基于超聲可連續(xù)進(jìn)樣的完整單細(xì)胞代謝組學(xué)質(zhì)譜分析平臺(tái)的構(gòu)建

摘要 單細(xì)胞代謝物分析能夠在小分子水平上揭示細(xì)胞間異質(zhì)性及其分子多樣性，尤其是活單細(xì)胞代謝物分析能夠展示保真度更高的生化信息。本研究建立了基于超聲可連續(xù)進(jìn)樣的完整單細(xì)胞代謝組學(xué)質(zhì)譜分析平臺(tái)，旨在提升單細(xì)胞利用率和質(zhì)譜檢測(cè)效率。此平臺(tái)基于微型化超聲模塊產(chǎn)生的機(jī)械運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)達(dá)60 min 的細(xì)胞懸浮和分散，并且對(duì)細(xì)胞的完整性和活性影響較小，細(xì)胞存活率高于70%。通過(guò)比較靜置組和超聲組的細(xì)胞懸浮液密度和質(zhì)譜檢出的單細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)超聲處理顯著降低了細(xì)胞沉降速度，提高了單細(xì)胞質(zhì)譜檢出單細(xì)胞的數(shù)量。將此分析平臺(tái)用于小鼠小腦星形膠質(zhì)細(xì)胞（C8D1A）和小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞（GL261）的單細(xì)胞分析，實(shí)現(xiàn)了不同種類細(xì)胞的聚類及差異化分析，顯示了本方法在細(xì)胞異質(zhì)性分析以及細(xì)胞識(shí)別中的應(yīng)用潛力，為單細(xì)胞分析提供了新思路及解決方案。

關(guān)鍵詞 單細(xì)胞；質(zhì)譜分析；超聲；窄內(nèi)徑毛細(xì)管；代謝物分析

細(xì)胞是生物體最基本的結(jié)構(gòu)及功能單元，傳統(tǒng)的研究方案依據(jù)細(xì)胞來(lái)源和形態(tài)等特征進(jìn)行研究，并且多在群體細(xì)胞水平上進(jìn)行[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞分裂增殖變化，細(xì)胞呈現(xiàn)出分子或基因方面的改變，從而產(chǎn)生異質(zhì)性[3]。單細(xì)胞代謝物分析可以在微觀小分子水平上揭示細(xì)胞異質(zhì)性，尤其是活單細(xì)胞代謝物分析能夠展示保真度更高的信號(hào)傳遞、相互作用和增殖分化等生化信息[4-7]，是近年來(lái)備受研究者矚目的研究方向。單細(xì)胞代謝物分析對(duì)于深入了解生物體內(nèi)代謝過(guò)程和相關(guān)疾病機(jī)制具有重要意義。

質(zhì)譜（MS）具有檢測(cè)速度快、分辨率高以及準(zhǔn)確定性鑒定的優(yōu)勢(shì)，已成為單細(xì)胞代謝物分析的主要研究方法[8-10]。目前用于單細(xì)胞代謝物檢測(cè)的質(zhì)譜方法有二次離子質(zhì)譜（SIMS）[11-12]、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）[13-14]和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）[15-17]，其中， ESI-MS 是活單細(xì)胞代謝物分析的主要方法之一。ESI-MS 幾乎不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，并在大氣壓環(huán)境下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞取樣和離子化，可以實(shí)現(xiàn)原位的單細(xì)胞代謝物分析。目前，研究者發(fā)展了多種基于ESI-MS 的單細(xì)胞分析方法，多方面提升了單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法的代謝物檢測(cè)性能，例如脈沖直流電噴霧質(zhì)譜法[18]、單探針質(zhì)譜法[9]、無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)法[19-20]、電發(fā)射電離質(zhì)譜法[21]以及有機(jī)質(zhì)譜流式方法[22]等。其中，電發(fā)射電離質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)了完整的活單細(xì)胞代謝物分析，避免了由于基質(zhì)干擾和樣品稀釋等導(dǎo)致的檢測(cè)靈敏度不足的問(wèn)題。

在低流速、小尺度條件下，流體的雷諾數(shù)極小，很難形成湍流，流體間的混合非常緩慢，而聲流場(chǎng)為流體混合提供了一種簡(jiǎn)單有效的方法。聲流場(chǎng)能夠誘導(dǎo)流體介質(zhì)中的顆粒進(jìn)行高效混合，使顆粒在流體中均勻分布。通過(guò)優(yōu)化聲流場(chǎng)的參數(shù)（如頻率、強(qiáng)度和作用時(shí)間等）可以進(jìn)一步提高混合效率，縮短混合時(shí)間[23-24]，應(yīng)用于材料科學(xué)納米顆粒的制備中可以防止顆粒團(tuán)塊化，促進(jìn)材料均勻分散[25-26]。

本研究構(gòu)建了一種基于超聲的可連續(xù)進(jìn)樣單細(xì)胞質(zhì)譜分析平臺(tái)，采用壓電陶瓷片構(gòu)建超聲模塊與離心管連接，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單且易于操作的無(wú)損超聲處理。利用超聲波振動(dòng)進(jìn)樣瓶中樣品有效延緩了細(xì)胞沉降速度，同時(shí)能夠保持細(xì)胞的完整性和活性。本方法有助于提高單細(xì)胞樣品的利用率和單細(xì)胞質(zhì)譜檢測(cè)通量，為現(xiàn)有單細(xì)胞質(zhì)譜進(jìn)樣方式提供了一種高效策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Orbitrap Eclipse Tribrid 質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；ECLIPSE Ti 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；TDGC-15K 調(diào)壓器（華通機(jī)電公司）；BSA323S-CW 分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Spectra MaxM5 酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；1300 SERISE A2 生物安全柜和311 CO2 培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisher 公司）；TDZ5-WS 低速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

甲醇、甲酸、氨和pierceTM水（LC-MS 級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；氫氧酸（HF，天津福晨化學(xué)試劑廠）；細(xì)胞膜綠色熒光探針（DiO，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK-8（北仁化學(xué)科技有限公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液（PBS）以及L-谷氨酰胺等細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)于Gibco 公司；高純氮?dú)猓?9.9%，北京奧康雙泉能源技術(shù)有限公司）。

1.2 質(zhì)譜條件

納升電噴霧（nanoESI）離子源；正掃描模式；離子傳輸管溫度350 ℃；離子源電壓3 kV；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1000；分辨率30000，最大注入時(shí)間500 ms，AGC（自動(dòng)增益控制）值為1 × 105。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞C8D1A 購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。A549 細(xì)胞和GL261 細(xì)胞使用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，C8D1A 細(xì)胞使用低碳酸氫鈉的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞解凍后，使用含有200 μg/mL L-谷氨酰胺、10%（V/V）胎牛血清和100 U/mL 青霉素/鏈霉素的RPMI 1640 和DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋度達(dá)到80%～90%后，采用PBS 緩沖液清洗，再用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集傳代2～3 代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞染色

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞，去除殘留培養(yǎng)基后用PBS 洗滌3 次，加入10 μmol/L DIO 染液，在37 ℃下孵育15 min，1000 r/min 離心5 min，移去細(xì)胞染液后，用PBS 洗滌3 次，收集的細(xì)胞用PBS 重懸后，采用熒光顯微鏡進(jìn)行成像分析。

1.5 細(xì)胞活性的檢測(cè)

將A549 細(xì)胞收集后進(jìn)行超聲處理，分別收集超聲處理0、15、30、45 和60 min 的細(xì)胞，以6000 個(gè)細(xì)胞/孔接種到96 孔培養(yǎng)板上，在37 ℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中孵育6 h，各孔加入含有10 μL CCK8 的培養(yǎng)基后繼續(xù)孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度。

1.6 窄等內(nèi)徑毛細(xì)胞噴針的制備

采用本研究組建立的重力輔助濕法刻蝕方法[21，27]制備窄等內(nèi)徑毛細(xì)管噴針。截取一根內(nèi)徑為25 μm、外徑為360 μm、總長(zhǎng)為40 cm的裸熔融石英毛細(xì)管（永年銳灃色譜器件有限公司），去除一端的聚酰亞胺涂層后，將毛細(xì)管浸入40% HF中靜置50 min。刻蝕完成后去除尖端部分的涂層，氮?dú)獯蹈桑瑐溆谩?/p>

1.7 單細(xì)胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

以細(xì)胞膜主要成分磷脂酰膽堿（PC 34∶1， m/z 760.58）為單細(xì)胞質(zhì)譜圖篩選標(biāo)準(zhǔn)，利用Python 及R 語(yǔ)言提取扣除背景后信噪比大于5、并且在所有細(xì)胞中出現(xiàn)的頻率大于20%的單細(xì)胞相關(guān)離子，并進(jìn)行t-SNE 聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于超聲可連續(xù)進(jìn)樣-窄等內(nèi)徑發(fā)射器的單細(xì)胞質(zhì)譜分析平臺(tái)的構(gòu)建

基于超聲可連續(xù)進(jìn)樣-窄等內(nèi)徑發(fā)射器的單細(xì)胞質(zhì)譜分析平臺(tái)如圖1 所示，包括超聲模塊、進(jìn)樣模塊和可視化調(diào)整模塊。超聲模塊由深圳大學(xué)許太林研究組自制的電子設(shè)備構(gòu)成[28]，主要部件有圓形壓電陶瓷片、功率調(diào)節(jié)電路板以及電源開關(guān)。工作原理為驅(qū)動(dòng)裝置輸出的信號(hào)經(jīng)壓電陶瓷片轉(zhuǎn)化為正弦波，疊加在裝有細(xì)胞的離心管上形成聲波場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)離心管內(nèi)細(xì)胞懸液的聲波振動(dòng)。進(jìn)樣模塊首先將窄等內(nèi)徑毛細(xì)管噴針的樣品端插入進(jìn)樣艙內(nèi)的離心管底部，然后利用高純氮?dú)鈿鈮候?qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入毛細(xì)管中；此外，將高導(dǎo)電銅線一端插入離心管底部，另一端與質(zhì)譜儀高壓正極相連，形成一條導(dǎo)電路徑，允許毛細(xì)管尖端在高壓下放電。可視化調(diào)整模塊借助電子顯微鏡實(shí)時(shí)觀察并調(diào)節(jié)窄等內(nèi)徑毛細(xì)管發(fā)射器出口端與質(zhì)譜儀進(jìn)樣口之間的相對(duì)位置并使之對(duì)齊，確保在放電發(fā)射過(guò)程中樣品能夠成功進(jìn)入質(zhì)譜儀。

2.2 超聲處理對(duì)細(xì)胞的影響

超聲是一種波長(zhǎng)極短的機(jī)械波，可能會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，因此采用CCK8 法對(duì)超聲后的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。考察不同超聲時(shí)間（15、30、45 和60 min）處理后的A549 細(xì)胞的活性，結(jié)果如圖2 所示。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率逐漸降低，表明長(zhǎng)時(shí)間暴露在超聲波中會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。盡管存活率有所下降，但經(jīng)過(guò)60 min 超聲處理后，細(xì)胞存活率仍保持在70%以上，滿足檢測(cè)需求。此外，采用顯微成像對(duì)超聲處理前后的細(xì)胞完整性進(jìn)行表征，圖3 為不同處理?xiàng)l件下A549 細(xì)胞經(jīng)DIO 染色后的成像圖，與培養(yǎng)基中的細(xì)胞相比，大部分經(jīng)甲酸銨溶液浸泡及超聲處理40 min 的細(xì)胞仍保持完整的細(xì)胞形態(tài)，表明超聲處理對(duì)細(xì)胞的影響較小。

通過(guò)觀察經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng)超聲處理的細(xì)胞懸液的密度以表征超聲延緩細(xì)胞沉降的作用。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549 細(xì)胞配制成4.5×105 cells/mL 的單細(xì)胞懸液，每100 μL 細(xì)胞懸液作為一個(gè)樣本加入到0.2 mL 離心管中，靜置組和超聲組各5 個(gè)樣本，分別在超聲處理0、10、20、40 和60 min 后取5 μL 上層液體進(jìn)行成像觀察。如圖4 所示，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組樣本中細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，然而相對(duì)于靜置組，超聲組在60 min 后的上層液體仍有部分細(xì)胞均勻地懸浮和分散，表明超聲具有延緩細(xì)胞沉降的作用。這是由于超聲波的振動(dòng)效應(yīng)，產(chǎn)生局部劇烈擾動(dòng)并增加液體混合程度，這種擾動(dòng)和混合效應(yīng)有助于保持或恢復(fù)細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。

2.3 單細(xì)胞質(zhì)譜檢測(cè)

采用構(gòu)建的超聲可連續(xù)進(jìn)樣-窄等內(nèi)徑噴針單細(xì)胞質(zhì)譜分析平臺(tái)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。首先考察了質(zhì)譜檢測(cè)前流經(jīng)窄內(nèi)徑毛細(xì)管噴針的細(xì)胞數(shù)量。圖5A 為離線檢測(cè)細(xì)胞收集方式，在窄等內(nèi)徑毛細(xì)管噴針出口處以離心管收集流經(jīng)通道的細(xì)胞，并統(tǒng)計(jì)收集到的細(xì)胞數(shù)量；圖5B為初始密度為4.5×105 cells/mL 的細(xì)胞在氮?dú)怛?qū)動(dòng)下注入窄等內(nèi)徑毛細(xì)管，流經(jīng)噴針后收集30 min 所得細(xì)胞量的統(tǒng)計(jì)情況。結(jié)果顯示，超聲組收集到的細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于靜置組，表明超聲處理能夠有效提高細(xì)胞進(jìn)入毛細(xì)管的效率，提高了細(xì)胞的利用率。

對(duì)超聲處理前后的細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)譜分析，評(píng)估了質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)胞的通量。選用內(nèi)徑為25 μm 的毛細(xì)管噴針對(duì)不同密度的A549 細(xì)胞懸浮液（1×104、5×104、1×105、5×105 和1×106 cells/mL）進(jìn)行檢測(cè)。圖6 為以特征脂質(zhì)信號(hào)磷脂酰膽堿（m/z 760.58）提取的單細(xì)胞離子流圖，從圖中可知，超聲組呈現(xiàn)更均勻的單細(xì)胞質(zhì)譜峰分布。在連續(xù)20 min 進(jìn)樣過(guò)程中，超聲組始終可以檢測(cè)到細(xì)胞信號(hào)；靜置組存在大量未檢測(cè)到細(xì)胞的空白區(qū)。這可能是細(xì)胞沉降導(dǎo)致其未能進(jìn)入毛細(xì)管中，因而未被質(zhì)譜檢測(cè)到。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了超聲對(duì)于延緩細(xì)胞沉降速度的效果，并成功提高了質(zhì)譜分析中的單細(xì)胞利用率和檢測(cè)通量。

2.4 C8D1A 和GL261 細(xì)胞分類分析

將構(gòu)建的超聲可連續(xù)進(jìn)樣-窄等內(nèi)徑噴針單細(xì)胞質(zhì)譜分析平臺(tái)用于不同類型的膠質(zhì)細(xì)胞分析（C8D1A 和GL261 分別為小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞）。采用本研究組開發(fā)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，以細(xì)胞膜主要成分磷脂酰膽堿（m/z 760.58）作為細(xì)胞信號(hào)篩選標(biāo)準(zhǔn)，提取扣除背景后信噪比大于5 且在所有細(xì)胞中出現(xiàn)頻率大于20% 的單細(xì)胞相關(guān)離子進(jìn)行分析，在C8D1A 和GL261 樣品中分別檢測(cè)到了1194 和1210 個(gè)單細(xì)胞。圖7A 為可視化的統(tǒng)一流形逼近與投影（UMAP）聚類分析圖，圖中的1 個(gè)點(diǎn)代表1 個(gè)細(xì)胞，不同種類細(xì)胞由不同顏色表示。此圖展示了C8D1A 和GL261 單細(xì)胞代謝輪廓差異，可以明顯觀察到不同種類的細(xì)胞匯聚成不同團(tuán)簇，表現(xiàn)出細(xì)胞差異及單細(xì)胞異質(zhì)性的特點(diǎn)。圖7B 和圖7C 的小提琴圖展示了兩類細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞被檢測(cè)到的總強(qiáng)度分布和每個(gè)細(xì)胞被檢測(cè)到的代謝物相關(guān)離子數(shù)，C8D1A 和GL261 的平均強(qiáng)度分別為1.9×108 和1.5×108，相關(guān)離子數(shù)為190 個(gè)。綜上，本分析平臺(tái)成功檢測(cè)到了待測(cè)細(xì)胞的多種代謝物，并實(shí)現(xiàn)了不同類型細(xì)胞的分類分型分析。

3 結(jié)論

本研究將基于壓電陶瓷建立的微型化超聲模塊用于樣品中單細(xì)胞的分散與懸浮，超聲模塊產(chǎn)生的機(jī)械運(yùn)動(dòng)對(duì)單細(xì)胞的完整性及活性的影響均較小，在超聲60 min 后，細(xì)胞存活率高于70%。基于此構(gòu)建了超聲可連續(xù)進(jìn)樣-窄等內(nèi)徑噴針的單細(xì)胞質(zhì)譜分析平臺(tái)，顯著改善了細(xì)胞沉降導(dǎo)致的單細(xì)胞檢測(cè)通量低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了同源的星形膠質(zhì)細(xì)胞（C8D1A 和GL261）的分類分析，展現(xiàn)出其在細(xì)胞異質(zhì)性分析中的潛力。本平臺(tái)為單細(xì)胞分析提供了新的思路和方案，有望用于不同種類細(xì)胞、細(xì)胞不同亞型和分型不明確的復(fù)雜細(xì)胞體系的分類及差異化分析，以及細(xì)胞量較少且不能實(shí)現(xiàn)增殖的珍貴臨床或組織分離樣品的代謝分析，為探究疾病及生物體的發(fā)展提供了新的分析手段。

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos. 22127805， 22206008）資助。