飼用燕麥TLP基因家族鑒定及干旱脅迫下表達模式分析

Abstract：Tubby-like proteins （TLP） are a significant group of proteins discovered acrossanimal and plant species that participate in various biological processes. These proteins play a crucial role in plant growth，development，and the responses to abiotic stresses. This study employed bioinformatics methods to identify 32 TLP family genes from the hexaploid oat （Auena satiua） genome. We conducted an analysis of their physicochemical properties，gene structures， phylogenetic evolution， and expression patterns across diferent tissues under drought stress. The results demonstrated that the amino acid count of the A s T L P genes ranged from 238 to 543 amino acids. The molecular weights of these proteins were found to be between 26.99 and ，and their isoelectric points ranged from 9.OO to 9.58. These genes unevenly distributed across 17 chromosomes and possessed a large number of conserved motifs.The functional elements primarily included those related to internal hormone responses and external environmental reactions.Expresion analysis indicated significant diferences in the expresion levels of nine AsTLP members between roots and leaves of oats.Specifically，four members showed the increased expression in alltissues under drought stress，suggesting a potential significant role in the oat’s response to drought stress. These findings provided a valuable reference for further studies on the oat TLP family and their responses to drought stress. Key words：Avena satiua； Tubby-like proteins；Bioinformatics；Drought stress；Gene expression

在全球氣候變化的背景下，作物面臨的非生物脅迫如高溫、干旱和鹽堿等問題日益嚴峻，這些因素不僅影響作物的生長發育，還可能導致產量的大幅下降[1]。因此，增強作物在逆境下的適應性，保障全球農業生產的穩定與食物安全，成為亟需解決的問題[2]。研究表明Tubby樣蛋白家族（Tubby-likeprotein，TLP）在植物對抗逆境脅迫中扮演著關鍵角色[3]，TLP最初是在小鼠（Musmusculus）基因組中發現4，隨后在多種動植物基因組中均有發現。這類蛋白的一個顯著特征是其C末端具有約270個氨基酸組成的Tubby結構域，該結構域在不同物種中保持高度保守，表明其在多細胞生物中承擔著基本的生物學功能[5-6]。研究顯示，TLP蛋白對植物和動物的生長發育至關重要，其家族成員的缺失可能導致動物的表型特征改變，甚至引發嚴重疾病[7-8]。

隨著對 T L P 基因研究的深入，其在植物中的生物學功能研究也日益增多9。在模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）中已鑒定出該家族的11個成員，其中AtTLP3和 A t T L P 9 可以通過調控脫落酸信號通路，進而影響種子在干旱和鹽脅迫條件下的萌發和幼苗早期發育[10]。在水稻（Oryza satiua）中，OsTLP2蛋白能與由病原體誘導的 O s W R K Y 1 3 轉錄因子的啟動子區域的PRE4順式元件結合，調節水稻對細菌和真菌的抗性[1]。在蘋果（Malusdomes-tica）中，多個 T L P 基因在非生物脅迫下的表達上調，表明這些基因在應對環境壓力中發揮重要作用[12]此外，在鷹嘴豆（Cicerarietinum）中，CaTLP1基因的表達增強了植物對干旱脅迫的抗性[13]

燕麥（Avenasatiua）作為重要的谷類作物，具備耐寒旱、耐鹽堿、營養豐富及飼草產量高的顯著特性，是糧飼兼用的關鍵作物之一[14]。在畜牧業不斷發展的背景下，燕麥逐漸成為我國牛羊養殖中重要的粗飼料來源，尤其是在我國的高寒牧區，燕麥更是牦牛等牲畜冬春補飼的主要飼草之一[15]。近年來，栽培皮、裸燕麥基因組數據的相繼公布有助于深入理解其抗逆性遺傳機制，并推動了燕麥分子輔助育種技術的發展[16-17]。本研究利用生物信息學工具對燕麥中的TLP基因家族進行了全面鑒定和表征。通過對系統發育關系、基因結構和染色體分布的深入分析，以及對干旱脅迫條件下不同組織的基因動態表達情況進行評估，揭示了A s T L P 基因的功能動態。這為進一步理解燕麥在應激反應和發育過程中分子機制提供了依據，同時為飼用燕麥或其他飼草的抗旱品種創制提供了基因素材。

1 材料與方法

1.1燕麥TLP家族成員鑒定與理化性質

為識別燕麥基因組中的TLP家族成員（AsTLP），首先從TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）中檢索擬南芥的TLP基因家族的參考序列[18]，并從GrainGenes數據庫（https：//wheat.pw.usda.gov/GG3/）中下載栽培燕麥OT3098_v2的基因組和gff文件[19]。使用TBtools軟件對這些參考序列進行BLAST比對[20]，并從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載TLP結構域（PFO1167）的HMM模型[21]，通過BLASTp（ 0.001）搜索分離燕麥中的所有可能同源物。隨后，利用TBtools篩選非冗余候選基因，并在UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）中進行比對驗證[22]，最終得到AsTLP基因成員。將鑒定的AsTLP基因序列提交至ExPASY（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析網站[23]，預測其分子量（Molecularweight，MW）、氨基酸數目（Aminoacid，AA）和理論等電點（Theoreticalisoelectricpoint，pI）。通過WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線網站進行亞細胞定位分析[24]。

1.2AsTLP結構與染色體定位

使用MEME在線網站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）鑒定了 A s T L P 基因氨基酸序列中的保守基序（motif）[25]，參數設置為motif數量10個，其他為默認參數，同時在MEGA-X中采用最大似然法（Maximumlikelihood，ML）構建物種內系統發育樹[26]。從GFF3文件中提取 A s T L P 基因外顯子和內含子位置，并在基因組中提取全部基因的起始位點和終止位點，使用TBtools對其進行了可視化。

1.3AsTLP系統進化與共線性分析

在GrainGenes數據庫下載燕麥屬二倍體物種Avena longiglumis（ 和四倍體物種Avenainsularis（ ，CCDD）基因組數據并分別提取TLP基因成員，結合擬南芥和水稻TLP序列信息，在MEGA-X中采用臨接法（Neighbor-Joining，NJ）構建物種間系統發育樹。為進一步理解 T L P 基因在禾本科植物中的進化關系，對栽培燕麥、二倍體燕麥（A.longiglumis）、四倍體燕麥（A.insularis）、水稻和二穗短柄草（Brachypodiumdis-tachyon）基因組進行比對，并在TBtools中對多物種基因對共線性進行可視化分析。

1.4AsTLPs的啟動子區順式作用元件預測

在PlantCARE （http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站中[27]，基于AsTLPs基因上游20OObp的基因序列進行了啟動子順式作用元件預測，整理和簡化后的預測結果用TBtools軟件進行可視化。

1.5植物材料處理與表達模式分析

本研究以耐旱型燕麥資源‘MortgageLifter'為試驗材料，材料來源于青海省畜牧獸醫科學院，并收錄于中國作物種質資源信息網（www.cgris.net，庫編號I1F02715）。挑選飽滿且大小均一的種子，在培養盒中發芽7天后轉移到標準Hoagland溶液水培系統中，控制生長條件為 晝夜循環，相對濕度6 5 % ～ 7 5 % ，光照強度 。干旱脅迫處理通過添加 1 5 % PEG-600O的Hoagland溶液進行培養，每個處理設3個重復，在脅迫開始（0小時）和脅迫后的6，12和24小時，分別采集正常和干旱條件下的幼苗葉片與根系樣品，液氮冷凍后立即保存于 。樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序，以比較不同脅迫時間及不同部位間 A s T L P s 的相對表達量（FragmentsPerkilobaseoftranscriptPerMillionmappedreads，FPKM差異。

2 結果與分析

2.1AsTLP家族成員鑒定與基本理化性質分析

基于Blast和HMMER序列比對，結合Tubby結構域分析，最終獲得了32個非冗余燕麥 A s T L P 成員，根據其在染色體上的分布位置，依次將其命名為 。如表1所示，AsTLPs的氨基酸數目為 個；蛋白的分子質量為 2 6 . 9 9 ～ ；所有AsTLPs的理論等電點范圍在 9 ～ 9.58，均大于7.0，說明這些成員富含堿性氨基酸；亞細胞定位預測結果顯示AsTLPs均位于細胞核中。

2.2AsTLP家族成員結構與染色體定位

A s T L P s 在染色體上呈現不均勻分布（圖1），除1C，2A，2C和2D染色體外，其余17條染色體上均有分布。其中1A和6A染色體上分布最多，均包含4個成員，其次是4C和5D上，分別包含3個成員。為進一步探索 A s T L P 基因的進化關系和發掘其潛在功能，對32個AsTLPs構建ML進化樹，并分析其保守基序和基因結構（圖2）。由圖2可知，所有AsTLP成員根據其蛋白質序列大致可以分為4組（Group1＼～4），各組中 A s T L P 成員的結構特征與ML系統發育樹聚類結果高度一致。MEME檢索得到10個保守基序中，除AsTLP26以外，僅有2個保守基序呈現出一定的特異性分布。其中motiflO僅分布于Group1和Group2中，Group4中大部分成員不包含motif7，而其余8個保守motif在所有成員中均有分布。此外， A s T L P 家族的成員的CDS（外顯子）和UTR（非編碼區）結構較為復雜（圖2），大部分成員存在多個間斷的CDS區域和UTR區域，如Group1和Group4中所有成員擁有的外顯子數量一致，均為4個，Group2和Group3成員擁有4到5個外顯子。上述結果預示了 A s T L P 成員的基因結構在進化過程中的保守性。

2.3多物種TLP家族成員系統進化與共線性分析

基于4個單子葉物種二倍體燕麥、四倍體燕麥、六倍體燕麥（A.satiua）和水稻以及1個雙子葉物種擬南芥之間TLP的NJ系統發育樹（圖3），分析了TLP在物種間的進化關系。圖3顯示TLP家族成員大致可分為6個亞組，擬南芥TLP成員在各亞組中的進化樹分支相對獨立，而單子葉物種的TLP成員間的聚類關系更加密切，這表明TLP家族在單子葉植物進化歷史中的保守性。

進一步分析單子葉植物中TLP家族成員的共線性，選擇禾本科二倍體燕麥、四倍體燕麥、水稻和二穗短柄草與目標物種進行比對（圖4）。作為栽培燕麥（AACCDD）的祖先種，二倍體燕麥（AA）和四倍體燕麥（CCDD）的TLP成員具有高度的共線性，且共線網絡隨著倍性的增加而增加，尤其在六倍體燕麥和四倍體燕麥間，2C與2D染色體上均沒有TLP成員。此外，二穗短柄草和水稻中每個TLP成員均能關聯到2～5個AsTLPs基因，這些結果進一步驗證了TLP基因在單子葉植物中的高度保守性。

2.4 順式作用元件分析

順式元件對于植物響應環境變化和調節生長發育至關重要。在所有 A s T L P s 上游 序列的順式作用元件中，共檢測到920個功能元件，可劃分為11種類型（圖5）。其中與特定的激素反應相關元件包括脫落酸（Abscisicacid）、生長素（Auxin）赤霉素（Gibberellin）、水楊酸（Salicylicacid）和茉莉酸甲酯（MeJA）響應，這些激素在植物的生長發育和應對環境壓力中發揮關鍵作用。與環境應激響應相關元件包括低溫（Lowtemperature）低氧（Anaerobic）光（Light）和干旱（Drought）響應，這些元件在植物細胞中識別特定的應激信號，并通過調節相關基因的表達來幫助植物適應不利條件。此外，還包括發育特異性表達的分生組織表達（Meristemexpression）和參與代謝調控的醇溶蛋白響應（Zeinmetabolismregulation）。這1l類元件覆蓋了植物對各種內部激素和外部環境因素的反應方式，以及在特定生長階段和組織中的表達調控，反映了A s T L P s 參與了多種生物學過程

2.5AsTLP在干旱脅迫下的表達模式分析

基于鑒定到的 A s T L P s 基因ID，在轉錄組結果中提取不同脅迫時間及不同部位間 A s T L P s 的相對表達量，并繪制對應熱圖（圖6）。由圖可知，部分 A s T L P s 成員在不同組織中具有明顯的表達差異，如 A s T L P 9 ， A s T L P 1 2 ， A s T L P 1 7 ， A s T L P 2 4 ，AsTLP28和 A s T L P 2 9 在燕麥根系的表達量顯著高于葉片（ ，而AsTLP23（ 、AsTLP26（ 和 在燕麥葉片組織中的表達量顯著高于根系。

基于干旱脅迫的轉錄組數據，進一步分析發現4個 A s T L P s 在干旱脅迫下的表達量上升（圖7）。其中 A s T L P 2 與 A s T L P 4 的表達模式相似，即不同處理時間下 A s T L P 2 與 A s T L P 4 在受脅迫葉片中的表達量顯著高于正常葉片，而僅在 時在受脅迫根系中表達量顯著高于正常根系（ ，且AsTLP4在受脅迫葉片中的表達量隨著脅迫時間的延長呈現上升趨勢。而在不同組織和不同處理時間下，AsTLP14與 A s T L P 3 2 的表達量均在受脅迫材料中顯著高于正常材料（ 。因此，A s T L P 2 ， A s T L P 4 ， A s T L P 1 4 和AsTLP32可能是燕麥響應干旱脅迫的潛在基因，其具體功能有待深入研究。

處理 正常葉片 干旱葉片 正常根系 干旱根系 Treatments Normal leaves Leavesunderdrought stress Normal roots Rootsunderdroughtstress at 0'0 a a aa a aT a bt b bT b b s s 1 00 00 ） aT a at b Jii a at bT b bb bt bT C 1C C C CT 1 1 5 1 00 0 6h 12h 24h 6h 12h 24h 處理時間Time 處理時間Time

Note：Lowercase letters indicate significantdiferences between organizations at theO.O5 level

3討論

燕麥作為全球農業系統中重要的糧食及飼料作物，因其優良的營養價值與廣泛的氣候適應性而備受重視[28]。因此，探索燕麥在干旱脅迫下的分子響應機制具有重要的科學與實用價值。TLP是一類在動植物中廣泛參與多種生物學過程的蛋白質，盡管這一蛋白家族的成員數量較少，它們卻是植物應對非生物脅迫反應的關鍵組成部分[9-12]。Zeng等人在多個物種完成TLP基因家族的鑒定[29]，包括小麥（Triticumaestivum）大麥（Hordeum vulgare）高粱（Sorghumbicolor）、水稻、玉米（Zeamays）等，其家族成員數量從9到35個不等，其TLP蛋白的分子質量通常在33.1至 之間，理論pI在9.01至10.15之間。本研究從六倍體栽培燕麥基因組中鑒定出32個 A s T L P s ，數量與六倍體小麥中鑒定到的35個成員相當[29]。此外，本研究發現燕麥的AsTLP蛋白的分子質量范圍為26.99至60.69 ，理論等電點（pI）為9至9.58，這與大部分植物TLP蛋白家族成員均屬于堿性蛋白的情況一致，說明 T L P 在進化上的保守性。基因結構分析顯示，僅motif7和motif10在不同組間存在明顯差異，推測這兩個motif是影響 A s T L P 成員種內變異的主要因素。而至少有5個保守motif在所有 A s T L P s 中檢測到，這與Zeng等人在多物種TLP家族的對比研究結果一致[29]，且AsTLPs的內含子和外顯子數量與擬南芥中的TLP相似1°，這進一步證明了燕麥TLP在進化上具有高度保守性。

以往有關TLP的研究集中在植物發育和植物對環境脅迫的響應[29]，在各類非生物脅迫中，干旱是影響牧草質量和產量的主要因素之一[30]，此前的報道也已證實 T L P 在提高植物的抗旱性中的重要作用，例如在大豆中， G m T L P 8 的過表達能顯著提高大豆對干旱和鹽脅迫的耐受性[31]；蘋果MdTLP7基因可以提高植物對干旱的耐受性，而MdTLP7的定點誘變則降低了其耐旱性12；番茄中STLFP8可以通過改變表皮細胞大小并降低氣孔密度來調節葉片的蒸騰作用，進一步提高植物水分利用效率[32]。

啟動子是基因的轉錄和表達過程中的重要調控元件，本研究通過對AsTLP啟動子中順式作用元件的分析，發現AsTLP基因啟動子區包含的作用元件包含了大量的非生物脅迫響應元件，除了常規的光、低溫和干旱脅迫響應元件外，還擁有大量的萊莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、生長素等重要的響應元件。通過對4個可能調控燕麥干旱耐受性的基因（ A s T L P 2 ， A s T L P 4 ， A s T L P 1 4 和AsTLP32）研究發現，其啟動子區間內均擁有兩個及以上的干旱響應元件，此外，大量的非生物響應元件也暗示了A s T L P s 基因復雜的調控機制，可能廣泛地參與了燕麥的生長發育過程。通過對比AsTLPs在植株的根部和葉片中的表達量，發現共有9個 A s T L P s 在不同組織間表達呈現出特異性表達，其中6個表明A s T L P s 基因在燕麥中存在一定的功能分化，具備多樣的生物學功能。因此，后續通過針對不同的AsTLP成員在多種環境壓力下的表達模式進行探索，有望深入理解這些基因在燕麥適應環境壓力與植物生長發育過程中的調控機理。

4結論

本研究通過對六倍體燕麥全基因組中的TLP基因家族進行系統的鑒定，鑒定出了32個AsTLP成員，揭示了 A s T L P 基因在進化歷史中的高度保守性。此外，干旱脅迫下的表達模式分析發現其在不同組織和應對環境脅迫中的表達差異，例如葉片中AsTLP14與AsTLP32的表達量在干旱脅迫下顯著提高。這為進一步探索燕麥在逆境響應中的分子機制提供了理論基礎，并為燕麥這一重要的糧飼兼用作物的遺傳改良研究提供了方向。

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（責任編輯 閔芝智）