亞胺培南有關(guān)物質(zhì)測定方法的優(yōu)化

摘要：目的 優(yōu)化亞胺培南有關(guān)物質(zhì)的測定方法。方法 采用C18色譜柱（Inertsil ODS-3，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為pH7.3磷酸鹽緩沖液-乙腈（99.3：0.7），流動相B為pH7.3磷酸鹽緩沖液-乙腈（75：25）；線性梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣體積10 μL。結(jié)果 亞胺培南峰與各雜質(zhì)峰分離度良好，亞胺培南在0.5～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，檢測限為0.2 μg/mL（0.02%），重復(fù)性符合規(guī)定。結(jié)論 本方法靈敏度高，分離效果好，可實現(xiàn)對亞胺培南已知雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)進行同時檢測。

關(guān)鍵詞：亞胺培南；有關(guān)物質(zhì)；聚合物；方法優(yōu)化；質(zhì)量控制

中圖分類號：R978.1 文獻標(biāo)志碼：A

Optimization of the HPLC method for determination

of related substances in imipenem

Jia Yanhua， Peng Jie， Luo Jialin， Li Pei， Ding Zishan， and Hong Jianwen

（Guangdong Institute for Drug Control， Guangzhou 510663）

Abstract Objective To optimize the determination method of related substances in imipenem. Methods The HPLC analysis was performed on a C18 column（Inertsil ODS-3， 4.6 mm × 250 mm， 5 μm）; the mobile phase A was phosphate buffer-acetonitrile （99.3：0.7， V/V） with pH value of pH7.3， and the mobile phase B was phosphate buffer-acetonitrile （75：25， V/V） with pH value of pH7.3. The gradient elution was performed， and the flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 210 nm. The injection volume was 10 μL. Results The peaks of imipenem and its related substances were separated well. The linearity was good within the range of 0.5～100.0 μg/mL，" and the limit of detection was 0.2 μg/mL （0.02%）. Repeatability met the requirements. Conclusion The method had the advantages of high sensitivity and good resolution， and could be used for the simultaneous detection of impurities and polymers.

Key words Imipenem; Related substances; Polymers; Method optimization; Quality control

亞胺培南（imipenem）是含碳青霉烯環(huán)的硫霉素類廣譜抗生素，具有高效、廣譜、耐酶和毒性小等特點[1]。但亞胺培南易被體內(nèi)腎脫氫肽酶-I（DHP-I）代謝失活，需與DHP-I抑制劑西司他丁鈉以1：1的比例聯(lián)合用藥，故臨床常見的制劑為亞胺培南西司他丁鈉注射劑[2-3]。臨床主要適用于多種病原體所致和需氧或厭氧菌引起的混合感染，以及在未確定病原菌時的早期治療[4]。亞胺培南/西司他丁鈉注射劑耐受性良好，最常見的不良反應(yīng)有紅斑、局部疼痛和硬結(jié)，血栓性靜脈炎等局部反應(yīng)，皮疹、瘙癢和蕁麻疹等皮膚過敏反應(yīng)，惡心、嘔吐和偽膜性腸炎等胃腸道反應(yīng)，偶見白細胞減少癥等血液方面不良反應(yīng)，也具腎及肝功能損害，但為罕見[5-6]。

國內(nèi)亞胺培南原料現(xiàn)有批準(zhǔn)文號3個。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在國外藥典均已收載，而《中國藥典》尚未收載。在對其有關(guān)物質(zhì)控制方面，USP-NF中未設(shè)置有關(guān)物質(zhì)檢測項，JP18僅對亞胺培南雜質(zhì)A（硫霉素）作為已知雜質(zhì)進行控制，BP 2024控制了亞胺培南雜質(zhì)A（硫霉素）和雜質(zhì)B1和B2。亞胺培南屬β-內(nèi)酰胺類抗生素，該類抗生素易產(chǎn)生聚合物類雜質(zhì)。研究證明，聚合物類高分子雜質(zhì)是引發(fā)過敏反應(yīng)的原因之一，它是引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)的過敏原[7-8]。對有關(guān)物質(zhì)和聚合物類雜質(zhì)的控制，是保證抗生素類藥品安全性的重要環(huán)節(jié)，也一直是國內(nèi)外藥品質(zhì)量控制的研究熱點之一[9]。本文參考BP 2024及國內(nèi)現(xiàn)行企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化亞胺培南有關(guān)物質(zhì)色譜條件，實現(xiàn)了對亞胺培南已知雜質(zhì)和聚合物類雜質(zhì)的同時檢測。

1 儀器設(shè)備與試藥

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（島津LC-20AT、Agilent 1290 Infinity II/G7104A），液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters XEVOG2 Qtof），電子分析天平（SARTORIUS Secura 225D-1CN型）。

1.2 試藥

亞胺培南對照品（EP公司，批號4.0，93.0%）；亞胺培南雜質(zhì)A（硫霉素）、亞胺培南雜質(zhì)B、亞胺培南二聚物1及亞胺培南二聚物2，來源均為珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司。乙腈（Honeywell公司，色譜純），其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

樣品共10批，分別來自國內(nèi)3家企業(yè)及國外1家企業(yè)，基本涵蓋目前國內(nèi)現(xiàn)狀。

2 方法

2.1 有關(guān)物質(zhì)HPLC分析方法

2.1.1 色譜條件

采用Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以緩沖液A（取無水磷酸氫二鈉1.04 g與無水磷酸二氫鈉0.32 g，加水900 mL使溶解，用稀磷酸調(diào)節(jié)值pH至7.3，用水稀釋至1000 mL）-乙腈（99.3：0.7）為流動相A，以緩沖液A-乙腈（75：25， V/V）為流動相B，按表1進行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣體積為10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：ESI源，正離子模式； 掃描模式：Full MS；掃描范圍：50～1200 m/z；離子源溫度：100℃；毛細管電壓2 kV。

2.2 溶液的配制

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液

亞胺培南峰鑒別溶液：取樣品約5 mg，置10 mL量瓶中，加稀硫酸-水（1：200，V/V）8 mL使溶解，放置5 min，加入碳酸鈉10 mg，用水稀釋至刻度。

聚合物峰鑒別溶液：取樣品約35 mg，置10 mL量瓶中，加0.05%三氟乙酸溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，在冷藏條件下放置約5～10 h內(nèi)使用。

2.2.2 供試品溶液

溶劑：緩沖液B（取無水磷酸氫二鈉0.11 g，加水900 mL使溶解，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，用水稀釋至1000 mL）-乙腈（99.3：0.7，V/V）。

供試品溶液：取樣品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加溶劑溶解稀釋至刻度。臨用新制。

2.2.3 對照溶液

精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度。

2.3 測定法

精密量取空白溶劑、亞胺培南峰鑒別溶液、聚合物峰鑒別溶液、供試品溶液及對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。采用主成分自身對照法以峰面積計算樣品中已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)的含量。

2.4 方法驗證

照《中國藥典》2020年版四部通則9101分析方法驗證指導(dǎo)原則對本方法進行驗證。

2.4.1 專屬性

（1）系統(tǒng)適用性

取“2.2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液，依法進行測定，對各雜質(zhì)間的分離度進行考察。

（2）強制降解實驗

取某生產(chǎn)企業(yè)樣品，照“2.2.2”項下配制供試品溶液，置不同條件下進行降解實驗。

①酸破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，加0.1 mol/L鹽酸0.5 mL，室溫放置10 min，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 mL調(diào)節(jié)至中性。

②堿破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，加0.1 mol/L氫氧化鈉0.5 mL，室溫放置10 min，加

0.1 mol/L鹽酸溶液0.5 mL調(diào)節(jié)至中性。

③氧化破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，加10%過氧化氫溶液0.5 mL，室溫放置10 min。

④熱破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，60 ℃水浴加熱30 min。

⑤紫外破壞溶液制備：取供試品溶液置于紫外光燈（365 nm）下照射24 h。

⑥光照破壞溶液制備：取供試品溶液置于4500lx強光下照射72 h。

⑦高濕破壞溶液制備：取供試品粉末置于相對濕度90%的密閉容器中，放置24 h后配制成供試品溶液。

2.4.2 LOQ（定量限）與LOD（檢測限）

取亞胺培南對照品適量，加溶劑逐步稀釋制成定量限與檢測限溶液，以信噪比（S/N）=10時濃度為定量限，以信噪比（S/N）=3時濃度為檢測限。

2.4.3 線性與范圍

取亞胺培南對照品適量，加溶劑稀釋制成濃度分別為0.5、5.0、10.0、40.0、80.0和100.0 μg/mL的系列濃度溶液，分別進樣；以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸分析。

2.4.4 耐用性

通過改變柱溫、色譜柱類型及高效液相色譜儀品牌等條件，進行耐用性考察。

2.4.5 重復(fù)性

取某生產(chǎn)企業(yè)同一批次樣品，照“2.2.2”項下制備6份供試品溶液，依法測定各雜質(zhì)含量，考察重復(fù)性。

2.4.6 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液分別于8 ℃和25 ℃（即室溫）條件下放置0、1、2、3、5、6和7 h，測定各雜質(zhì)含量，評價供試品溶液的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

選取不同品牌及規(guī)格的色譜柱進行實驗，發(fā)現(xiàn)Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）比Agilent ZORBAX SB-C18（25 cm×4.6 mm，5 μm）、 OSAK SODA CAPCELL PAK C18 MG（25 cm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離度更佳，因此選擇其作為本方法的適用色譜柱。

3.2 檢測波長的選擇

取亞胺培南對照品溶液及系統(tǒng)適用性溶液，利用DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描主成分和各雜質(zhì)峰的吸收波長（圖1），綜合考慮主成分和各已知雜質(zhì)紫外吸收情況，參考BP2024和各企業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，選擇210 nm作為檢測波長，由于亞胺培南的雜質(zhì)對照品不易獲取，采用加校正因子的自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)。

3.3 新HPLC方法與BP2024方法的比較

本方法對BP2024亞胺培南有關(guān)物質(zhì)分析方法中推薦的C18短色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）改為C18長柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），同時對流動相梯度洗脫程序（梯度時間由29 min改為76 min）、系統(tǒng)適用性溶液（增加了聚合物峰鑒別溶液）、測定方法（由主成分外標(biāo)法改為自身對照法）及已知雜質(zhì)控制（增加了二聚物1和二聚物2的控制）進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的色譜方法采用填料內(nèi)徑為5 μm的C18長柱，能同時對亞胺培南二聚物1和二聚物2雜質(zhì)進行控制，諸雜質(zhì)的分離良好，且各雜質(zhì)峰的峰形亦較理想。可滿足對不同企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要。

3.4 方法學(xué)驗證

3.4.1 系統(tǒng)適用性

對已知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和來源進行分析，亞胺培南雜質(zhì)B1（差向異構(gòu)體1）、雜質(zhì)B2（差向異構(gòu)體2）、雜質(zhì)A（硫霉素）及二聚物雜質(zhì)均為降解雜質(zhì)，可由主成分在酸或堿破壞條件下產(chǎn)生。在亞胺培南峰鑒別溶液的色譜圖中，亞胺培南主峰保留時間約為12 min，雜質(zhì)B1（差向異構(gòu)體1）、雜質(zhì)B2（差向異構(gòu)體2）和雜質(zhì)A（硫霉素）峰的相對保留時間分別約為0.36、0.38和0.83，雜質(zhì)B1（差向異構(gòu)體1）的峰高與雜質(zhì)B1（差向異構(gòu)體1）和雜質(zhì)B2（差向異構(gòu)體2）兩峰之間的峰谷之比約為3.5；聚合物峰鑒別溶液色譜圖中二聚物1和二聚物2峰的相對保留時間分別約為2.81和3.81。各色譜峰之間可實現(xiàn)有效的分離（圖2）。

3.4.2 強制降解實驗

在強制降解實驗（酸、堿、氧化、熱、紫外、光照、高濕）中，各雜質(zhì)峰與亞胺培南主成分峰的分離度均良好，亞胺培南可能的降解雜質(zhì)均不干擾亞胺培南主峰的測定（圖3）。

3.4.3 LOQ與LOD

本方法的定量限濃度為0.5 μg/mL，相當(dāng)于供試品溶液的0.05%；檢測限濃度為0.2 μg/mL；相當(dāng)于供試品溶液的0.02%。靈敏度滿足要求。

3.4.4 線性范圍

線性方程為Y=21592.9X+4478.6（r=1.0000）。本方法在濃度0.5～100.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

3.4.5 耐用性

改變柱溫、色譜柱及高效液相色譜儀類型對亞胺培南主峰和各雜質(zhì)峰影響較小，各雜質(zhì)峰仍能較好分離，各已知雜質(zhì)相對保留時間變化不大（表2）。

3.4.6 重復(fù)性

取某生產(chǎn)企業(yè)同一批次樣品6份進行測定，雜質(zhì)B1測定結(jié)果為0.1%（RSD為0），雜質(zhì)B2測定結(jié)果為0.1%（RSD為0），雜質(zhì)A測定結(jié)果為0.2%（RSD為0），二聚物1未檢出，二聚物2未檢出，其他單雜未檢出，雜質(zhì)總和為0.4%（RSD為0），提示方法的重復(fù)性良好。

3.4.7 溶液穩(wěn)定性

隨放置時間的增加，樣品中各雜質(zhì)的含量均有增幅，增長趨勢為25 ℃較8 ℃明顯。8 ℃條件下，雜質(zhì)B1和雜質(zhì)B2增長明顯，2.5 h后雜質(zhì)B1由最初的0.13%增長至0.25%，雜質(zhì)B2由最初的0.09%增長至0.19%；雜質(zhì)A變化不顯著，RSD為1.2%；二聚物均未檢出。25 ℃條件下，雜質(zhì)B1和雜質(zhì)B2在放置1.3 h

后即增長1倍，雜質(zhì)A變化不顯著，二聚物均未檢出。提示進行有關(guān)物質(zhì)檢測時，應(yīng)臨用新制且控制進樣器溫度，以減少樣品降解對結(jié)果的影響。

3.5 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對亞胺培南中主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行推測。BP 2024中已明確給出了雜質(zhì)B1、雜質(zhì)B2和雜質(zhì)A的結(jié)構(gòu)，本方法推測的結(jié)果與BP 2024基本一致。亞胺培南二聚物1和二聚物2的質(zhì)譜圖見圖4，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推測見表3。

3.6 樣品測定

取4個生產(chǎn)企業(yè)的10批次樣品進行測定，各企業(yè)樣品中有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)含量存在一定差別，B、D兩企業(yè)樣品中亞胺培南雜質(zhì)A（硫霉素）含量幾乎比A、B兩企業(yè)高出一倍，其中D企業(yè)樣品接近BP2024該雜質(zhì)限度（1.0%）的要求，4個企業(yè)10批次樣品中均未檢出二聚物雜質(zhì)（表4）。

4 結(jié)論

本文建立的亞胺培南有關(guān)物質(zhì)的HPLC方法，可同時測定亞胺培南雜質(zhì)B1、雜質(zhì)B2、雜質(zhì)A及二聚物雜質(zhì)，具有專屬性強、靈敏度高等特點，能滿足對不同企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要。與BP2024方法相比，優(yōu)化后的方法對雜質(zhì)的檢出更為全面，且樣品中的二聚物含量體現(xiàn)出產(chǎn)品中聚合物的水平，具有重要的質(zhì)控意義。本方法為《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增修訂提供了參考。

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收稿日期：2024-12-06

項目基金：廣東省藥品監(jiān)督管理局科技創(chuàng)新項目（No. 2023TDB04）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項目（No. B2023235）

作者簡介：賈艷花，女，生于1980年，碩士，主管藥師，研究方向為藥物質(zhì)量分析與標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail： 39798582@qq.com

*通信作者，E-mail： 553875096@qq.com

第一作者：賈艷花，女，生于1980年，碩士，主管藥師，2010年起就職于廣東省藥品檢驗所，主要從事化學(xué)藥品的檢驗檢測及檢驗標(biāo)準(zhǔn)的起草研究，多次參與或承擔(dān)國家藥品抽檢工作、藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或復(fù)核工作。

通信作者：洪建文，女，生于1972年，博士，主任藥師，廣東省藥品檢驗所二級調(diào)研員，第十一、十二屆國家藥典委員。主持完成多項國家、省、部級科研項目，藥典會專項和藥品標(biāo)準(zhǔn)的制修訂工作。參與項目獲中國藥學(xué)會科學(xué)技術(shù)二等獎。獲發(fā)明專利1項，發(fā)表論文40多篇，SCI收載2篇。