基于兩性離子聚合物的金屬有機(jī)框架涂層的制備及抗菌性研究

摘要：鈦及其合金因具有優(yōu)異的力學(xué)性能和生物相容性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用領(lǐng)域，但鈦及其合金本身缺乏抗菌能力。為了提高鈦合金的抗菌性，改變其表面的結(jié)構(gòu)和成分是一種有效途徑。采用陽(yáng)極氧化法在Ti6Al4V 表面制備TiO2 納米管（titanium dioxide nanotube，TN），在TN 表面接枝聚甲基丙烯酸磺基甜菜堿（poly sulfobetaine methacrylate，PSBMA），通過(guò)水熱法在PSBMATN表面合成負(fù)載環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）的沸石咪唑酸框架-8（zeolitic imidazolateframework-8，ZIF-8），制備了具有酸堿響應(yīng)性能的抗菌涂層CIP@ZIF-8/PSBMA-TN（簡(jiǎn)寫(xiě)為CZPT），通過(guò)潤(rùn)濕性測(cè)試和抗菌性測(cè)試對(duì)涂層的性能進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明： Ti6Al4V 與水的接觸角為71.50°，CZPT 與水的接觸角為14.20°，CZPT 的親水性顯著提高；CZPT 涂層對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別達(dá)到96% 和65%，表現(xiàn)出良好的抗菌性。

關(guān)鍵詞：醫(yī)用鈦合金；表面改性；兩性離子聚合物；ZIF-8；抗菌涂層

中圖分類(lèi)號(hào)：TG 111；R 318.08 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

鈦及其合金因其具有高強(qiáng)度、高生物相容性、良好的耐腐蝕性、良好的耐磨性和無(wú)毒性等性能被認(rèn)為是最理想的植入物[1]。然而，鈦及其合金缺乏抗菌和骨組織結(jié)合能力[2]，生物膜的形成和骨結(jié)合不良是導(dǎo)致種植失效的主要原因。

為了解決上述問(wèn)題，人們開(kāi)發(fā)了許多表面改性方法，如離子注入法、化學(xué)氣相沉積法、微弧氧化法和陽(yáng)極氧化法[3]。在這些方法中，陽(yáng)極氧化法[4] 可以在鈦合金表面制造出二氧化鈦納米管（titaniumdioxide nanotube，TN）膜層，其納米級(jí)的粗糙表面使材料能夠具有良好的親水性，有利于防止細(xì)菌吸附和蛋白質(zhì)粘附。TN 還具有導(dǎo)電性，有利于骨細(xì)胞粘附和增殖。

聚多巴胺（poly-dopamine，PDA）[5] 源自貽貝黏蛋白，可通過(guò)多巴胺（dopamine，DA）在弱堿性環(huán)境中自發(fā)氧化聚合而獲得。PDA 具有兒茶酚和氨基官能團(tuán)，因而具有出色的黏附性、抗氧化性、金屬配位性和親水性[6]。它可以牢固地附著在任何材料的表面，因此，PDA 常被用作中間層，與抗菌劑或親水性聚合物形成復(fù)合涂層[7]。兩性離子聚合物[8] 是一種呈電中性的高分子材料，在其同一單體的側(cè)鏈上同時(shí)含有正負(fù)電荷[9]，通常分為聚甜菜堿和聚電解質(zhì)兩大類(lèi)[10]， 如聚甲基丙烯酸磺基甜菜堿（ polysulfobetaine methacrylate， PSBMA） 、聚甲基丙烯酸羧基甜菜堿和聚2-甲基丙烯-酰氧乙基磷酸膽堿。由于兩性離子聚合物具有優(yōu)異的親水性、不污性和生物相容性，已被廣泛用于各種醫(yī)療器械的表面改性。

沸石咪唑酸框架-8[11]（ zeolitic imidazolateframework-8， ZIF-8） 是一種典型的金屬有機(jī)框架（ metal-organic framework， MOF）材料。Zn2+能刺激成骨基因的表達(dá)，提高堿性磷酸酶的活性，從而促進(jìn)骨細(xì)胞的分化。此外，炎癥部位的生理環(huán)境呈酸性，而ZIF-8 在酸性環(huán)境中可降解，從而釋放Zn2+。Zn2+能穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），干擾細(xì)菌的生理功能，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，因此具有良好的抗菌能力[12]。ZIF-8 具有高孔隙率、高比表面積和pH 響應(yīng)的特性，使其也可用作藥物載體[13]。

本研究采用陽(yáng)極氧化法制備了TN 膜層，然后在TN 表面逐步接枝PDA 和PSBMA，最后采用一步水熱法使環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）@ZIF-8 原位生長(zhǎng)在TN 表面，獲得CIP@ZIF-8/PSBMA-TN（簡(jiǎn)寫(xiě)為CZPT）涂層。測(cè)試并討論了CZPT 涂層的表面形貌、成分、耐腐蝕性和親水性，并采用平板計(jì)數(shù)法評(píng)估涂層的抗菌性能。

1 材料和方法

1.1 涂層的制備

圖1 為涂層制備示意圖。將Ti6Al4V 板切割成尺寸為10 mm× 10 mm × 3 mm 的片材，用400#、800#、1000#、1500#和2000#砂紙打磨，依次在丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水中超聲清洗30 min 后烘干。烘干后的樣品在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% 的氟化銨+含體積分?jǐn)?shù)5.0% 的去離子水+乙二醇溶液組成的電解液中進(jìn)行陽(yáng)極氧化處理，然后在60 V 恒定電壓下室溫氧化1 h，結(jié)束后用去離子水清洗并烘干。最后，對(duì)樣品進(jìn)行溫度為550 ℃，保溫2 h 的退火處理。

PSBMA 采用高溫引發(fā)自由基聚合法制備。將甲基丙烯酸磺基甜菜堿（ sulfobetaine methacrylate，SBMA）（100 mg/mL）、過(guò)硫酸鉀（100 mg/mL）和亞硫酸氫鈉（1 mg/mL）溶解在超純水中，振蕩混合均勻后于65 ℃ 水浴5 h，進(jìn)行聚合反應(yīng)。降聚合反應(yīng)結(jié)束的溶液分裝在透析袋中，在超純水中透析72 h，以去除過(guò)硫酸鉀、亞硫酸氫鈉、殘留的SBMA 單體和低聚物。透析過(guò)程中，每隔12 h 更換1 次超純水。透析后，將上清液轉(zhuǎn)移到?45 ℃ 的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥72 h，得到PSBMA 粉末。

將2 mg DA 溶于10 mL 的Tris-HCl 緩沖液（pH 為8.5）中。TN 浸泡在DA 溶液中24 h 后在其表面沉積一層PDA 涂層。 取2、4、8 mg/mL PSBMA粉末溶于超純水中。然后將帶PDA 涂層的樣品放入PSBMA 溶液中浸泡24 h， 在其表面沉積一層PSBMA 涂層。

將0.11 g 六水合硝酸鋅和0.02 g CIP 加入20 mL去離子水中，得到的溶液記為A 液。再將2.27 g 2-甲基咪唑溶于20 mL 去離子水中，得到的溶液記為B 液。在攪拌下將B 液倒入A 液中。攪拌20 min后降混合溶液轉(zhuǎn)移到水熱反應(yīng)釜中并放入樣品。在37 °C 下保溫1 h 后取出，用去離子水沖洗，在37 ℃ 烘箱中干燥24 h，得到CZPT 涂層。水熱反應(yīng)后，將反應(yīng)釜中的溶液以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，用去離子水洗滌3 次，并在37 ℃ 的烘箱中干燥， 得到CIP@ZIF-8 粉末。ZIF-8 涂層采用和ZIF-8 粉末相同的方法制備。

各涂層的全稱(chēng)、主要組分和縮寫(xiě)見(jiàn)表1。

1.2 涂層的表征

采用X 射線(xiàn)衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）分析涂層的成分，傅里葉變換紅外光譜儀（Fouriertransform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）分析涂層中的官能團(tuán)，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS）分析涂層的表面形態(tài)和元素分布。

1.3 Zn2+和 CIP 釋放速率表征

將樣品浸入5 mL 磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebuffered saline ， PBS）中 1、2、4、8、12、24、48、72、96、120 h。用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（inductivelycoupled plasma optical emission spectrometer， ICP）測(cè)量Zn2+的釋放量。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（ ultraviolet-visible spectrophotometer， UV-Vis） 測(cè)定CIP 的釋放量。

1.4 耐腐蝕性表征

使用電化學(xué)工作站（CHI600E，上海辰華儀器有限公司）對(duì)樣品進(jìn)行耐腐蝕性測(cè)試。采用三電極體系，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片為輔助電極，樣品為工作電極。pH 為 7.4 的模擬體液（simulated bodyfluid，SBF）作為電解質(zhì)，測(cè)試溫度保持在37 ℃，樣品的工作面積為1 cm2，掃描速度為0.01 V/s。利用由Tafel 曲線(xiàn)得到的自腐蝕電流密度來(lái)評(píng)價(jià)樣品的耐腐蝕性。

1.5 抗菌檢測(cè)

采用平板計(jì)數(shù)法評(píng)估涂層的抗菌性能，采用的菌種為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。用液體培養(yǎng)基將菌種稀釋成體積濃度為 1×106 CFU/μL 的菌液（CFU 為colony-forming unit 的簡(jiǎn)寫(xiě)，是菌落形成單位）。然后在樣品表面滴加100 μL 菌液，對(duì)照組不滴加菌液。每個(gè)樣品表面覆蓋一層薄膜并輕輕按壓，最后放入37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結(jié)束后，用900 μL 滅菌PBS 沖洗；將沖洗物用滅菌PBS 連續(xù)稀釋10 倍，然后取100 μL 稀釋液均勻涂抹在固體培養(yǎng)基上，接著置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果和討論

2.1 涂層的物相分析

不同涂層的XRD 結(jié)果如圖2（a）所示。銳鈦礦TiO2 特征峰的出現(xiàn)證實(shí)了樣品在550 °C 煅燒2 h后成功生成了銳鈦礦相[14]；同時(shí)，觀察到了ZIF-8的特征峰（在 5°至20°處），與ZIF-8 的標(biāo)準(zhǔn)卡片的特征峰一致，表明成功合成了ZIF-8。圖2（b）結(jié)果表明，在ZIF-8 中引入 CIP 不會(huì)破壞ZIF-8 的晶體結(jié)構(gòu)。

圖3（ a） 為PSBMA 的FT-IR 譜圖。1 718 cm?1和1 483 cm?1 處的峰值分別對(duì)應(yīng)于O― C＝ O 和N―C 的伸縮振動(dòng)峰。此外，S―O 的反伸縮振動(dòng)峰和伸展振動(dòng)峰分別位于1 165 cm?1 和1 037 cm?1處。這些峰與SBMA 單體的特征峰一致， 表明PSBMA 制備成功[15]。

圖3（ b） 顯示了ZIF-8、CIP、CIP@ZIF-8 的FTIR譜圖。在ZIF-8 的FT-IR 譜圖中，3 422 cm?1 處的峰表示羥基（―OH）的伸縮振動(dòng)。3 136、2 926 cm?1處的峰表示咪唑的C―H 伸縮振動(dòng)。1 542 cm?1 處的吸收峰歸因于咪唑環(huán)中C＝N 的彎曲振動(dòng)。此外，600～1 500 cm?1 處的吸附峰與咪唑環(huán)的伸縮振動(dòng)相對(duì)應(yīng)。在422 cm?1 處檢測(cè)到Zn―N 的伸縮振動(dòng)峰。在CIP 的FT-IR 譜圖中， C― H（ 芳香族） 、C―N、C―C、C＝O、C―F 的伸縮振動(dòng)峰分別對(duì)應(yīng)于3 044、1 708、1 449、1 375、1 023 cm?1 處。在3 441 cm?1處檢測(cè)到―OH 的伸縮振動(dòng)峰。在1 624 cm?1 處檢測(cè)到C＝O 的伸縮振動(dòng)峰。在CIP@ZIF-8 的光譜中，1 624 cm?1 處的峰與C＝O 伸縮振動(dòng)有關(guān)， CIP 中（ ―COOH） 的不對(duì)稱(chēng)峰和對(duì)稱(chēng)峰分別對(duì)應(yīng)于1 694、1 375 cm?1 處。（―COOH）從1 708 cm?1 處移動(dòng)到 1 694 cm?1 處可能是CIP 與ZIF-8 相互作用的結(jié)果[16]。根據(jù)CIP@ZIF-8 的FT-IR 譜圖， 可推斷CIP 藥物成功負(fù)載到ZIF-8 中。

如圖4（a）、（b）所示，TN 的平均直徑為110 nm，TN 涂層的厚度約為3 μm。如圖4（c）所示，TN 涂層上有許多納米顆粒，是DA 在堿性環(huán)境中自發(fā)氧化聚合生成的。圖4（ d） 為接枝PSBMA 后的TN表面SEM 圖。由圖4（d）可以明顯看出TN 的部分孔被覆蓋，孔隙率下降。由圖4（ e） ， CZPT 表面的SEM 圖， 可以看出均勻的ZIF-8 晶粒生長(zhǎng)在PTN表面。圖4（f）為ZIF-8 的SEM 圖。合成的ZIF-8 呈現(xiàn)正方體結(jié)構(gòu)，平均尺寸為690 nm。

圖5 為接枝不同濃度PSBMA 后的樣品表面SEM 圖。如圖5（a）、（b）所示，接枝聚合物后，樣品部分表面沉積了一層涂層。從圖5（c）、（d）可以看出，當(dāng)聚合物濃度超過(guò)2 mg/mL 后，TN 表面會(huì)沉積一層加厚致密的PSBMA 層，導(dǎo)致材料孔隙率下降，比表面積降低。此外，聚合物濃度增加會(huì)使聚合物容易脫落，并導(dǎo)致PSBMA 納米顆粒聚集。因此，為了獲得較佳的植入特性，必須控制聚合物的濃度。通過(guò)避免過(guò)度聚合，可以確保材料保持足夠的孔隙率、更高的表面體積比以及涂層的穩(wěn)定性[17]。

此外，還利用EDS 對(duì)圖4（e） 表面（CZPT 涂層）的元素成分進(jìn)行了研究，結(jié)果如表2 所示。在CZPT表面檢測(cè)到了S 元素，表明PSBMA 成功地接枝到了CZPT 表面。Zn 的檢測(cè)證實(shí)了ZIF-8 的成功合成。F 元素的存在證明了藥物被成功負(fù)載。

圖6 為不同涂層與水的接觸角。結(jié)果顯示，Ti6Al4V、TN、PT 和ZPT 與水的接觸角分別為71.50°、25.00°、7.12° 和 14.20°。陽(yáng)極氧化后，樣品與水的接觸角顯著下降。PT 與水的接觸角為7.12°，呈超親水性。這是因?yàn)閮尚噪x子聚合物兩側(cè)同時(shí)具有正負(fù)電荷，靜電誘導(dǎo)水合作用可以與水分子強(qiáng)結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的水合層。ZPT 與水的接觸角為14.20°，略大于PT 與水的接觸角，這是因?yàn)閆IF-8 結(jié)構(gòu)中有疏水官能團(tuán)。但是相比于基體，材料的親水性得到了極大地提升 [18]。

2.2 Zn2+和CIP 釋放

Zn2+和CIP 的釋放速率曲線(xiàn)如圖7 所示。Zn2+和CIP 的釋放速率動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)：隨著時(shí)間的推移，釋放速率均逐漸下降。

與pH 為5.0 的酸性環(huán)境相比， 兩者在pH 為7.4 的弱堿性環(huán)境中的釋放速率有較大的提升。這表明周?chē)h(huán)境的pH 對(duì)Zn2+和CIP 的釋放行為起著至關(guān)重要的作用。

在植入初期，TN 中的藥物會(huì)迅速釋放，之后釋放速率則與ZIF-8 有關(guān)。在人體環(huán)境中ZIF-8 會(huì)發(fā)生降解，從而達(dá)到藥物緩釋的目的。在酸性條件下，藥物釋放速率加快。這可以用ZIF-8 的酸堿反應(yīng)性來(lái)解釋[19]，在酸性條件下，ZIF-8 的穩(wěn)定性下降，出現(xiàn)一定程度的結(jié)構(gòu)坍塌和降解速率加快，從而導(dǎo)致藥物釋放速率增加。在弱堿性環(huán)境中，ZIF-8 表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，藥物通過(guò)ZIF-8 的孔隙緩慢向外擴(kuò)散。

2.3 耐腐蝕性

耐腐蝕性是評(píng)估植入物性能的關(guān)鍵因素之一[20]。圖8 為T(mén)i6Al4V、TN 涂層和ZPT 涂層浸泡在SBF 中的極化曲線(xiàn)。表3 中的電化學(xué)參數(shù)是通過(guò)分析極化曲線(xiàn)得到的。與Ti6Al4V 相比，TN 涂層和ZPT 涂層的自腐蝕電流密度分別為4.85×10?7、2.62×10?7 A/cm2，均低于Ti6Al4V 的（3.03×10?6 A/cm2）。同時(shí)，ZPT 涂層的自腐蝕電勢(shì)也向正軸方向移動(dòng)。對(duì)電化學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析揭示出ZPT 涂層具有更優(yōu)越的耐腐蝕性。

圖9 為不同樣品在SBF 中浸泡2 h 后的Nyquist圖。與Ti6Al4V 相比，TN 涂層和ZPT 涂層實(shí)際上具有更大的電容回路，表明具有更好的防腐蝕能力。特別是ZPT 具有最大的電容回路。阻抗數(shù)據(jù)使用ZSimpWin 軟件進(jìn)行分析和擬合，采用等效電路模型（見(jiàn)圖10） 。獲得的模擬EIS 結(jié)果總結(jié)在表4中。表4 中： Rs 為溶液電阻； Rc 和Cc 分別為外層ZIF-8 涂層的電阻和電容；Rct 和Cct 分別為內(nèi)層氧化層的電阻和電容；n 和m 表示偏離理想電容的程度，n 對(duì)應(yīng)外層ZIF-8 涂層的電容，m 對(duì)應(yīng)內(nèi)層氧化層的電容。TN 涂層可以防止溶液和基體的直接接觸，另一方面，ZIF-8 的顆粒填充在納米管內(nèi)，導(dǎo)致腐蝕離子擴(kuò)散的復(fù)雜性增加。綜上所述，ZPT 涂層對(duì)鈦合金具有有效的保護(hù)作用，這是由于ZPT 涂層減小了基體與溶液的接觸面積。

2.4 體外抗菌性能檢測(cè)

抗菌性也是評(píng)價(jià)骨植入物生物特性的一個(gè)重要指標(biāo)。采用平板計(jì)數(shù)法評(píng)估涂層的抗菌性能[21]。與Ti6Al4V 相比，PT 涂層對(duì)大腸桿菌幾乎沒(méi)有抑制效果，PZT 涂層和CZPT 涂層表現(xiàn)出明顯的抗菌活性， 其中CZPT 涂層的抗菌活性最強(qiáng)， 如圖11 所示。對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌研究也得到了類(lèi)似的結(jié)果，表明CZPT 涂層可以抑制兩種細(xì)菌的增殖。與Ti6Al4V 相比，CZPT 涂層對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別提高到65% 和96%，結(jié)果如圖12 所示。

由于金屬離子與配體之間的結(jié)合力較弱，導(dǎo)致ZIF-8 緩慢降解，釋放出Zn2+，部分Zn2+聚集在細(xì)菌表面，提高細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)菌內(nèi)細(xì)胞質(zhì)外流，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡， 從而達(dá)到抗菌的目的[22]。部分Zn2+會(huì)穿過(guò)細(xì)胞膜， 聚集在細(xì)菌內(nèi)。細(xì)菌內(nèi)的Zn2+會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生ROS，ROS 的增多會(huì)干擾細(xì)菌生理功能，使細(xì)菌凋亡。此外，CIP 能使細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成紊亂，導(dǎo)致細(xì)菌的繁殖速度下降。研究[23] 表明，堿性環(huán)境可以干擾細(xì)菌三磷酸腺苷的合成，從而抑制細(xì)菌繁殖，而ZIF-8 降解會(huì)釋放出OH?，形成弱堿性環(huán)境。總之， CZPT 的抗菌活性來(lái)自Zn2+、CIP 和OH?的共同作用。

3 結(jié) 論

通過(guò)將PDA 作為中間層， 在TN 表面接枝PSMBA， 再通過(guò)水熱法在鈦表面一步制備負(fù)載CIP 的ZIF-8 樣品，制備出了親水抗菌涂層。

（1） PDA 和PSBM 的存在可賦予樣品表面良好的親水性，相比Ti6Al4V 與水的接觸角，CZPT 涂層與水的接觸角降低到了14.20°，有利于減少蛋白質(zhì)和細(xì)菌的粘附，提高材料的生物活性。

（2） CZPT 涂層對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別達(dá)到65% 和96%， 是Zn2+、OH?和CIP 共同作用的結(jié)果。