細胞角蛋白19 片段抗原21-1 檢測方法的研究進展

摘要 細胞角蛋白19 片段抗原21-1（Cytokeratin 19 fragment antigen 21-1， CYFRA21-1）是一種新型腫瘤標志物，在癌癥篩查和診斷中尤其是對非小細胞肺癌的篩查和診斷具有重要的作用，近年來備受關注。在肺癌診斷、預后及治療中，血清中的CYFRA21-1 含量水平具有重要的臨床意義。目前，研究者開發了酶聯免疫吸附分析法、化學發光法、熒光法、免疫層析法、電化學法和表面增強拉曼光譜等方法用于血清中CYFRA21-1 的檢測，為癌癥早期診斷提供了技術支持。但是，關于CYFRA21-1 檢測方法的研究進展還鮮見報道。本文簡要介紹了CYFRA21-1 及其臨床意義，綜述了近年來CYFRA21-1 檢測技術所取得的研究進展，以期為開發更靈敏、準確、快速和便捷的CYFRA21-1 檢測方法提供參考。

關鍵詞 細胞角蛋白19 片段抗原21-1；腫瘤標志物；檢測方法；肺癌；評述

癌癥是人類生命健康的重要威脅。近幾十年來，癌癥死亡率持續下降，其中癌癥的篩查和治療方法的發展起到了重要作用[1]。傳統的癌癥診斷方法包括具有侵入性的病理組織活檢和有放射性的CT 掃描等，不適用于癌癥的反復篩查。近年來，通過檢測血液等體液中的生物標志物水平進行癌癥篩查已成為研究熱點。體液和組織樣本中的癌癥標志物包括蛋白[2–4]、核酸[5]和細胞因子[6]等多類物質，其含量水平不僅可以反映癌癥的發生，還能揭示癌癥的發展進程[7]。因此，癌癥標志物的檢測對癌癥篩查、治療和預后判斷等均具有重要的臨床意義[8-10]。

肺癌是我國發病率和死亡人數最高的癌癥[11]，具有早期癥狀隱匿和病程發展快等特點，對其治療手段有限，因此，早期篩查是降低肺癌死亡率的重要手段之一。我國國家衛生健康委員會發布的《原發性肺癌診療指南（2023 年版）》指出，肺癌診斷相關的血清學腫瘤標志物包括癌胚抗原（CEA）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）、糖類抗原（Carbohydrate antigen， CA）125、CA153、CA19-9、細胞角蛋白片段19抗原21-1（Cytokeratin 19 fragment antigen 21-1， CYFRA21-1）和鱗狀上皮細胞癌抗原（SCC）等[11]。80%以上的肺癌屬于非小細胞癌，研究表明，對患者血清中的CYFRA21-1 含量水平的測定有助于非小細胞肺癌的篩查[12]。目前，已建立了多種CYFRA21-1 的檢測方法，但相關的研究進展還鮮見報道。本文簡要介紹了CYFRA21-1 及其臨床意義，綜述了近年來CYFRA21-1 的檢測方法，尤其是近十年來CYFRA21-1 檢測技術取得的進展，以期為開發更靈敏、準確、快速和便捷的CYFRA21-1 檢測方法提供參考。

1 CYFRA21-1 簡介

細胞角蛋白屬于中間絲蛋白家族，是上皮細胞骨架主要的結構蛋白。根據分子量和雙向電泳中等電點的不同，角蛋白主要分為Ⅰ類（酸性蛋白）和Ⅱ類（堿性蛋白）[13] 兩個亞群。角蛋白會根據細胞類型和分化階段特異性表達，因此可以作為潛在的感知上皮細胞異常的腫瘤標志物[14]。

細胞角蛋白19 是角蛋白家族中最小的成員，廣泛分布于正常組織表面。在正常生理條件下，細胞角蛋白19 在外周血、骨髓和淋巴結中無表達或低表達。在惡性上皮腫瘤中，激活的蛋白酶加速細胞降解，構成其胞內主要細胞骨架的中間絲發生斷裂和降解，大量的細胞角蛋白片段釋放，使組織液和體液中細胞角蛋白19 可溶性片段濃度升高[15]。其中，能被BM19.21 和KS19.1 兩株單克隆抗體特異性識別的可溶性片段被命名為CYFRA21-1[16]，健康人血清中的CYFRA21-1 濃度不超過3.3 ng/mL[17]。

在臨床診斷中，血清CYFRA21-1 的含量水平能夠為肺癌的分型提供重要依據，是輔助診斷非小細胞肺癌的首選標志物之一。研究表明， CYFRA21-1 對非小細胞肺癌診斷的靈敏度約為40%～64%[18]。單一的肺癌標志物對癌癥診斷存在局限性，結合CEA、SCC 和NSE 等其它生物標志物能夠更好地判斷癌癥發展水平，可用于評估肺癌臨床分期[19]。高水平的CYFRA21-1 可能預示較差的預后，而治療過程中CYFRA21-1 濃度的下降則可能提示治療有效，患者預后較好[20]。對人體內CYFRA21-1 濃度變化的監測可以為癌癥治療過程提供參考，有助于評估治療的有效性和調整后續治療方案[21]。此外， CYFRA21-1在其它多種惡性腫瘤（如胸腺癌[22]、乳腺癌[23]、鼻咽癌[24]和食道鱗狀細胞癌[25]等）的輔助診斷和篩查中也具有重要的臨床意義。因此， CYFRA21-1 水平的監測對于評估癌癥患者治療預后、制定個體化治療策略都具有重要意義。

2 檢測方法

2.1 質譜方法

液相色譜-串聯質譜（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）是一種結合了液相色譜高效分離和質譜的強大分析能力的分析技術。同位素稀釋質譜法（Liquid chromatography isotopedilution mass spectrometry， LC-IDMS）是檢驗醫學溯源聯合委員會認定的蛋白定值方法[26]，是將已知質量和豐度的穩定同位素作為稀釋劑加入樣品中，通過質譜檢測同位素豐度比，進而準確定量分析目標蛋白，具有可絕對測量、靈敏度高和動態范圍寬等特點。預先篩選出蛋白的特征肽段，然后在樣本酶切時添加已知量的同位素標記肽段，利用高效液相色譜法將肽段分離，使用質譜檢測該特征肽段的響應強度，通過響應強度比即可得到肽段含量，從而得到樣本中目標蛋白的含量。Genet 等[27]通過蛋白質沉淀、親和層析技術分離血清中的CYFRA21-1，利用胰蛋白酶將其消化后，建立了基于特征肽段AALEDTLAETA 的同位素稀釋質譜法，用于準確定量分析血清中CYFRA21-1 的含量，線性范圍為1.0～100 ng/mL，最低定量限為1.0 ng/mL。該方法可以有效減小基質的干擾效應，在線性范圍內所有濃度的組間準確度和精密度均小于15%，具有較高的靈敏度、準確性和精密度。

質譜方法雖然具有較高的準確度和靈敏度，并可實現結果的量值溯源，但是需要復雜的預實驗、繁瑣的前處理過程和昂貴的大型儀器，難以滿足大規模檢測的要求，并且單個樣本檢測成本高。

2.2 免疫分析方法

2.2.1 酶聯免疫吸附分析法

酶聯免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）是一種常用的生化分析方法，其原理是利用包被在酶標板上的抗體特異性捕獲目標蛋白，經過洗滌后，加入檢測抗體和酶標二抗（酶標抗體）識別，洗滌去除未結合抗體后，催化底物發生顯色反應，通過終止反應并測量顯色強度，可以實現目標蛋白的定量檢測（圖1）。張慧茹等[28]建立了基于雙抗體夾心模式的ELISA 方法，檢測CYFRA21-1 的線性范圍為0.7～25.0 ng/mL，檢出限為666.8 pg/mL。ELISA 方法具有靈敏度高、特異性好、成本低、重復性好以及可同時快速測定多個樣品等優點，但操作復雜且耗時，對操作者的技術熟練度要求較高。

2.2.2 化學發光免疫分析法

化學發光免疫分析法（Chemiluminescent immunoassay， CLIA）是將化學檢測體系內部的化學能轉換成光輻射作為信號來源，以待測物濃度與化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系作為定量檢測的依據[29]。相較于ELISA， CLIA 法具有靈敏度高和易于自動化等優點，但其信號持續時間易受反應體系影響，成本高且操作復雜。由于該技術發展比較成熟，雖然基于CLIA 方法檢測CYFRA21-1 的文獻報道較少，但市場上已有相應的商品化試劑盒，如雅培公司基于具有自主知識產權的免疫化學發光檢測系統配套開發了ARCHITECT CYFRA 21-1 Reagent Kit 試劑盒，可以實現血清中CYFRA21-1 的檢測。此外，方宜臻等[30]評估了國產CYFRA21-1 化學發光定量檢測試劑盒的性能，發現試劑盒的最低檢出限為0.1 ng/mL，線性范圍為0.1～1000.0 ng/mL，各項性能良好，可以滿足臨床檢測的需求。臨床用進口試劑盒質量穩定，自動化程度高，但價格較高且貨期較長；與其相比，國產試劑盒價格低、供貨迅速，但部分產品可能存在質量穩定性不佳的問題。

2.2.3 免疫熒光法

相比于化學發光，熒光法是利用外部的光源激發，使熒光物質躍遷進入激發態，在更短的時間內發出不同能級的光。當外部的激發光消失時，熒光消失。常見的免疫熒光法（Immunofluorescence， IF）利用高靈敏熒光材料作為信號探針，通過測量熒光強度實現抗原的準確定量分析。Alarfaj 等[31]合成了具有綠色熒光的碳量子點-氧化鋅納米復合材料（λex=470 nm， λem=520 nm），并成功建立了一種用于CYFRA21-1高靈敏檢測的熒光免疫分析方法，線性范圍為0.01～100 ng/mL，檢出限為0.008 ng/mL。單個生物標志物的檢測對癌癥的診斷存在局限性，多個標志物聯合診斷可以顯著提高肺癌診斷的準確率[32]。免疫熒光法可以選擇多種不同的熒光材料作為免疫探針，產生多種發射波長的熒光信號，從而實現多種靶標的同時監測。Ding 等[33]使用兩種不同發射波長的量子點納米珠作為標記探針，最大發射波長分別為530 nm（綠色）和585 nm（黃色），采用免疫磁珠將靶標分離，可同時檢測CEA 和CYFRA21-1。形成免疫復合物后，在相同激發光（340 nm）下測量綠色熒光和黃色熒光的強度（圖2）。該方法檢測CEA 和CYFRA21-1的檢出限分別為0.1 和0.2 ng/mL，可在復雜的血清基質中檢測CEA 和CYFRA21-1，定量分析結果與化學發光法試劑盒檢測結果的相關性顯著。

在傳統的免疫熒光分析方法中，血清樣本在短波長的激發光源下可能會出現較明顯的背景熒光，影響目標熒光信號的識別，從而導致假陰性和假陽性結果[34-35]。由于激發波長在近紅外區，基于上轉換熒光的免疫分析方法可以有效減少樣本的背景熒光，提高信噪比，從而提高檢測結果的準確性和可靠性。Hou 等[36]使用上轉換熒光納米材料作為信號標記材料，與抗體偶聯制備免疫檢測探針，結合原子轉移自由基聚合信號方法，建立了一種基于雙抗體夾心模式的上轉換熒光免疫分析方法，用于CYFRA21-1 的檢測，檢出限低至38.7 fg/mL。

2.2.4 側流免疫層析法

側流免疫層析法（Lateral-flow immunochromatographic assay， LFIA）是一種將抗原-抗體特異性識別反應、色譜層析技術和納米材料相結合的快速檢測方法，具有操作簡單、檢測迅速和成本低等優點，在醫學診斷和食品安全等領域廣泛應用[37]。膠體金是免疫層析方法中最常見且最成熟的信號標記材料，利用膠體金表面高電子密度的特性通過靜電作用吸附抗體或蛋白，制備特異性識別免疫探針。Xu 等[38]開發了一種基于膠體金的免疫層析方法，能夠在15 min 內半定量檢測淋巴結組織中的CYFRA21-1 濃度水平，可在手術期間檢測和識別甲狀腺癌淋巴結轉移。該方法的線性范圍為0.55～500 ng/mL，裸眼定性檢測的檢出限為5 ng/mL，借助膠體金信號讀取儀半定量檢測的檢出限低至0.55 ng/mL。

熒光免疫層析法結合了熒光免疫分析技術靈敏度高和免疫層析快速簡單的優點。使用傳統的熒光染料和水溶性量子點作為免疫層析信號探針存在光漂白、穩定性差或量子產率低等缺點[39]。Chen 等[39]利用疏水性量子點（QPs）窄發射、寬激發和高量子產率等優勢，制備了量子點摻雜聚苯乙烯熒光微球，并開發了相應的熒光免疫層析法。該方法利用熒光讀數儀獲得測試線和對照線的熒光峰高比值，實現了CYFRA21-1 和CEA 的同時定量檢測（圖3），在最佳條件下，定量檢測CYFRA21-1 的線性范圍和檢出限分別為1.3～480 ng/mL 和0.16 ng/mL，具有快速、靈敏和準確的優點。

2.2.5 電化學免疫分析方法

電化學免疫分析方法（Electrochemical immunoassay， EIA）具有靈敏度高、線性范圍寬、穩定性好、重復性好和檢測速度快等優點，結合先進的材料科學與微納技術，如石墨烯、金屬有機框架以及微流控芯片的應用，在生物標志物檢測中顯示出優異的性能[40-42]。用于CYFRA21-1 檢測的電化學免疫分析方法包括伏安法、安培法、阻抗法和電化學發光法。

伏安法利用在電極處發生的氧化還原反應引起電位變化，測量電壓與電流變化，根據電流大小與抗原濃度的線性關系，實現定量檢測[43]。Feng 等[44]在電極表面修飾金@銠的樹枝狀納米晶體，提高了電極表面積和電子轉移速率，同時采用負載鉑鈀合金的空心碳球作為標記材料進一步提高電子轉移效率，開發了一種基于差分脈沖伏安法超高靈敏度檢測CYFRA21-1 的方法（圖4A），檢測范圍為100 fg/mL～100 ng/mL，檢出限低至31.72 fg/mL。與伏安法相似，安培法通過測量恒定電壓下的電流變化來定量待測物的濃度。Cao 等[45]利用具有優異導電性和大比表面積的CoNi-RGO 作為電化學傳感器的基底，結合負載雙金屬硫化物NiCo2S4 的金屬有機框架材料（ZIF@NiCo2S4），開發了一種電化學安培電流-時間（i-t 曲線）法高靈敏檢測CYFRA21-1，由于ZIF@NiCo2S4 具有強大的氧化還原能力、優異的導電能力和良好的生物親和能力，加入少量的H2O2 即可產生明顯的電流信號。該方法可檢測濃度低至0.33 pg/mL 的CYFRA21-1，但其產生的電流持續時間和強度容易受到反應體系影響，使其應用受到一定限制。

阻抗法通過施加固定的交流電壓，利用目標分子與電極的識別原件發生特異性識別，引起阻抗變化，從而影響電流大小，基于此實現對分析物濃度的定量檢測[43]。相較于伏安法，阻抗法可以不依賴標記探針，簡化操作流程的同時降低成本，分析靈敏度高、響應準確、穩定性好且重現性高[46]。Suveen[47]等開發了一種基于低介電常數材料（納米氧化釔， nY2O3）的無標記電化學阻抗免疫傳感器，用于唾液中CYFRA21-1 的檢測（圖4B）。nY2O3 的高比表面積、快速離子轉移率及高效電荷轉移能力有效提高了傳感器的響應速度和靈敏度，用于檢測CYFRA21-1，在0.01 ng/mL～50 ng/mL 濃度范圍內呈良好的線性關系，靈敏度為226.0 Ω·mL/ng，檢出限低于0.01 ng/mL。

電化學發光是由電化學反應驅動的化學發光現象，相較于化學發光，其發光體基本不被消耗，發光信號強且穩定，持續時間較長，便于測定，并且不受外加光源干擾，可控性好。Guo 等[48]使用雙金屬有機骨架催化促進魯米諾發光，建立了一種基于“三明治夾心”模式的電化學發光傳感器（圖4C），可實現100 fg/mL～100 ng/mL 范圍內CYFRA21-1 的定量檢測，檢出限為85.2 fg/mL。基于電化學發光共振能量轉移的檢測方法原理如下：能量供體發出的光被能量受體吸收而發生猝滅，表現為電極表面的供體接受電子變成激發態發出相應波長的光，當存在抗原時，形成三明治夾心結構，能量受體接近供體，發生熒光猝滅。Yu 等[49]將鐵離子摻雜的花狀石墨氮化碳（Fe-CN-3）覆蓋在電極表面作為能量供體，以氧化亞銅納米立方體制備的信號探針作為能量受體（圖4D）構建了一種傳感器，用于CYFRA21-1 的定量檢測。一方面， Fe-CN-3 的電化學發光性能優于石墨氮化碳；另一方面， Cu2O 的紫外-可見吸收光譜與Fe-CN-3 的發射光譜匹配。此傳感器表現出良好的檢測性能，對CYFRA21-1 的檢出限低至17.4 fg/mL。新型納米材料的優異性能及其應用為電化學方法檢測性能的提升提供了更多可能。

2.2.6 其它免疫分析方法

傳統的免疫分析定量方法是依靠專業的儀器設備進行讀數，難以滿足即時檢測的需求。以葡萄糖含量作為檢測指標，利用家用血糖儀讀取葡萄糖含量，基于葡萄糖濃度與樣本中待測物濃度之間的線性關系，可以實現待測物的定量檢測。Lv 等[50]以帶正電的聚乙烯亞胺改性介孔二氧化硅納米顆粒（MSNPEI）為納米容器負載葡萄糖，采用標記有抗體的金納米顆粒（帶負電）封堵MSN-PEI 孔隙。當CYFRA21-1存在時，分子門被打開，釋放MSN-PEI 中的葡萄糖。利用家用血糖儀檢測葡萄糖濃度（圖5），基于此實現了CYFRA21-1 的快速便捷檢測，最低檢測濃度為0.79 ng/mL。該方法以便攜的家用血糖儀代替專業的設備，開發了CYFRA21-1 的快速檢測方法，為即時檢測技術創新提供了一種思路。

表面增強拉曼散射（Surface enhanced Raman scattering， SERS）是一種基于貴金屬納米粒子表面等離子體的振動光譜技術，將其用于免疫分析檢測中，具有高靈敏、高特異性和窄拉曼光譜帶等優點。Ge 等[51]建立了基于SERS 的雙抗夾心免疫檢測方法，檢測血清中CYFRA21-1 的線性范圍為1 pg/mL～10 ng/mL，檢出限為894.3 pg/mL。

光纖免疫傳感器（Fiber optic immunosensor）是一種具有體積小、價格低、檢測速度快、靈敏度高、抗磁干擾強以及特異性好等優點的免疫傳感器，工作原理是依據傳感器表面因發生免疫反應而引起的折射率變化實現待測物質的定量檢測，其檢測靈敏度受折射率變化靈敏度的影響。Qiu 等[52]提出了一種基于高次諧波游標效應（HVE）和級聯雙法布里-佩羅干涉儀（FPI）的免疫方法，用于CYFRA21-1 的檢測。該方法利用HVE 提高了檢測折射率變化的靈敏度。折射率變化會導致光線波長的偏移，波長偏移量與CYFRA21-1 濃度具有對應關系，利用FPI 檢測波長偏移，即可實現對蛋白的定量分析。該方法檢測CYFRA21-1 的線性范圍為10 fg/mL～100 pg/mL，檢出限為1.6 fg/mL。

綜上所述，檢測方法的發展與應用為CYFRA21-1 的檢測提供了技術支撐。表1 總結了不同檢測方法的檢測性能。

3 總結與展望

質譜法檢測CYFRA21-1 具有較高的準確度和靈敏度，基于免疫反應原理的CYFRA21-1 檢測方法包括酶聯免疫吸附分析法、免疫熒光法、熒光免疫層析法、電化學免疫分析法和化學發光免疫分析法等，這些檢測方法具有各自的特點，為CYFRA21-1 的準確檢測提供了技術支撐。未來，可以從以下5 個方面對CYFRA21-1 檢測方法進行深入研究：（1）許多方法的檢出限已經遠低于人體中被檢測物的含量水平，提高檢測方法的穩定性和檢測結果的準確性是相關研究的關鍵；（2）簡化操作步驟和降低對專業設備的依賴性，提高檢測方法的普適性；（3）結合人工智能技術和大數據分析，建立實時監測和預警系統，提高疾病篩查的及時響應性和準確性；（4）CYFRA21-1 的單一檢測對疾病診斷的特異性有限，因此，同時檢測其它標志物，可以有效提高疾病早期診斷的正確率；（5）目前，國際上缺乏CYFRA21-1 的標準物質，導致多種檢測方法的結果難以進行直接比較，因此，研制相關的標準物質可以為CYFRA21-1 檢測結果的量值溯源和互認提供計量支撐。

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國家重點研發計劃項目（No. 2022YFF0608402）資助。