基于LCMS-IT-TOF技術分析注射用頭孢他啶聚合物雜質

摘要：目的 對注射用頭孢他啶聚合物雜質進行分析。 方法 采用高效液相-離子肼與飛行時間串聯質譜（LCMS-IT-TOF）技術，利用雜質對照品，結合強制聚合法制備富含聚合物雜質的降解溶液，對注射用頭孢他啶中聚合物雜質進行定位分析。進行RP-HPLC法和葡聚糖凝膠G10（Sephadex G10）色譜法檢測注射用頭孢他啶聚合物雜質的比較。結果 LCMS-IT-TOF技術共推定7個未知雜質（雜質N1、N2、未知雜質3、O、P1、P2、T）和3個已知雜質（Q1、Q2、R）的化學結構，并證明已知雜質D在實際樣品中不存在。較葡聚糖凝膠G10色譜法，RP-HPLC法分析頭孢他啶聚合物雜質專屬性強，結果客觀準確。結論 LCMS-IT-TOF技術，正負極性可高速切換，具有極好的質量穩定性，可保證正離子模式和負離子模式下的高質量精確度，從而獲得更可靠的質譜分析結果。

關鍵詞：注射用頭孢他啶；聚合物雜質；LCMS-IT-TOF；分子質量；化學結構

中圖分類號：R917 文獻標志碼：A

Analysis of ceftazidime polymer impurities for injection

based on LCMS-IT-TOF technology

Yang Junbin and Fu Xiaoya

（Hainan Provincial Institute of Inspection and Testing Drug Control， Haikou 570216）

Abstract Objective To analyze ceftazidime polymer impurities for injection. Methods The polymer impurities in ceftazidime for injection were localized and analyzed by using high-performance liquid-phase ion trap and time-of-flight tandem mass spectrometry （LCMS-IT-TOF）. Use an impurity control combined with forced polymerization to prepare a degradation solution rich in polymer impurities. A comparison was made between RP-HPLC and Sephadex G10 for the determination of impurity in ceftazidime polymer for injection. Results The LCMS-IT-TOF technique inferred the chemical structure of 7 unknown impurities （impurities N1， N2， 3， O， P1， P2， T） and 3 known impurities （impurities Q1， Q2 and R）. It was also proved that the known impurity D did not exist in the actual sample. Compared with Sephadex G10 chromatography and RP-HPLC methods， this ceftazidime polymer impurity analysis was more specific， objective， and accurate. Conclusion The LCMS-IT-TOF technology， with positive and negative polarity switched at high speed and excellent mass stability， could ensure high-quality accuracy in positive and negative ion mode， resulting in more reliable mass spectrometry results.

Key words Ceftazidime for injection; Polymer impurity; LCMS-IT-TOF; Molecular mass; Chemical structure

注射用頭孢他啶是頭孢他啶加適量碳酸鈉或精氨酸做助溶劑制成的無菌粉末[1]。頭孢他啶為半合成第3代頭孢菌素，臨床應用廣泛。其不良反應（ADR）主要以皮膚系統損害為主，主要臨床表現為皮疹和紅斑等，還可引起急性過敏性休克或遲性過敏性反應等嚴重不良反應[2]。頭孢他啶對酸、堿、加熱和光照均不穩定，在生產和貯存過程中可以形成多種雜質，其中聚合物類雜質可能引起過敏反應。目前頭孢菌素類抗生素聚合物類雜質的質控方法主要包括葡聚糖凝膠G10（Sephadex G10）色譜法、高效凝膠色譜法（HP-SEC）、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）等。對聚合物類雜質的質控理念由總量控制發展為對指針式聚合物雜質進行精準控制。因而，對注射用頭孢他啶聚合物類雜質的精準細分研究愈發重要。李進等采用LC-MS技術對頭孢他啶強制聚合產生聚合物雜質進行了分析[3]；《中國藥典》（ChP）2020年版采用RP-HPLC方法控制頭孢唑肟鈉中的聚合物類雜質[4]，本文在上述文獻的基礎上，采用RP-HPLC測定注射用頭孢他啶中的聚合物雜質，利用LCMS-IT-TOF技術對聚合物雜質進行準確定位，參考文獻[5]推測聚合物雜質的可能結構，并與ChP 2020年版收載的葡聚糖凝膠G10色譜法結果進行了比較。

1 材料與方法

1.1 儀器

LCMS-IT-TOF液相色譜質譜聯用儀和LC-2030C高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）， XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）， PB-10酸度計和KQ-250DE型數控超聲波清洗器（德國Sartorius公司）。

1.2 試劑和試藥

注射用頭孢他啶（A廠家，批號T190613、T190614、T190615、T190622、T190623、T190624）；雜質D（批號PITBTD-SMH-20180928-01，含量90.68%）和雜質R（批號PITBTD-DimerB-20201223-01，含量90.87%）購自廣州牌牌生物科技有限公司；雜質Q1（批號20-C050232-08，含量93.39%）、雜質Q2（批號20-C050231-12，含量93.51%）和雜質E（批號19-C050205-01，含量99.27%）購自深圳卓越生物科技有限公司。已知雜質的結構見圖1。

十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、氨水等為分析純；甲酸、甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

1.3 RP-HPLC法

色譜條件： 采用Phenomenex Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；柱溫：30 ℃；流動相：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（取十二水合磷酸氫二鈉3.6 g與磷酸二氫鉀1.4 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用10%磷酸溶液調節pH值至3.4）為流動相A，甲醇-乙腈（1：1）為流動相B；梯度洗脫（0～4 min，B 4%～11%；4～5 min，B 11%；5～11 min，B 11%～13%；11～15 min，B 13%～16%；15～30 min，B 16%～20%；30～48 min，B 20%～50%；48～49 min，B 50%～4%；49～63 min，B 4%）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL。

1.4 LC-MS法

色譜條件：采用ACQUITY UPLC? HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相：0.1%甲酸溶液（氨水調節pH值至3.4）為流動相A，甲醇-乙腈（1：1）為流動相B；梯度洗脫（0～4 min，B 4%～11%；4～5 min，B 11%；5～11 min，B 11%～13%；11～15 min，B 13%～16%；15～30 min，B 16%～20%；30～48 min，B 20%～50%）；檢測波長： 254 nm；流速：0.3 mL/min，進樣量：3 μL。

質譜條件： 采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正負離子分別掃描；一級m/z范圍450～2000，二級m/z 范圍100～2000；霧化氣為N2，流速：1.5 L/min；CDL溫度：200 ℃；Heat Block溫度：200 ℃；檢測電壓：1.65 kV；RP真空壓：96.0 Pa。

2 溶液的制備

雜質定位溶液：取雜質D對照品、雜質Q1對照品、雜質Q2對照品、雜質R對照品及雜質E對照品各適量，分別加水溶解，搖勻，作為各雜質定位溶液。

降解溶液：取注射用頭孢他啶樣品適量，加水溶解并制成每1 mL中約含頭孢他啶10 mg的溶液，25 ℃下放置4 d后，量取1 mL置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

混合溶液：在降解溶液中，加入雜質D、Q1、Q2、R、E對照品各適量，搖勻。

3 結果與討論

3.1 RP-HPLC法定位頭孢他啶已知雜質

分別進樣諸雜質定位溶液、混合溶液、降解溶液及空白溶液，各雜質峰間的分離度均大于1.5，典型色譜圖見圖2，并發現已知雜質D和雜質E在頭孢他啶降解溶液中不存在。

3.2 LCMS-IT-TOF技術推定雜質的化學結構

3.2.1 雜質峰2和雜質峰3（Mr=692Da）

雜質峰2和雜質峰3（未知雜質1和2）在全掃描正離子一級質譜圖中均存在m/z 693.1（z=1）的[M+H]+加合離子峰；二級質譜圖均顯示中性丟失吡啶的子離子m/z 614 （m/z 693-79 Da）。在全掃描負離子一級質譜圖中存在m/z 647.1 （z=1）、m/z 612.0（z=1）、m/z 568.0 （z=1）的離子峰，分別為[M-HCOO]-峰，[M-H]-峰丟失吡啶的離子峰m/z 612（m/z 691-79 Da）及進一步丟失CO2形成子離子峰m/z 568.0 （m/z 612-44 Da）。據此認為未知雜質1和2的分子質量為692 Da，比頭孢他啶的分子質量多146 Da。結合參考文獻[3，5]，推定其為頭孢他啶二聚體Ⅰ水解形成的一對順反異構體（圖3）。LC/MS解析見表1。分別命名為雜質N1和雜質N2。

3.2.2 雜質峰4（Mr=1005Da）

雜質峰4（未知雜質3）在全掃描正離子一級質譜圖中存在m/z 503.6（z=2）的[M+2H]++加合離子峰；在全掃描負離子一級質譜圖中均存在m/z 1004.1（z=1）的[M-H]-離子峰， m/z 1004[M-H]-峰丟失吡啶79 Da、再進一步丟失CO2 44 Da形成m/z 881（m/z 1004-79-44 Da）的離子峰。據此推斷未知雜質3的分子質量為1005 Da，LC/MS解析見表1，該雜質的結構有待進一步推斷。

3.2.3 雜質峰5（Mr=1031Da）

雜質峰5（未知雜質4）在全掃描正離子一級質譜圖中存在m/z 516.6（z=2）的[M+2H]++加合離子峰， 在全掃描負離子一級質譜圖中存在m/z 1030.1（z=1）的[M-H]-離子峰，即未知雜質4的分子質量為1031 Da。依據氨噻肟頭孢菌素聚合反應的一般規律[5]，推定其為頭孢他啶二聚體I的開環水解物；結合頭孢菌素類抗生素的一般水解規律，推測其水解位點為四元內酰胺環（圖4），LC/MS解析見表1，命名為雜質O（頭孢他啶二聚體I水解物，Mr=1031Da）。

3.2.4 雜質峰6和雜質峰10（Mr=1159Da）

雜質峰6和雜質峰10（未知雜質5和6）在全掃描正離子一級質譜圖中均存在m/z 580.6（z=2）的[M+2H]++加合離子峰； 未知雜質5在二級質譜圖中存在m/z 1020的子離子，其為中性丟失吡啶形成m/z 1081（m/z1160-79 Da）、再丟失CO2形成m/z 1037（m/z 1081-44 Da）、再丟失NH3形成的子離子（m/z 1037-17Da）；未知雜質6在二級質譜圖中存在m/z 541.0（z=2） 的子離子，其為丟失吡啶（m/z 580.6-79/2 Da）形成的子離子。未知雜質5和6全掃描負離子一級質譜圖中均存在m/z 1158.1（z=1）的[M-H]-離子峰；未知雜質5存在丟失吡啶m/z 1079 （m/z 1158-79Da） 形成的子離子，其再丟失CO2 形成m/z 1 035 （m/z 1079-44 Da） 的子離子。據此推斷未知雜質5和6的分子量為1159 Da。依據參考文獻[5]，推定其為頭孢他啶7位側鏈的氨基與頭孢他啶降解物N1和N2的3位側鏈聚合形成的一對順反異構體（圖5）。LC/MS解析見表1。分別命名為雜質P1和雜質P2。

3.2.5 雜質峰7和雜質峰8（Mr=1075Da）

雜質峰7和峰8和一對已知頭孢他啶雜質對照品Q1和Q2的保留值相同（圖2）。在全掃描正離子一級質譜圖中均存在m/z 538.1 （z=2）的[M+2H]++加合離子峰；二級質譜圖均存在丟失吡啶（m/z 538.1-79/2 Da）形成的m/z 498.6（z=2）的子離子，即雜質峰7和雜質峰8的分子量均為1075 Da，與已知雜質對照品Q1和Q2的分子量相同，進而推定他們分別為已知雜質Q1和Q2（圖1），LC/MS解析見表1。

3.2.6 雜質峰9（ Mr=1013Da）

雜質峰9和已知頭孢他啶雜質R對照品的保留值相同（圖2）。全掃描正離子一級質譜圖中存在m/z 507.6 （z=2）的[M+2H]++加合離子峰；負離子質譜圖中存在m/z 1012.1（z=1）的[M-H]-離子峰和丟失吡啶（m/z 1012-79 Da）形成的m/z 933的子離子。即雜質峰9的分子量為1013 Da。與已知雜質對照品R的分子量相同（圖1），進而推定其為雜質R。LC/MS解析見表1。

3.2.7 雜質峰11（Mr=1559Da）

雜質峰11（未知雜質7）在全掃描正離子一級質譜圖中存在m/z 780.6（z=2）、m/z 520.8 （z=3）的[M+2H]++、[M+3H]+++加合離子峰；二級質譜圖中存在丟失吡啶（m/z 780.6-79/2 Da）形成的m/z 741.11（z=2）子離子峰。依據頭孢菌素類抗生素的聚合反應機制[5]，推斷其可能為某種頭孢他啶三聚體Ⅱ（Mr=1559Da）（圖6），命名為雜質T，具體結構尚待進一步確證。LC/MS解析見表1。

3.3 聚合物分析結果比較

采用RP-HPLC法和Sephadex G10色譜法對注射用頭孢他啶進行聚合物雜質進行分析比較（表2）。結果顯示， RP-HPLC法較Sephadex G10色譜法分析頭孢他啶聚合物雜質的專屬性更強；Sephadex G10色譜法只能測定聚合物總量，且聚合物色譜峰易受到藥物中其他極性較大的小分子雜質的共出峰干擾，專屬性差，結果是RP-HPLC法的10倍。而RP-HPLC方法可對指針性聚合物雜質進行精準控制[6-9] 。

4 討論

國內在對注射用頭孢他啶進行一致性評價時，都要求分析完善其產品中的聚合物類雜質信息，包括分子量介于主成分與二聚體之間的聚合物降解雜質、二聚體、三聚體或多聚體等，但聚合物雜質合成難度極大，且純度控制和結構確定較困難。近年來有不少文獻對β－內酰胺類抗生素的聚合反應機理及質譜碎裂規律進行了詳細的闡述。7-氨噻肟頭孢菌素的聚合反應主要與7位側鏈的氨基有關，其3位具有可解離基團，聚合反應既可通過氨基攻擊另一分子的3位側鏈（聚合反應Ⅰ）發生，也可以通過氨基攻擊另一分子的β-內酰胺環（聚合反應Ⅱ）發生［10，11］。本文采用的高效液相-離子肼與飛行時間串聯質譜（LCMS-IT-TOF）技術，利用雜質對照品結合強制聚合法制備富含聚合物雜質的降解溶液，對注射用頭孢他啶中聚合物類雜質進行定性分析。利用雜質對照品證明雜質D在頭孢他啶樣品中不存在；利用結合了QIT（離子阱）和TOF（飛行時間）技術的LCMS-IT-TO質譜儀，通過高分辨全掃描分析，并結合液相色譜的雜質定位信息，對頭孢他啶混合溶液、降解溶液中的雜質進行確認，共推定了7個未知雜質（雜質N1、N2、未知雜質3、O、P1、P2、T）和3個已知雜質（Q1、Q2、R）的分子量和化學結構式。上述雜質中，雜質N1、N2為分子量介于主成分與二聚體之間的聚合雜質，未知雜質3、雜質O、P1、P2、Q1、Q2、R、T均為聚合物雜質。

LCMS-IT-TOF技術通過正負極性的高速切換，可同時獲得正離子模式和負離子模式的信息，并具有極好的質量穩定性，保證了正離子模式和負離子模式下的高質量精確度，從而可獲得更可靠的質譜分析結果。而高效液相色譜－飛行時間質譜聯用技術結合了色譜的強分離能力和飛行質譜的高分辨定性能力，通過色譜分離和質譜逐級裂解，可以獲得豐富的分子結構信息，在對藥物未知雜質的結構鑒定中可發揮重要作用[12]。

參 考 文 獻

國家藥典委員會. 注射用頭孢他啶. 中華人民共和國藥典二部[S]. （2020年版）. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 292-294.

蔡麗萍， 曾忠榮， 韓一波， 等. 162例頭孢他啶致藥品不良反應分析[J]. 醫學理論與實踐， 2022， 35（13）： 2292-2307.

李進， 姚尚辰， 尹利輝， 等. 頭孢他啶原料及制劑的聚合物雜質分析[J]. 藥學學報， 2020， 55（8）： 1889-1896.

國家藥典委員會. 注射用頭孢他啶.中華人民共和國藥典二部[S]. （2020年版）. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 342-344.

胡昌勤， 李進， 張夏. 7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物分析[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（3）： 209-220．

李進， 張培培， 崇小萌， 等. 阿莫西林克拉維酸鉀復方制劑中聚合物雜質的分析[J]. 藥物分析雜志， 2017， 37： 1430-1440.

楊美琴， 金少鴻， 胡昌勤." HPLC-柱切換法歸屬青霉素鈉有關物質中的聚合物分析[J]. 藥物分析雜志， 2009， 29： 1615-1620.

李進， 張培培， 姚尚辰， 等. 頭孢拉定原料及制劑的聚合物雜質分析[J]. 中國抗生素雜志， 2019， 44： 362-369.

李進， 張培培， 姚尚辰， 等. 注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉的聚合物雜質分析[J]. 藥物分析雜志， 2019， 39： 1279-1294.

秦峰， 丁穎， 裘亞， 等. 在線二維凝膠色譜反相液相色譜-飛行時間質譜技術對鹽酸頭孢替安中聚合物雜質的分析研究[J]. 中國藥學雜志， 2016， 51（9）： 742-750.

朱培曦， 賈飛， 陳悅， 等. 兩對頭孢菌素類抗生素異構體的質譜識別研究[J]. 質譜學報， 2015， 36（4）： 350-358.

陳志謙， 鐘昌平， 陸齊泉， 等. 高效液相色譜－四極桿飛行時間質譜法鑒定頭孢他啶原料藥的有關物質[J]. 中國醫院藥學雜志， 2021， 41（12）： 1219-1228.

收稿日期：2024-12-06

作者簡介：楊俊斌，男，生于1966年，碩士，高級工程師，主要研究方向為藥品質量監督管理法規和藥品檢驗技術，E-mail： 1243322641@qq.com

*通信作者， E-mail： 911794134@qq.com

第一作者：楊俊斌，男，生于1966年，1994年畢業于華西醫科大學藥學院藥劑學專業，獲理學碩士學位，制藥高級工程師。2000年以來先后在海南省藥品監管理局、海南省食品藥品監督管理局、海南省藥品檢驗所、海南省檢驗檢測研究院任職，主要從事藥品質量監督管理法規和藥品檢驗技術的研究，主持完成多個藥品品種的國家評價性抽驗、標準提高等工作。

通信作者，傅小雅，女，生于1973年，1995年畢業于中國藥科大學藥學專業，獲理學學士學位，副主任藥師，1995年起至今就職于海南省藥品檢驗所，主要從事藥品檢驗及藥品質量研究工作，承擔并完成多個品種國家評價性抽驗工作、質量標準的起草與復核、國家藥品標準提高、進口藥品標準復核等工作。