豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞黏附及致炎作用的影響

摘 要：本文根據豬源糞腸球菌的分離與鑒定得到豬源糞腸球菌N8與N41菌株，通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察等實驗室檢測方法，分析不同豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞黏附情況。結果顯示通過熒光定量PCR技術分析發現，糞腸球菌會引起IPEC-J2細胞出現不同程度的炎癥水平，同時會增加陽性細胞因子表達，通過該作用可加快上皮—間質轉化。本文主要分析豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞黏附及致炎作用機制，為防范與干預豬源糞腸球菌提供參考。

關鍵詞：豬源糞腸球菌；豬小腸上皮細胞；黏附；致炎

豬源糞腸球菌是引起豬腸道感染的常見腸球菌種之一，本身屬于革蘭氏陽性球菌，也是一種常見的條件性致病菌[1]。在人體與動物的腸道、糞便中均存在糞腸球菌，也是現階段醫院獲得性感染的主要病原菌之一[2]。隨著臨床抗生素藥物的不合理使用以及違規使用獸藥等原因，造成糞腸球菌中存在一定的多重耐藥菌株，增加感染后的治療難度，具有潛在的健康威脅[3]。結合細菌感染宿主過程的分析，細菌需要在前期完成黏附、定植，不同細菌可通過不同的黏附機制實現對宿主的黏附與感染，雖然宿主機體存在免疫作用機制也可抑制細菌，但是不同細菌存在不同的免疫逃逸機制，實現細菌在機體中的定植。糞腸球菌對動物、人類均有影響，但是關于糞腸球菌對腸上皮細胞黏附、打破屏障機制以及引發細胞炎性應答的作用機制尚不明確，需要繼續做好研究[4]。基于此，本文對豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞黏附及致炎作用的影響機制開展試驗分析研究，以為更多糞腸球菌的研究與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

根據豬源糞腸球菌的分離與鑒定方法得到豬源糞腸球菌N8與N41菌株，同時由動物醫學實驗室提供對照菌株大腸埃希菌O157：H7、豬小腸上皮細胞。

試驗中使用的試劑主要有羊抗兔二抗，并經過異硫氰酸酯與辣根過氧化物酶的標記，胎牛血清、化學發光顯色液、營養液等。

所使用的儀器主要有酶標儀、熒光定量PCT儀器、凝膠成像系統、細菌濁度計、電子顯微鏡、熒光顯微鏡、電泳儀等，所有實驗中所用儀器均滿足精度質控要求。

1.2 方法

本次實驗主要完成的內容包括染色鏡檢觀察、制備糞腸球菌的滅活與抗體、間接免疫熒光顯微鏡下觀察糞腸球菌黏附豬小腸上皮細胞的形態，在完成間接免疫熒光檢查的基礎上使用電子顯微鏡觀察糞腸球菌黏附豬小腸上皮細胞的形態。在上皮—間質轉化標志物檢測方面，分析糞腸球菌誘導豬小腸上皮細胞的上皮－間質轉化標志物的變化，同時設置陽性對照組，即大腸埃希菌O157：H7，使用多種上皮－間質轉化標志物并完成分析，同時在ECL顯色后完成具體結果的觀察。在糞腸球菌黏附在豬小腸上皮細胞炎癥因子表達檢測方面，通過對細胞樣品的處理，然后提取總RNA，通過反轉錄操作得到所需要的樣品。在測定細胞炎性因子過程中，要按照細胞因子基因序列完成PCR引物序列的設計，整個實驗操作過程均由專業人士完成，嚴格按照實驗流程、不同試劑盒操作說明等完成具體操作以及試驗結果的記錄與分析。

1.3 觀察指標

觀察在實驗操作期間的不同現象以及不同方法檢測后對應結果的相同點與不同點。

2 結果

2.1 革蘭氏染色與吉姆薩染色鏡檢情況

豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞黏附后，分別采取常規革蘭氏染色鏡檢與吉姆薩染色鏡檢，在顯微鏡下均可見豬小腸上皮細胞的表面以及細胞之間連接較緊密的區域均存在糞腸球菌的黏附。豬小腸上皮細胞中的糞腸球菌黏附有一定的聚集作用，黏附存在明顯的不均勻特點。不同染色鏡檢下所看到的豬小腸上皮細胞被糞腸球菌黏附情況存在一致性。

2.2 間接免疫熒光觀察結果

對豬小腸上皮細胞在糞腸球菌黏附后的表現使用間接免疫熒光法完成檢測，通過熒光顯微鏡觀察后發現，同未受到糞腸球菌黏附感染的豬小腸上皮細胞相比，豬小腸上皮細胞在被糞腸球菌黏附感染后，對應的細胞膜上存在綠色熒光，且整體熒光較明顯。觀察中再次發現糞腸球菌在豬小腸上皮細胞的黏附有聚集性，黏附存在不均勻的特點，對應表現與革蘭氏染色與吉姆薩染色鏡檢情況存在一致性。

2.3 電子顯微鏡觀察結果

通過掃描電子顯微鏡圖片，發現糞腸球菌黏附在豬小腸上皮細胞體內的形態與體外模擬實驗基本一致，有微絨毛存在頂端。豬小腸上皮細胞受到糞腸球菌黏附后，主要集中在頂端微絨位置，同樣能看到糞腸球菌在黏附過程中存在的聚集性。電子顯微鏡下可見糞腸球菌在侵入細胞過程中可借助自身絨毛屏障與細胞壁結合，并伴有內陷，此階段為糞腸球菌侵入細胞的初始階段。

2.4 糞腸球菌侵入對細胞炎性因子轉錄水平的影響

在分析糞腸球菌侵入對細胞炎性因子轉錄水平的影響方面，使用熒光定量PCR技術，并設置空白對照組，然后與感染組完成對比分析。與對照組相比，糞腸球菌侵入細胞后對常見的白細胞介素-6、白細胞介素-8、白細胞介素-１β的表達規律存在相似性。糞腸球菌對侵入細胞后的前

4 h，炎癥反應整體呈現出升高趨勢，但是在感染4～6 h，此時的炎癥反應則呈現出下降趨勢，不過整體炎癥因子表達水平較對照組更高。根據對不同糞腸球菌侵入細胞后所產生炎癥因子表達的情況，不同糞腸球菌侵入對炎性因子轉錄水平的影響存在差異，說明不同糞腸球菌在侵入豬小腸上皮細胞后對炎性因子的作用機制有所不同。

2.5 細菌感染對上皮細胞間質轉化標志物的影響

對豬小腸上皮細胞采取糞腸球菌感染以及大腸埃希菌感染部位，在感染12 h后分析，了解豬小腸上皮細胞中標志物的轉錄水平。從波形蛋白、蝸形蛋白、β-連環蛋白、Ｅ-鈣黏蛋白等方面進行分析，大腸埃希菌在感染豬小腸上皮細胞后，上述標志物的mRNA轉錄水平提高，但是糞腸球菌對上述標志物中的Ｅ-鈣黏蛋白的表達部分產生抑制，對其他mRNA轉錄水平影響較小，糞腸球菌在感染后，不同標志物蛋白的表達量同mRNA轉錄水平變化存在一致性。

3 討論

在豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞黏附及致炎作用影響研究過程中，設置了不同豬源糞腸球菌對照以及大腸埃希菌感染對照，在了解具體豬源糞腸球菌感染豬小腸上皮細胞黏附機制方面，采取了多種實驗室檢查方法，不同實驗方法對應的結果一致。豬源糞腸球菌在感染豬小腸上皮細胞后在體外可產生黏附，而且呈現出聚集性黏附現象。通過電子顯微鏡檢查發現糞腸球菌在侵入細胞過程中可借助自身絨毛屏障與細胞壁結合，并伴有內陷，分析可能是因糞腸球菌在感染細胞過程中會釋放溶細胞素等毒力因子，造成細胞表面出現凹陷。其他報道中也證實了溶細胞素的表達同糞腸球菌感染性密切相關，通過溶細胞素的作用讓細菌能更好地侵入細胞中[5]。

細菌感染后可伴有明顯的炎癥因子水平升高，這一結論在臨床醫學已經得到證實，早期炎癥因子是機體免疫應答的表現，但是在炎癥因子水平過高的情況下同樣也會對機體產生影響，換言之，細菌感染后機體炎癥因子變化受到多種作用機制的調控，使其保持在相對合理的范圍內，同時體現出機體的免疫應答與調節狀況[6]。不同糞腸球菌因為在毒力方面存在不同，所以在感染細胞后所引起的炎癥反應變化、炎癥反應強度均有不同，不過具體的作用機制依然需要加大研究。糞腸球菌感染豬小腸上皮細胞后對常見的上皮細胞中標志物轉錄水平影響較小，說明糞腸球菌作為一種條件性致病菌，不會促進病理性的間質轉化，也不會促進細胞骨架遷移，而且不同標志物蛋白的表達量同mRNA轉錄水平變化均保持一致[7]。

結語

綜上所述，豬源糞腸球菌對豬小腸上皮細胞有黏附作用，同時會增加陽性細胞因子表達，通過該作用可以致炎并加快上皮－間質轉化。

參考文獻：

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[7]王東，陳萬昭，李宏博，等.新疆阿克蘇地區豬場optrA/lsa（E）陽性糞腸球菌的耐藥情況及傳播特點分析[J].中國農業科學，

2023，56（16）：3213-3225.

收稿時間：2025-03-12

作者簡介：李躍強（1976—），男，本科，獸醫師。研究方向：畜牧獸醫。