(shù)比改良版垂直剪穎技術(shù)得胚率高8.5%，缺點是相對費工費時。改良版垂直剪穎技術(shù)無需整穗，流程和操作簡單，可作為首選授粉方法。鄭琪[39]研究得出，割穗離體培養(yǎng)得胚率是田間自然生長的2倍以上。Campbell等[40]使用刷子、毛筆等蘸取玉米花粉與常規(guī)去雄小麥逐朵小花進行雜交，每小時每人可完成雜交40～50穗，但效率難以滿足授粉需要。2006年云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)明了去雄技術(shù)+“滾粉法”，每小時每人最少完成授粉600～800穗，得胚率和結(jié)實率最高可達19.94%和88.77%[15，37]。此外，劉瑩等[41]在去雄前割穗離體培養(yǎng)，整穗后將穗頭和玉米花粉裝入紙袋，劇烈晃動紙袋進行授粉，得胚率最高可達33.6%。

2.3.2 授粉次數(shù) 授粉次數(shù)不同，雜交后得胚率不同[42]。1次授粉得胚率顯著低于2次授粉，這可能是由于同一麥穗不同位置的小花開花時間不一致，2次授粉可彌補第1次的授粉不完全，使不同位置小花在最佳時間授粉，從而提高得胚率[43]。此外，來長凱等[44]在第1次授粉后24h進行第2次授粉，得胚率最高可達11.2%。所以，玉米花粉與麥穗小花的總授粉時間、授粉面積以及授粉花粉量對單倍體誘導(dǎo)效率的影響較大。

2.4 單倍體胚發(fā)育及培養(yǎng)對小麥單倍體的影響 小麥與玉米雜交產(chǎn)生的單倍體胚得不到胚乳營養(yǎng)供應(yīng)，只能發(fā)育到球形胚或原胚之前，所以早期會出現(xiàn)植株夭亡的現(xiàn)象[12]。實際生產(chǎn)中使用植物激素

2，4-D對雜交后的麥穗、小穗或小花進行處理，可使單倍體胚膨大直至離體培養(yǎng)[45]。

2，4-D處理方法主要分為5種，包括小花滴注處理、節(jié)間注射處理、蘸穗處理、割穗離體處理和噴灑柱頭處理。噴灑柱頭處理得胚率高，操作簡便；割穗離體處理可控條件多，易獲得高得胚率。2，4-D處理濃度、時間以及處理次數(shù)對單倍體胚發(fā)育和得胚率的提高有顯著影響。王廣金[46]使用100mg/kg 2，4-D得胚率最高。Zhang等[47]用小穗培養(yǎng)法通過2，4-D處理雜交穗發(fā)現(xiàn)，高濃度藥劑更有利于得胚率和幼胚數(shù)量的提高。Laurie等[21]發(fā)現(xiàn)，授粉后4h或24h通過節(jié)間注射50～100mg/kg 2，4-D，得胚率可有效提高。蔡華等[48]研究指出，重復(fù)用2，4-D處理可顯著提高得胚率；授粉后5h進行100mg/kg 2，4-D處理，平均得胚率達7.5%，24h后同一濃度再進行一次2，4-D處理，平均得胚率可達9.5%；其原因可能是重復(fù)處理補充了對小穗或節(jié)間的藥劑流失或劑量不足，也可能是2，4-D處理促進了單倍體胚細胞分裂和生長發(fā)育，使得子房快速膨大從而提高得胚率。

胚的胚齡和大小、培養(yǎng)基類型、離體培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件對單倍體胚的發(fā)育均有明顯影響。單倍體胚離體培養(yǎng)最佳時間是14d左右，此時幼胚直徑在0.5～1.0mm之間，是胚挽救的最佳時期[37，49]。培養(yǎng)基對不同植物的種類有選擇特異性。楊忠慧等[15]和Shirdelmoghanloo等[50]認為，小麥適合用1/2MS、C7、W14培養(yǎng)基。吳曉軍等[51]的研究表明，MC3培養(yǎng)基在不同小麥材料中培養(yǎng)效果最好，平均萌發(fā)率65.6%，平均成苗率38.2%。除了培養(yǎng)基，還可以添加谷氨酰胺、活性炭、肌醇、脯氨酸、椰子汁等有機添加劑[52]。陳新民等[42]采用不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基+生長素+細胞分裂素培養(yǎng)單倍體幼胚，成苗率可達80%左右。高艷等[53]研究認為，1/2 MS+1.0mg/L KT+3.0mg/L多效唑+100mg/L肌醇+5%蔗糖+0.6%瓊脂，pH5.8處理后成苗率最高達52.51%。末永一博等[54]指出，單倍體胚離體培養(yǎng)受光照、溫度等環(huán)境影響。Riera等[55]設(shè)置光溫培養(yǎng)箱32℃暗培養(yǎng)3d+26℃培養(yǎng)處理，成苗率最高達到37.92%；在25℃/12℃（白天/黑夜）、16h光照處理條件下進行幼胚培養(yǎng)，成苗率最高達到81%。

3 小麥單倍體加倍率的主要影響因素

通過單倍體胚發(fā)育產(chǎn)生的單倍體苗不能進行自然加倍或直接用于遺傳育種[56]。單倍體染色體加倍分為人工加倍和自然加倍2種，人工加倍目前一般采用化學(xué)加倍，加倍率較高；自然加倍通過自發(fā)加倍，加倍率低[57]。單倍體苗染色體加倍的化學(xué)藥劑主要有秋水仙素、普羅胺、甲基氨丙磷、氟樂靈等，其中，大多采用秋水仙素進行染色體加倍，用其處理后加倍率較高，缺點是毒性大，需要在通風(fēng)櫥處

理[35]。Mjueeb-Kazi等[43]通過浸根法進行染色體加倍，加倍率最高可達70%。尹米琦等[58]對分蘗節(jié)注射法、葉片涂抹法、培養(yǎng)基添加秋水仙素和培養(yǎng)基添加除草劑的研究顯示，培養(yǎng)基添加20mmol/L秋水仙素加倍率最高可達85.7%。此外，浸根時長、避光處理、分蘗節(jié)打孔或分蘗節(jié)切口、通氣處理對單倍體苗染色體加倍均有顯著影響[33，59]。

4 單雙倍體的鑒定途徑

植物的倍性鑒定是鑒別和篩選單倍體植株的必經(jīng)之路，在小麥[60]、白菜[61]、水稻[62]、油菜[63]、大麥[64]、黑麥[65]、西瓜[66]等多種作物中均有報道。鑒定方法包括形態(tài)學(xué)鑒定、解剖學(xué)鑒定、細胞學(xué)鑒定、生理生化特征鑒定、流式細胞儀鑒定、分子標(biāo)記鑒定等，其中主要通過形態(tài)學(xué)鑒定、細胞學(xué)鑒定和流式細胞儀鑒定方法進行鑒定[67]。不同鑒定方法各有特點，在鑒定植株倍性時應(yīng)結(jié)合實際，選擇合適的一種或幾種方法鑒定。

4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定是主要的傳統(tǒng)倍性鑒定方法。Compton等[68]研究表明，花粉囊直徑、雄花花瓣、子房直徑等是西瓜倍性鑒定指標(biāo)。同源多倍體通常表現(xiàn)為植株粗壯、根系旺盛伴有葉片皺縮以及生長期滯后等。優(yōu)點是方法簡單直觀，缺點是易受主觀和環(huán)境影響，可靠性和準確性不穩(wěn)定。

4.2 解剖學(xué)鑒定 解剖學(xué)鑒定主要選取植物生長期內(nèi)新鮮嫩葉，取葉片下表皮，通過顯微鏡觀察植物組織或細胞結(jié)構(gòu)，如花粉粒大小或形狀、氣孔的大小或密度、葉綠素數(shù)量以及保衛(wèi)細胞的形態(tài)等[69]。該方法操作簡便，相較于形態(tài)學(xué)鑒定更加準確，且對組織發(fā)生層的3層細胞都可以進行鑒定。

4.3 細胞學(xué)鑒定 細胞學(xué)鑒定又被稱為染色體計數(shù)鑒定，是最直接、最可靠的倍性鑒定方法之一[70]。方法是根尖制片或嫩梢壓片，主要步驟包括根尖提取、預(yù)處理、固定、解離、染色、壓片等步驟，該方法優(yōu)點是結(jié)果可靠，缺點是操作復(fù)雜、對專業(yè)和技術(shù)經(jīng)驗要求高，檢測速率低，不適用于大批量試驗樣品鑒定。

4.4 生理生化特征鑒定 生理生化特征鑒定主要通過鑒定植物組織酶活性、營養(yǎng)物質(zhì)來判斷植物倍性，具有準確、直接的優(yōu)點[71]。多倍體植物通常水分含量高、滲透壓較高、蒸騰作用和呼吸作用弱，營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)含量低，開花和熟期早。單倍體植物則水分含量較低、滲透壓較低、蒸騰作用和呼吸作用較強，營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)含量高，開花和熟期較晚。

4.5 分子標(biāo)記鑒定 分子標(biāo)記鑒定是現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)物，該方法具有穩(wěn)定性強、不受環(huán)境因素影響、操作簡單、快速，結(jié)果準確等優(yōu)點，可用于數(shù)量性狀遺傳規(guī)律的研究。常用的分子標(biāo)記包括AFLP、RAPD、ISSR、SSR等，用于不同植物后代的倍性鑒定[69]。單一分子標(biāo)記均有一定局限性，不能揭示足夠的遺傳信息，所以需要結(jié)合幾種分子標(biāo)記技術(shù)，才能對植株倍性和遺傳組成進行全面的分析。

4.6 流式細胞儀鑒定 流式細胞儀鑒定通過檢測細胞分裂期間DNA的含量，在計算機分析下，繪制DNA含量曲線變化圖，以已知倍性植物作為對照，判斷待測植株的倍性，是最準確、最簡便、最快捷的倍性鑒定方法[72]。此外，應(yīng)用流式細胞儀還可檢測混倍體。該方法優(yōu)點是快速、準確，缺點是在純系育種工作中，無法鑒定出自然加倍的雙單倍體植株是否純合。

5 小麥雙單倍體育種技術(shù)存在的問題及展望

小麥常規(guī)育種存在育種周期長、基因型純合速度慢、性狀改良精準性差等缺點，小麥×玉米遠緣雜交雙單倍體育種技術(shù)極大地解決了這一問題，提高了育種家的選擇效率，被廣泛地應(yīng)用到小麥遺傳育種工作中。但受到地區(qū)環(huán)境條件、試驗方法、操作流程等影響，導(dǎo)致單倍體得胚率不穩(wěn)定，單倍體苗加倍率、加倍效率低等，還需技術(shù)優(yōu)化與創(chuàng)新，開發(fā)高效、低毒、環(huán)保的誘導(dǎo)和加倍方法，提高單倍體胚誘導(dǎo)頻率、萌發(fā)率及染色體加倍效率。

應(yīng)進一步深入研究單倍體誘導(dǎo)和染色體加倍的遺傳機理，如利用基因編輯技術(shù)精準調(diào)控相關(guān)基因表達，同時，雙單倍體育種應(yīng)結(jié)合雜交育種和分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)，精準快速鑒定與篩選單、雙單倍體，提高育種效率，創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，提高遺傳的多樣性。同時，雙單倍體育種技術(shù)在單倍體誘導(dǎo)過程中能將隱性基因突變篩選出來，有利于基因功能的研究，對基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因和基因編輯等方面也具有非常重要的應(yīng)用價值。未來伴隨染色體工程和基因工程的逐漸完善和應(yīng)用，遠緣雜交誘導(dǎo)小麥雙單倍體育種技術(shù)將會有更廣闊的發(fā)展前景。

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（收稿日期：2024-12-19）