以魯米諾/過氧化氫作為報告體系的微通道電化學發光傳感器用于四環素的檢測

摘要 采用魯米諾/H2O2 作為微通道電化學發光（ECL）報告體系，構建了一種微通道ECL 傳感器用于四環素（TC）的檢測。魯米諾/H2O2 ECL 體系較低的激發電位可以降低體系鉗位電壓的影響，從而提高微通道ECL 傳感器的檢測性能。修飾了四環素適配體（TC-aptamer）的微通道可特異性識別并捕獲TC， TC 帶有的正電荷導致微通道內界面負電荷密度降低，使微通道的離子電流增加，導致體系ECL 信號增強。對電解質濃度、TC-aptamer 修飾液濃度、TC 與TC-aptamer 的反應時間等條件進行了優化。在最優條件下，體系ECL信號變化值與TC 濃度在1.00～200 ng/mL 范圍內呈良好的線性關系，檢出限為0.69 ng/mL。此傳感器具有良好的選擇性，并成功用于牛奶樣本中TC 的檢測。

關鍵詞 電化學發光；魯米諾；微通道；四環素；適配體

微通道電化學傳感技術具有操作簡便、靈敏度高以及無需標記等特點，近年來受到廣泛關注。Zhang 等[1]采用三磷酸腺苷（ATP）調控修飾了ATP 適配體的聚咪唑陽離子功能化微米管的正電荷密度，使離子電流發生變化，實現了ATP 的高靈敏檢測。Chen 研究組[2]構建了一種基于聚（乙二醇）二丙烯酸酯水凝膠填充的微孔傳感平臺，利用目標物調控微孔的電荷密度，改變離子電流，實現了對不同目標物的分析傳感。Zhang 等[3]利用pH 值調控聚咪唑刷修飾的微米管的正電荷密度，使微米管離子電流發生變化，從而實現了pH 值的測定。這些研究表明，可以通過改變微通道的孔徑、電荷密度等因素調控通過微通道的離子電流[1，4-5]。電化學發光（Electrochemluminescence， ECL）傳感技術具有靈敏度高、使用范圍廣和成本低等特點[6-8]。在本研究組前期的工作中，將ECL 檢測技術與微通道結合，通過調控微米管內的電荷密度實現回路中離子電流強度的調控，構建了一種基于微通道的ECL 傳感技術。該體系可以實現離子電流對ECL 信號的直接調控[9]；并且將ECL 傳感界面與目標物反應界面分離，降低了目標物識別反應對ECL 傳感界面的干擾，提高了傳感技術應用的簡便性和抗干擾能力[10-12]。但是，由于微通道ECL 傳感界面存在鉗位電壓（約0.8 V（vs Ag/AgCl）），而采用的Ru（phen）32+/TPrA ECL 發光體系的激發電位（約1.1 V（vs Ag/AgCl））偏高[9]，導致ECL 報告體系不是在其最佳電位下激發，降低了ECL 體系的發光效率和傳感器的靈敏度。因此，需要采用激發電位低于鉗位電壓的ECL 發光體系，以降低鉗位電壓對微通道ECL 檢測性能的影響[10-12]。魯米諾/H2O2 是一種常見的ECL 發光體系，其最佳激發電位約為0.50 V（vs Ag/AgCl）[13]，低于微通道的鉗位電壓。因此，可選擇魯米諾/H2O2 作為微通道ECL 的報告體系，降低鉗位電壓的影響，提高微通道ECL的檢測性能。

四環素（Tetracycline， TC）是疾病感染治療和動物養殖中常用的抗生素。我國國標規定牛奶等食品中TC 的殘留量不得超過100 ng/mL[14]。但是，由于TC 的濫用，日常生活中的動物衍生食品和水源會存在TC 殘留，對人體健康和自然環境產生危害。因此，靈敏且準確地檢測TC 對于保護人體健康和環境安全至關重要[14-16]。目前，已開發了多種方法用于TC 的檢測，包括液相色譜-質譜法（LC-MS）[17]、高效液相色譜法（HPLC）[18]、薄層色譜法（TLC）[19]、毛細管電泳法（CE）[20]和酶聯免疫吸附分析法（ELISA）[21]等，這些方法具有較高的靈敏度和準確性，但也存在不足之處，如需要昂貴的實驗儀器、樣品前處理過程復雜等。因此，設計一種低成本、簡單、靈敏且高選擇性的傳感方法對TC 的測定具有重要意義[22-24]。

本研究以魯米諾/H2O2 為ECL 發光體系，構建了一種基于微通道的ECL 傳感體系用于TC 的檢測。在微通道內壁修飾TC 的適配體（TC-aptamer）， pH=8 時， TC 帶正電荷（pKa=9.1）[25]，適配體與TC 結合，帶正電荷的TC 會降低微通道內壁的負電荷密度，使得微通道內從尖端到底部的電滲流（EOF）降低，尖端離子濃度富集，微通道的電流增大，體系ECL 信號增大。魯米諾/H2O2 的ECL 激發電位較低[26]，可以降低鉗位電壓的影響，提高傳感器的檢測性能。基于上述策略，本傳感器實現了對TC 的靈敏定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P-2000 CO2 激光拉制儀和B150-86-10 石英玻璃毛細管（美國Sutter 公司）；MF-900 光學顯微鏡（日本Narishige 公司）；CHI660D 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；BPCL 超微弱發光分析儀（廣州微光科技有限公司）。

磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.2）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、HCl、濃H2SO4（98%）、MgCl2·6H2O 和KCl 購自上海麥克林生化科技有限公司；TC、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、卡那霉素（KAN）、谷胱甘肽（GSH）、魯米諾（Luminol）和H2O2（30%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。TC-aptamer（堿基序列為5′-OHC-GTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCT-3′[23]）由上海生工生物工程股份有限公司合成并純化。其它試劑至少為分析純試劑；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 微通道的制備

將配備好的食人魚溶液（98% H2SO4/30% H2O2， 7∶3， V/V）倒入玻璃器皿中，將石英玻璃管完全浸泡在食人魚溶液中5 h，再用大量超純水清洗，得到潔凈的石英玻璃管。利用P-2000 CO2 激光拉制儀制備孔徑為3 μm 的錐形微通道。拉制完成后，使用光學顯微鏡檢查微通道孔徑，確保孔徑的大小一致。

1.3 TC-apatmer 的活化及微通道傳感界面的構建

1.3.1 TC-apatmer 的活化

將TC-aptamer 粉末加入離心管中，以4000 r/min 離心3 min，加入PBS 緩沖溶液溶解得到1 μmol/L 的TC-aptamer 溶液，在95 ℃下活化5 min 后，自然降溫，備用。

1.3.2 傳感界面的構建

在微通道中注入10% APTES，常溫下反應3 h 后，用乙醇潤洗微通道3 次，再用PBS 潤洗3 次。在微通道內注入1 μmol/L TC-aptamer 溶液反應8 h 后，用PBS 潤洗3 次，得到TC-aptamer 功能化的微通道。將不同濃度的TC 溶液注入TC-aptamer 功能化的微通道中，反應60 min 后，清洗，即可用于電化學檢測。

1.4 電化學測試

采用循環伏安（CV）技術對微通道進行I-V 曲線測試，對電極和參比電極均為自制的Ag/AgCl 電極，另一根Ag/AgCl 電極插入微通道中作為工作電極。通過觀察I-V 曲線變化，判斷微通道內功能基團的修飾情況。掃描速度為0.05 V/s，電位區間為?1.0～+1.0 V。采用三電極系統構建基于微通道的ECL 檢測系統。在三電極系統中，玻碳電極（GCE）為工作電極，鉑絲（Pt）插入微通道中作為對電極，參比電極為Ag/AgCl 電極。將三電極置于5 mL 含100 mmol/L KCl 的10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）中，加入2.5 μL 0.1%的H2O2 和2.5 μL 0.70 mg/mL 魯米諾試劑。使用方波伏安法（SWV）測量體系的ECL 信號。ECL 檢測參數：掃描速度為0.05 V/s，電位區間為0～0.8 V，光電倍增管電壓為?950 V。

1.5 實際樣品處理

牛奶購于本地超市，用甲醇-乙腈混合液（1∶1， V/V）進行預處理。將樣品和混合溶液加入離心管中進行充分混合后， 10000 r/min 下離心5 min，收集上清液，過0.22 μm 濾膜以去除顆粒[27]。取3 份處理后的牛奶樣品各500 μL，分別加入5 μL 濃度為5.00、10.0 和15.0 mg/mL 的TC 標準溶液，使牛奶樣品中最終的TC 含量分別為50.0、100 和150 ng/mL。將加標后的牛奶樣品注入TC-aptamer 功能化的微通道中反應60 min 后，清洗微通道用于檢測。檢測步驟與1.4 節中電化學測試的步驟相同。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

圖1A 為所構建的基于微通道的ECL 傳感器用于檢測TC 的原理示意圖。在TC-aptamer 功能化的微通道內， TC-aptamer 上有帶大量負電荷的磷酸骨架，因此TC-aptamer 功能化微通道的內表面帶負電荷。負電荷會吸引溶液中的陽離子形成雙電層，在外電場下形成從尖端到底部的EOF，使得尖端處的離子虧空[9，12]，導致通過微通道的離子電流較小， ECL 信號低。TC-aptamer 可特異性識別并捕獲TC（圖1B），當存在帶正電荷的目標物TC 時， TC 與TC-aptamer 結合，微通道內表面負電荷密度降低， EOF 降低，離子在尖端積累，使得離子電流增大， ECL 信號增大（圖1C）。微通道內表面的負電荷密度隨著TC 濃度增大而降低。微通道尖端處的離子濃度越高，離子電流越大， ECL 信號也越強。基于此原理，構建了基于TC-aptamer 功能化的微通道ECL 傳感器，用于TC 的檢測。

2.2 可行性分析

利用功能化微通道中離子傳輸的特性表征功能基團在微通道內表面的修飾過程。如圖2A 所示，在裸露的微通道可觀察到線性I-V 曲線（曲線a），而氨基修飾的微通道的I-V 曲線偏離歐姆行為，并且整流比（RR，定義為?1 V 與+1 V 時對應的電流絕對值的比值）非常小（RR=0.02）。這是由于氨基帶有正電荷，導致微通道內表面帶正電荷（曲線b）。利用氨基修飾的微通道與5′端修飾醛基的TC-aptamer 反應可得到TC-aptamer 修飾的微通道。在TC-aptamer 修飾的微通道中同樣觀察到非線性的I-V 曲線，但其具有較高的RR 值。這是因為TC-aptamer 包含帶負電荷的磷酸骨架，使得微通道內表面的荷電狀態由正電荷轉變為負電荷（曲線c）。將TC-aptamer 修飾的微通道浸入TC 溶液中，對應的RR 值降低（曲線d），這表明帶正電荷的TC 被TC-aptamer 修飾的微通道選擇性捕獲，導致微通道內表面電荷密度下降。功能基團修飾后微通道離子電流的變化說明這些帶電的功能基團被依次修飾在微通道的內表面。

為了進一步證明目標物TC 可以調控微通道內表面電荷密度的變化，采用功能化基團修飾的二氧化硅微球（SMs）進行Zeta 電勢（Zeta potential）測量（圖2B）。由于SMs 本身帶有的—OH 官能團會電離，因而電勢為負值。由于氨基質子化后帶有正電荷，氨基修飾的SMs（SMs/NH2）的Zeta 電勢為正值。修飾TC-aptamer 的SMs（SMs/TC-aptamer）電勢變為負值且高于SMs 本身的電勢，表明TC-aptamer 成功修飾到SMs 上，導致SMs 由正電性變為負電性。加入TC 孵育后， SMs/TC-aptamer/TC 的電勢仍為負值，但數值變小。這是因為TC 帶有正電，被SMs 上的TC-aptamer 捕獲后， SMs 的負電性減弱。上述實驗結果進一步證明在功能基團修飾過程中電荷密度會發生變化，并且可利用目標物TC 調控微通道內表面的電荷密度。

為了探究以魯米諾/H2O2 為報告體系的TC-aptamer 功能化微通道的ECL 特性，對TC 濃度和ECL 強度之間的關系進行了考察。由圖2C 可見，魯米諾/H2O2 體系的氧化峰電位為0.46 V（vs Ag/AgCl），低于微通道的鉗位電壓（0.8 V（vs Ag/AgCl））[7]。這說明在魯米諾/H2O2 的ECL 體系中，魯米諾可以在其最佳電位下激發， ECL 信號不受鉗位電壓的限制，不會影響傳感器的檢測性能。如圖2D 所示，當適配體功能化的微通道未與TC 反應時，體系ECL 信號較小；當微通道中加入100 ng/mL TC 反應后， ECL 信號強度明顯增大。TC 濃度變化可以引發ECL 信號的變化，說明所構建的傳感器可用于TC 的定量檢測。

2.3 實驗條件的優化

對微通道ECL 傳感器檢測時的實驗條件進行了優化。KCl 濃度會影響魯米諾/H2O2 發光系統的發光效率。當KCl 濃度較低時，隨著KCl 濃度增大，溶液的離子強度增大，將加速魯米諾和H2O2 在電極表面的電子轉移過程，促進激發態魯米諾的生成，使得ECL 信號增強。隨著KCl 濃度升高， Cl?與活性氧物種反應生成非發光副產物，從而使ECL 信號降低[28-29]。此外，隨著KCl 濃度增大， EOF 降低。如圖3A 所示，隨KCl 濃度增大， ECL 信號強度呈現先增大后減小的趨勢，并在100 mmol/L 時達到最大值。因此，選擇100 mmol/L 作為電解質KCl 的最佳濃度。

TC-aptamer 磷酸骨架帶有大量負電荷，決定了微通道內表面的電荷密度，并且影響離子電流和ECL信號。如圖3B 所示，隨著適配體濃度增大， ECL 信號呈現先逐漸減小后保持穩定的趨勢，這是因為當修飾的TC-aptamer 濃度比較低時，修飾到微通道內表面的TC-aptamer 數量較少，微通道內表面電荷密度較低， EOF 較小，離子在尖端積累，離子電流大， ECL 信號高；隨著修飾的TC-aptamer 濃度增大，修飾到微通道內表面的TC-aptamer 數量增多，微通道內表面電荷密度增大， EOF 增強，微通道尖端的離子耗盡，離子電流變小， ECL 信號降低。當TC-aptamer 濃度達到1 μmol/L 時， ECL 信號降到最小值，之后保持不變。因此，選擇TC-aptamer 的最佳濃度為1 μmol/L。

TC 帶正電荷，與TC-aptamer 特異性結合后會降低微通道內表面的負電荷密度，從而對離子電流和ECL 信號強度產生影響。在一定時間范圍內，反應時間越長， TC 和TC-aptamer 的反應越完全，微通道內表面的負電荷密度越低， ECL 信號越強。如圖3C 所示，隨著反應時間延長，體系的ECL 信號強度逐漸增大，在60 min 時達到最大值，隨后趨于穩定。因此， TC 與TC-aptamer 的最佳反應時間為60 min。

2.4 傳感器的分析性能

在TC-aptamer 修飾的微通道中注入不同濃度的TC 進行反應，考察TC 濃度與體系ECL 信號變化值（ΔECL， ECL 信號與背景信號的差值）的關系。與不同濃度TC 作用后的體系的ECL 響應曲線如圖4A 所示，隨TC 濃度增加，體系ECL 信號逐漸增大，在1.00～200 ng/mL 濃度范圍內，ΔECL 與TC 濃度呈良好的線性關系（圖4B），線性方程為ΔECL=82.9CTC+215.2（R2=0.9983），檢出限為0.69 ng/mL（S/N=3），可滿足牛奶等食品中TC 殘留量的檢測要求。與文獻報道的TC 檢測方法的性能相比（見表1），本傳感器的檢出限較低；同時，本傳感器使用微通道作為傳感界面，可以實現報告界面與傳感界面的分離，減少干擾。

選取4 種常見共存物（GSH、KAN、CTC 和OTC）作為干擾物，考察所構建的微通道傳感器的選擇性，體系中干擾物質的濃度是TC 濃度的10 倍。由圖5A 可知，干擾物質引起的ΔECL 值較小；當TC 存在時，ΔECL 較大，干擾物質引起的ΔECL 值與之相比可以忽略。由此可見，所構建的微通道ECL 傳感器具備良好的選擇性。此外，重現性也是傳感器的另一個重要指標。分別采用50、100 和200 ng/mL 的TC溶液與TC-aptamer 修飾的微通道進行反應，每個濃度均進行3 次平行檢測，結果見圖5B，各濃度下ΔECL值的相對標準偏差（RSD）分別為5.90%、4.81%和3.09%，說明本傳感器具有良好的重現性。

2.5 實際樣品分析

采用本方法對實際牛奶樣品中TC 的含量進行檢測，結果見表2，加標回收率為95.6%～105%，相對標準偏差（RSD）lt;6.45%。上述結果表明， TC-aptamer 功能化的微通道ECL 傳感器可用于復雜樣品中TC 的檢測，在實際檢測方面具有較大的發展潛力。

3 結論

本研究以魯米諾/H2O2 為ECL 發光體系，構建了一種基于適配體功能化微通道的ECL 傳感器用于檢測TC。采用魯米諾/H2O2 作為發光體系降低了微通道鉗位電壓的影響，提高了ECL 的發光效率，可實現對目標物TC 的超靈敏檢測。本傳感體系引入適配體提高了傳感器的選擇性，通過更換不同目標物的適配體可以檢測不同的目標物，具有良好的通用性和便利性。

References

[1] ZHANG K， HE X， LIU Y， YU P， FEI J， MAO L. Anal. Chem. ， 2017， 89（12）： 6794-6799.

[2] ZHANG S， SONG L， LIU B， ZHAO Y D， CHEN W. Anal. Chim. Acta， 2023， 1251： 341000.

[3] ZHANG K， WEI H， XIONG T， JIANG Y， MA W， WU F， YU P， MAO L. Chem. Sci. ， 2021， 12（21）： 7369-7376.

[4] WEI C， BARD A J， FELDBERG S W. Anal. Chem. ， 1997， 69（22）： 4627-4633.

[5] HE X， ZHANG K， LI T， JIANG Y， YU P， MAO L. J. Am. Chem. Soc. ， 2017， 139（4）： 1396-1399.

[6] GAO Ya-Fang， LU Li-Ping. Chin. J. Anal. Chem. ， 2022， 50（12）： 1852-1859.

高亞芳， 魯理平. 分析化學， 2022， 50（12）： 1852-1859.

[7] ADAMSON N S， THEAKSTONE A G， SOULSBY L C， DOEVEN E H， KERR E， HOGAN C F， FRANCIS P S， DENNANY L. Chem. Sci. ， 2021， 12（28）： 9770-9777.

[8] JIANG Hui， WANG Xue-Mei. Chin. J. Anal. Chem. ， 2017， 45（12）： 1776-1785.

姜暉， 王雪梅. 分析化學， 2017， 45（12）： 1776-1785.

[9] HUANG Y， LU Y， HUANG X， WANG J， QIU B， LUO F， LIN Z. Chem. Sci. ， 2021， 12（39）： 13151-13157.

[10] HUANG Y， LUO F， WANG J， WANG L， QIU B， LIN C， LIN Z. Anal. Chem. ， 2021， 93（51）： 17127-17133.

[11] HUANG Y， CAI H， LIN Y， LUO F， LIN C， WANG J， QIU B， LIN Z. Anal. Chem. ， 2024， 96（13）： 5251-5257.

[12] HUANG Y， LI W， ZHENG J， LUO F， QIU B， WANG J， LIN C， LIN Z. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2022， 14（32）： 37222-37228.

[13] MA H， WANG Q， HUANG L， WANG Y， CHEN F， LIU F， MA Y. Anal. Chem. ， 2025， 97（1）： 594-601.

[14] GB/T 22990—2008. Determination of Oxytetracycline， Tetracycline， Chlortetracycline， Doxycycline Residues in Milk and Milk Powder—HPLC-UV Method. National Standards of the People′s Republic of China.

牛奶和奶粉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法. 中華人民共和國國家標準. GB/T 22990—2008.

[15] LI C， JI Y， SHI Y， XU X， BAO L， CUI M， TIAN Z， ZHAO Z. Appl. Surf. Sci. ， 2023， 640： 158442.

[16] ZHANG Y， CHEN Y， FU Y， YING C， FENG Y， HUANG Q， WANG C， PEI D S， WANG D. Sci. Rep. ， 2016， 6： 27959.

[17] PANG Y H， LV Z Y， SUN J C， YANG C， SHEN X F. Food Chem. ， 2021， 355： 129411.

[18] LI J， CHEN L， WANG X， JIN H， DING L， ZHANG K， ZHANG H. Talanta， 2008， 75（5）： 1245-1252.

[19] NAIDONG W， HUA S， ROETS E， HOOGMARTENS J. J. Pharm. Biomed. Anal. ， 2003， 33（1）： 85-93.

[20] KOWALSKI P. J. Pharm. Biomed. Anal. ， 2008， 47（3）： 487-493.

[21] AGA D S， GOLDFISH R， KULSHRESTHA P. Analyst， 2003， 128（6）： 658-662.

[22] GAO F， ZHAO Y， DAI X， XU W， ZHAN F， LIU Y， WANG Q. Food Chem. ， 2024， 430： 137041.

[23] TANG Y F， LIU P P， XU J， LI L L， YANG L W， LIU X Q， LIU S H， ZHOU Y M. Sens. Actuators， B， 2018， 258： 906-912.

[24] ALAWAD A， ISTAMBOULIé G， CALAS-BLANCHARD C， NOGUER T. Sens. Actuators， B， 2019， 288： 141-146.

[25] GAO C， LIU Z， CHEN J， YAN Z. Luminescence， 2013， 28（3）： 378-383.

[26] YUE L， LIU Y T. J. Phys. Chem. B， 2020， 124（35）： 7682-7693.

[27] WANG J， WANG S， ZHANG K， LIU F， DU Q. J. Mol. Struct. ， 2024， 1309： 138152.

[28] MARQUETTE C A， RAVAUD S， BLUM L J. Anal. Lett. ， 2000， 33（9）： 1779-1796.

[29] COLLAUDIN A B， BLUM L J. Photochem. Photobiol. ， 1997， 65（2）： 303-308.

[30] WANG Y L， SUN Y J， DAI H C， NI P J， JIANG S， LU W D， LI Z， LI Z. Sens. Actuators， B， 2016， 236： 621-626.

[31] LI X Y， LONG Q H， PAN Z J， MA X H， XIA C H， MAI X， LI N. Spectrochim. Acta， Part A， 2024， 320： 124610.

[32] ZHONG Z， WANG C， ZHAO F， ZENG B. Microchim. Acta， 2024， 191（6）： 344.

[33] CUI X P， LEI T T， ZHANG J， CHEN Z F， LUO H， CHEN H， HE Y， SONG G W. Spectrochim. Acta， Part A， 2022， 283：121727.

[34] ELAMIN M B. Polym. Adv. Technol. ， 2024， 35（8）： e6543.

國家自然科學基金項目（No. 22374024）和福州大學化學學院化學拔尖人才創新訓練計劃項目（No. HXBJ202404）資助。