鈍葉草種質資源分子標記開發及遺傳多樣性研究

Abstract：To study the genetic diferences of Stenotaphrum helferi Munro ex Hock. F. from diferent geo graphical sources， . helferi accessions from diferent countries were used to analyze their genetic relationship by using PCR-based SRAP（Sequence related amplified polymorphism） molecular markers in this study. The results showed that 21 primer pairs from the original 1OO primer pairs were selected based on the polymor phism，clarity and reproducibility of the bands.A total of 161 bands were amplified by 21 primer pairs from 13 accessions with an average of 7 bands per primer pair，and 161 （ 1 0 0 . 0 0 % ）out of them were polymorphic. The genetic similarity co-effcient （GSC）among the 13 accessions ranged from O.4805 to 0.9286 with an average of O.6452. Cluster analysis conducted by the unweighted pair-group method with arithmetic average （UPGMA）separated the 13 accessions into 4 groups when the genetic similarity coefficient was 0.6930. Principal component analysis divided the 13 accesions into 5 groups.The results indicated that the genetic diversity of S. helferi accessions was rich，which laid a foundation forthe identification and evaluation of S.helferi accessions and molecular marker-assisted breeding.

Key words：Stenotaphrum helferi；SRAP ；Molecular makers；Genetic diversity

鈍葉草（Stenotaphrum helferi Munro ex Hock.F.）是禾本科鈍葉草屬的多年生草本植物，具有葡匐莖，蔓延性較強，主要分布在熱帶及亞熱帶地區，在中國主要生長于云南、廣西、廣東以及海南等地區1。由于其繁殖速度快、競爭能力強，具有較強的生命力，管理要求粗放，鈍葉草成為一種優良的暖季型草坪草[2-3]。鈍葉草耐水淹[4]、耐蔭[5]、耐旱[6]、耐踐踏、繁殖能力及再生能力強[4-6]，在公路護坡、公園及小區綠化等各種草坪中應用較為廣泛[7-9]

分子標記是檢測遺傳多樣性的強有力技術，該技術不受組織器官、環境及基因是否表達的限制，具有多態性高，遺傳穩定等優點，廣泛應用于植物的遺傳育種研究[10]。目前DNA分子標記已達幾十種，以分子雜交技術為基礎的標記，如限制片段長度多態性標記（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）[；基于PCR技術的標記，如隨機擴增多態性DNA 標 記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性標記（Amplified restric-tion fragment polymorphism，AFLP）、簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR）、簡單序列重復區間擴增標記（Inter-simple sequence repeat，ISSR）和特異性片段擴增區域（Sequencecharacterized amplifiedregions，SCAR）等[12-15]；基于DNA序列的標記，如轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）測序分析技術等；以DNA芯片技術為基礎的標記，如單核苷酸多態性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）等。分子標記技術在鈍葉草種質資源的的分類、遺傳多樣性評價、種質和品種的鑒定等方面1有應用，但應用相對較少。Kimball等[17]利用AFLP標記檢測美國南部各草場的鈍葉草品種‘Raleigh'的遺傳變異情況。相關序列擴增多態性標記（Sequence related amplifiedpolymorphism，SRAP）是Li等[18]于20O1年開發的。在不同研究領域應用的結果發現，SRAP分子標記具有引物設計簡單、通用性較高、操作較靈活、簡便、快速、可顯示大量的共顯性標記，易從序列中得到分離的條帶等優越性，是一種適合用于種質鑒定、遺傳多樣性研究以及分子標記輔助育種的分子標記[19-21]。但由于SRAP標記是對ORF進行擴增，因而對基因相對較少的著絲粒附近以及端粒的擴增會較少。目前，已在結縷草（Zoysia japonica Steud）以及假儉草［Eremochloa ophiuroides（Munro）Hack.]雜交后代真實性的鑒定22-23]、海雀稗（Paspalum uaginatum Sw.）及狗牙根[Cynodon dactylon（L.）Persoon][24-28]等種質資源親緣關系研究等方面發揮著重要作用。

因此，鑒于SRAP標記的具有通用性高，重復性好，擴增簡單等優良特性29，為了解不同地理來源的鈍葉草種質資源間的遺傳差異，本研究利用SRAP分子標記對鈍葉草種質進行遺傳多樣性分析，分析不同地理來源的鈍葉草種質資源的親緣關系，為鈍葉草種質資源的鑒定評價及分子標記輔助育種研究提供依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料選取2004—2014年從馬爾代夫、斯里蘭卡、哥斯達黎加、科特迪瓦、委內瑞拉、澳大利亞及中國海南等地采集的13份野生鈍葉草種質資源。種質來源如表1所示，包括馬爾代夫的1份，斯里蘭卡的1份，哥斯達黎加的3份，科特迪瓦的2份，委內瑞拉的1份，澳大利亞的1份，甘肅蘭州的2份，海南儋州的2份。

1. 2 試驗方法

1.2.1DNA的提取及質量檢測鈍葉草DNA的提取與產物質量檢測參考黃春瓊等[30]的方法進行。所提取的DNA經檢測后將濃度稀釋到 ，存放于一 冰箱中。

1.2.2SRAP-PCR分析引物序列參考Huang等[27的引物序列，選取3份地理來源較遠的鈍葉草種質（科特迪瓦的S08、澳大利亞的S11和海南儋州的S12）對100對SRAP引物進行檢測。從中篩選出多態性較高、重復性較好的引物，用于后續13份鈍葉草種質的遺傳多樣性分析。SRAP-PCR反應體系、擴增程序以及產物的檢測參考Huang等2的方法進行。

1.3 數據統計與分析

電泳檢測結果根據條帶的有無建立0-1矩陣。即相同引物，在電泳圖同一位置上有擴增條帶的讀

為“1”，反之則讀為“0”，建立0-1矩陣數據庫。并通過NTSYS2.10e進行聚類分析及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測與分析

所提取的電泳圖上在同一位置上有一條明亮條帶，且帶型整齊一致，無其他帶型（圖1）。DNA濃度、 及 測定結果如表2。由表2可知，DNA的濃度為 2 3 3 . 5 0 ～ 值為 值為 ，這一結果說明所提取的鈍葉草基因組DNA的濃度較高較純，符合后續試驗要求。

2.2 引物的篩選

引物篩選結果見表3，從表3可知，篩選出了21對可用于后續研究的引物，引物擴增片段范圍為50～1500bp。部分引物篩選的電泳圖見圖2，從圖2中可以看出，引物M3E10，M4E10，M5E10和M6E10分別在約 200 bp，800bp，900 bp及 處在3份鈍葉草種質中有差異條帶。

2.3擴增多態性分析

21對SRAP引物對13份鈍葉草種質的多態性檢測結果見表4。從表4可知，21對引物共檢測出161條條帶，且均是多態性條帶，平均每對引物能檢測到7條條帶，多態性百分率為 100 . 0 0 % 。擴增條帶數為 條，其中，擴增條帶數最多（10條）的引物有2對，分別是M10E2和M5E10；而擴增條帶數最少（4條）的引物有1對，為M6E10。圖3為引物M3E10對13份鈍葉草種質的電泳檢測圖。

Fig.2Amplification results of parts of primer pairs among 3S.helferi accessions 注：M表示100 bp DNA Ladder Marker；引物依次是M1E10，M2E10，M3E10，M4E10，M5E10，M6E10，M7E10和M8E10 Note：Mindicates0ObpALadderMarker；TeprmerpairsiorderareE10，2E103E10，M4E10，5E10，6E10，M7Ed1

2.4特征帶與特征種質鑒定

大部分鈍葉草種質可以通過一些特征條帶加以快速鑒別（表5）。例如當引物為M2E1分析時，來自委內瑞拉的S10在 處擁有特征條帶，從而可以將其從供試種質中快速鑒定出來。當引物為M10E1時，來自馬爾代夫的S03分別在50，400bp處擁有特征條帶。當引物為M2E2時，來自澳大利亞的S11在 處擁有特征條帶。而引物為M4E3時，來自委內瑞拉的S10在1000bp處擁有特征條帶。依照此方法分析，總結供試種質的特征條帶，總計19對引物組合在10份鈍葉草種質中共產生了32條特征條帶。說明所篩選的引物大部分能將供試鈍葉草種質區分開。從表5中明顯看出，來自委內瑞拉的S10在大部分引物中能擁有自己的特征條帶，能快速從供試種質中鑒定出。

2.5 遺傳相似性分析

13份鈍葉草種質的遺傳相似性系數矩陣如表6所示，從表6可知，13份鈍葉草種質間的遺傳相似性系數為 ，平均為0.6452。其中，來自科特迪瓦的S08和S09的遺傳相似性系數最大（0.9286），表明這2份種質間的遺傳距離較近；而來哥斯達黎加的S02和來自委內瑞拉的S10的遺傳相似性系數最小（0.4805），表明它們之間的遺傳距離較遠。

2.6 聚類分析

13份鈍葉草種質的聚類分析結果如圖4所示，從圖4中可以看出，13份鈍葉草種質在遺傳相似性系數為0.6930時可劃分為4個類群。第I類群包括2份種質，分別是來自哥斯達黎加的S01和來自海南瓊中的S04，它們之間的遺傳相似性系數為

0.8247。第Ⅱ類群包括6份種質，包括來自馬爾代夫的S03、斯里蘭卡的S06、科特迪瓦的S08和S09、哥斯達黎加的S07和澳大利亞的S11，它們之間的遺傳相似性系數為 ，平均為0.8030。在遺傳相似性系數為0.7510時，該類群可分為2個亞類，第a亞類包括S03、S06、S08和S09共4份種質，它們之間的遺傳相似性系數為 0 . 8 8 3 1 ～ 0.9286，平均為0.9080，其中S08和S09之間的遺傳距離最近聚在一起，它們之間的遺傳相似性系數為0.9286；第b亞類包括S07和S11，它們之間的遺傳相似性系數為0.8312。第Ⅲ類群包括3份種質，來自哥斯達黎加的S02、海南儋州的S12和海南瓊中的SO5種質。它們之間的遺傳相似性系數為 。第Ⅳ類群包括來自委內瑞拉的S10和海南儋州的S13種質，它們之間的遺傳相似性系數為0.7208。

2.7 主成分分析

基于遺傳相似性系數，利用NTSYS軟件對13份鈍葉草種質進行主成分分析，結果如圖5所示，從圖5可知，第一主成分、第二主成分和第三主成分值分別為 6 8 . 3 5 % ， 7 . 7 4 % 和 6 . 0 7 % 。主成分分析圖中位置靠近的材料表示它們之間親緣關系較近，反之則表示親緣關系較遠。將主成分分析圖中位置較近的鈍葉草種質劃歸為1個類群，共得到5個主要類群。第一類群包括4份種質，分別是來自馬爾代夫的S03、斯里蘭卡的S06、科特迪瓦的S08和S09。第二類群包括2份種質，分別是來自哥斯達黎加的S07和澳大利亞的S11。第3類群包括3份種質，分別是來自來自哥斯達黎加的S01、海南瓊中的S04及S05。第四類群包括2份種質，分別是來自哥斯達黎加的S02及海南儋州的S12。第五類群包括2份種質，分別是來自委內瑞拉的S10和來自海南儋州的S13。

Kimball等[17]利用AFLP標記對49份鈍葉草種質資源進行研究，共擴增出1166條條帶，其中多態性條帶為143條，多態性比率 9 % 。以上研究結果發現鈍葉草AFLP標記的多態性比率低于本研究結果，這可能是由于所選標記方法和研究對象不同所致。張延輝等[35]利用SRAP標記對106份狗牙根［Cynodondactylon（L.）Persoon|遺傳多樣性分析發現多態性位點百分率為 9 2 . 5 % ，種質間的遺傳相似系數為 ；周瑩潔等[36]利用SRAP標記對31份野牛草[Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.]進行遺傳多態性分析中，多態性位點百分率為8 6 . 8 6 % ，遺傳相似系數為 。羅瑛[9]利用SRAP標記對84份鈍葉草種質資源遺傳多樣性進行研究，共擴增出273條條帶，其中多態性條為267條，多態性條帶的比率為 9 7 . 8 0 % ，遺傳相似系數為 。羅瑛9利用ISSR標記對84份鈍葉草種質資源遺傳多樣性進行研究，共擴增出527條條帶，且均是多態性條帶，多態性比率為 100 % ，相似系數范圍值為 。與其他研究相比，本研究中的鈍葉草多態性比率（ 100 % 最高，與羅瑛9利用ISSR對鈍葉草種質資源遺傳多樣性的研究一致。本研究的遺傳相似性系數范圍為 0 . 4 8 0 5 ～ 0.9286，與其他鈍葉草種質資源遺傳多樣性研究相比，遺傳相似性系數范圍最大。這一研究現象可能與研究種質的差異有關。本研究使用的材料來自7個不同國家和地區不同生境的鈍葉草種質，種質來源廣泛，種質間地理差異明顯，所以表現出較高的遺傳多樣性。

3討論

早期鈍葉草種質資源遺傳多樣性主要集中在植物學性狀如匍匐莖長度和柱頭顏色等[31-32]。葉繡珍等[33]對偏序鈍葉草［Stenotaphrumsecundatum（Walter）Kuntze]與地毯草［Axonopuscompressus（Sw.）Beauv.]的形態學進行研究，結果表明偏序鈍葉草分枝數量及單株覆蓋面積比地毯草強，葉片較地毯草的長且厚；楊虎彪等34利用石蠟制片技術鑒定出鈍葉草為C4植物。分子標記技術在鈍葉草種質資源的分類、遺傳多樣性評價、鑒定等方面應用相對較少。Milla-Lewis等[16]利用AFLP標記對鈍葉草遺傳多樣性進行研究，共擴增1793條條帶，其中多態性條帶1524條，多態性比率為 8 5 % 。

本研究在對來自不同國家和地區的鈍葉草種質進行聚類分析，發現來自科特迪瓦的S08和S09聚在一起，它們之間的遺傳相似性系數為0.9286，說明它們的親緣關系最近。其中S08采自科特迪瓦阿西尼海邊，S09采自科特迪瓦阿比讓海邊，兩者均采集于科特迪瓦海邊，生境相似。這與黃春瓊等[37]利用SRAP分子標記對45份結縷草屬（ZoysiaWilld.）種質的遺傳多樣性研究得出的結論一致。同樣，宣繼萍等[38利用SSR標記對結縷草屬58份種質遺傳多樣性的研究也取得類似的結果。另外，聚類分析還發現來自海南瓊中的S05和S04并沒有聚在一類，這2份種質的遺傳相似性系數是0.6364。其中S04是采自海南瓊中加叉農場橡膠園路邊，S05是采自海南瓊中縣烏石農場路邊。這一現象顯示聚類結果與地理來源并不總是緊密聯系，可能存在基因漂流等現象。陳斐等39利用SSR標記對82份首蓿（MedicagosatiuaL.）種質資源的研究、陳志祥等[40]利用SSR標記對72份木豆[Cajanuscajan（L.）Millsp]種質資源的研究以及伊然等41利用EST-SSR標記對6O份葦狀羊茅（Festucaarundina-ceaSchreb.）遺傳多樣性研究同樣也發現聚類分析結果與地理來源不相關的現象。另外，本研究在聚類分析將13份種質分為4個類群，主成分分析將其分為5個類群。主成分分析與聚類分析對種質的劃分結果基本一致。主成分分析結果更直觀地從圖上表明了不同鈍葉草種質之間的親緣關系。這兩種方法在聚類方面不同的是聚類分析將哥斯達黎加的S01、海南瓊中的S04聚為一類，哥斯達黎加的S02、海南儋州的S12、海南瓊中的S05聚為一類，而主成分分析將哥斯達黎加的S01、海南瓊中的S04、海南瓊中的S05聚為一個類群，哥斯達黎加的S02和海南儋州的S12聚為一個類群。雖然略微有差別，但他們之間的遺傳相似范圍一致，所包括的材料一致。此外，聚類分析結果發現不同國家地域來源與聚類的關系不明顯，這一現象可能與所用種質的數量有限有關。因此本研究并沒有很好的顯示出聚類與地理來源之間的直接聯系，后期需要增加種質數量或者結合其他分子標記手段進行深入分析。

本研究在利用SRAP標記在對13份鈍葉草種質資源擴增時發現，所篩選的21對引物中有19對引物能對10份鈍葉草種質擴增出32個特征指紋，從而使得這些種質能快速從供試種質中鑒定出來，說明SRAP標記在鈍葉草種質鑒定方面有良好的效果。另外，由于本研究所選擇的種質是來自7個不同的國家和地區的，種質間地理差異明顯，種質間的遺傳多樣性豐富，從而利用SRAP標記能快速從中區分開。

4結論

本研究利用SRAP標記對13份鈍葉草種質的遺傳多樣性進行檢測。21對引物共檢測出161個標記，且均是多態性標記，可有效區分13份野生鈍葉草種質，在遺傳相似性系數為0.6930時可將13份鈍葉草種質劃分為4個類群。聚類分析與主成分分析對種質的分類結果基本一致。本研究結果表明13份鈍葉草種質的遺傳多樣性處于上等水平，

SRAP標記能有效地評價鈍葉草種質的遺傳差異。

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