基于RGB成像技術估算鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長性能

摘要：為實現無損、高效、準確估算紫花苜蓿（Medicago satioaL.）幼苗生長性能指標，本研究基于LemnaTec Scanan-lyzer植物表型分析系統拍攝鹽脅迫下29個紫花苜蓿品種幼苗頂視、正視和側視RGB圖像，分析篩選可估算幼苗生物量、葉綠素含量（Soil and plant analyzer development，SPAD）、葉面積和株高等生長性能指標的圖像表型參數。結果表明：側視圖投影面積與紫花苜蓿幼苗葉干重、莖干重和總干重均具有顯著的正相關關系;基于頂視、正視和側視投影面積計算得到的5個參數中， 對幼苗總干重具有較好的預測效果，模型為 （204 。側視圖投影面積和側視圖最小外接圓直徑可分別用于建立紫花苜蓿幼苗葉面積和株高的估算模型 分別為0.71和 0 . 8 4 ） 。主成分分析表明，無鹽脅迫、低鹽脅迫 和高鹽脅迫濃度（150和225 處理的幼苗圖像表型參數明顯在不同象限。頂視、正視和側視3個角度投影面積和側視圖最小外接圓直徑均在4個鹽脅迫濃度梯度之間呈現顯著性差異，能夠估算紫花苜蓿幼苗生長性能，進而評價其耐鹽脅迫能力。

中圖分類號：S541.9 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）04-1201-10

Abstract： In order to estimate alfalfa seedling growth parameters by a non-inductive，high-eficiency and accur rate method，RGB images of 29 alfalfa cultivars seedlings under salt stress were taken from the top，side and front view using the LemnaTec Scananlyzer.Phenotypic parameters acquired from RGB images were analyzed，including biomass，SPAD value（Soil and plant analyzer development），leaf area and plant height. Results showed that the object area from the side view images had the significantly positive corelation with the leaf dry weight，the stem dry weight and the total dry weight.Five indices were calculated using the object area from the top， side and front view images and could predict total dry weight better with the model of y = 0 . 0 0 5 4 x + 0 . 0 3 0 5 （ .The object area and the min enclosing circle diameter from the side view images could respectively estimate the leaf area and the plant height with the of O.71 and 0.84. According to the principal component analysis，phenotypic parameters of seedlings could be obviously separated in different quadrant for the treatments of no salt level， low salt level and high salt level（150 and . The significant difference was found in the object area from three view images and the min enclosing circle diameter from the side view images among four salt stress levels.Thus，these phenotypic parameters could be used to estimate the growth characteristics and the salt tolerance of alfalfa seedlings.

Key words：Non-inductive estimation； Alfalfa；RGB imaging technology；Salt stress；Object area

紫花苜蓿（MedicagosatiuaL.）是多年生豆科牧草，因其生物產量高、牧草品質優良、適應性廣而在全球大面積種植，主要用于草地農業和生態建設工程。在我國，紫花苜蓿主要種植在內蒙古、寧夏、甘肅、新疆等北方區域，隨著“草牧業\"“糧改飼”“振興奶業苜蓿發展行動”等國家政策持續支持和養殖業需求的增加，紫花苜蓿種植面積逐年擴大，2019年我國紫花苜蓿商品草種植面積達43.92萬 。受全球氣候變暖及不合理利用的影響，我國北方土壤鹽漬化程度加劇的問題日益突出。在保障基本耕地種植主糧的大背景下，開發利用鹽堿地等低產土地，對擴大飼用作物種植面積、保障飼草料生產起著至關重要的作用。篩選耐鹽堿能力強的紫花苜蓿品種是實現鹽堿地種植高產栽培的重要途徑之一。

以往評價篩選植物抗逆能力相關研究多基于形態特征或生理性狀等傳統方法，其中主要包括植物株高、生物量、葉面積、葉片損傷程度等生長形態指標[2，滲透調節、抗氧化調節、光合作用等生理指標[3-4]。這些傳統的評價方法一定程度能反映出植物的抗逆性，但均有破壞性大、人力成本高、效率低以及主觀差異性等局限性。近年來，表型組學促進了作物復雜性狀的快速測量，包括植物生長性能指標測定、產量估算以及田間和溫室條件下對生物和非生物脅迫因子的抗性評價[5-6]。表型組學平臺使用的RGB成像、熒光成像8、微波成像9]、多光譜[10]、高光譜成像[11]等無損技術的發展一定程度上彌補和代替了傳統測量方法的缺點，可高效、準確、無損地完成植物資源的評價工作[12]

圖像處理技術目前已廣泛應用于農業領域，王敬軒等13通過計算機圖像處理對豆科牧草進行了分類研究，陳海燕等14通過RGB圖像處理實現了對高原鼠兔的連續自動監測，韓萬強等15通過高光譜遙感篩選出了伊犁絹蒿主要植物的最佳識別參數，倪浩然等[16應用多光譜成像實現了對紫花苜蓿品種的無損識別。RGB成像是最常用的植物表型評價方法之一，并在以往研究植物抗逆能力中得到了廣泛使用。Humplik等[17研究分析了豌豆幼苗生物量和光系統效率以研究豌豆（PisumsatiuumL.）的耐寒性，再對葉綠素熒光動力成像獲得的參數進行評價，并對2個不同品種的豌豆進行跟蹤試驗，通過基于相機拍攝的RGB圖像和實際測得的鮮重建立相關性模型并對模型加以驗證，證實了RGB圖像分析豌豆耐寒性的可行性。Atieno等18在鷹嘴豆試驗中，應用RGB成像建立植物地上部的投射面積和植物生長速率之間的模型，且結合常規測量種子數量和衰老評分，以了解鷹嘴豆耐鹽性的遺傳變異。汪輝等獲取了紫花苜蓿在干旱脅迫下不同生長階段植株RGB圖像，分析得到可估算植株生物量的圖像表型參數，并建立相關預測模型。

植物表型組學研究是突破未來作物學研究的關鍵領域，聚焦主要作物關鍵生產性狀的高效篩選、監測、估算是實現高產栽培、保障食物供應的途徑之一[19]。建立快速、無損、高準確度的估算作物地上部分生物量的方法對于未來研究其表型特征、生長特性具有重要的價值。本研究選擇國內外29個紫花苜蓿品種作為供試材料，使用表型分析儀拍攝其在不同鹽脅迫條件下單個植株的頂視、側視、正視RGB圖像，旨在篩選適宜表型參數，建立準確度較高的估算紫花苜蓿幼苗生物量、葉面積和株高的預測模型，以豐富牧草資源評價方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇29個紫花首蓿品種作為試驗材料，種子由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、北京正道生態科技有限公司等科研單位和企業提供（表1）。

1. 2 試驗設計

每個品種挑選飽滿、無損壞的種子5粒播入塑料盆（直徑 中，盆內裝有營養土與蛭石混合比例為1：1混合形成的培養土 。于三葉期每盆間苗至1株長勢相近的幼苗，并于五葉期開始鹽脅迫。鹽脅迫分3次完成，第1d每盆澆入66.6mmol· NaCl溶液 ，第2d澆人133.2mmol 溶液 ，第3d澆人 NaCl溶液 ，對照澆人等量蒸餾水，每個處理重復5次。在鹽脅迫的第 ，使用LabScananlyzer表型分析儀（德國，LemnaTecGmbH）拍攝每盆紫花苜蓿植株的頂視、側視和正視RGB圖像（圖

1），拍照后測定植株SPAD值、株高、葉面積、葉片重量、莖重量等生長性能指標。

從29個紫花首蓿品種中，篩選得到抗鹽脅迫能力較強的紫花苜蓿品種‘4020MF’，挑選飽滿、無損壞的種子，用 10 % 過氧化氫消毒 ，去離子水沖洗3次后轉移到自制發芽盤上，放入發芽條件為 h光照的光照培養箱中，培養液為 1 / 2 濃度的改良霍格蘭營養液。培養7d后，選取長勢一致的幼苗，移到裝有10L霍格蘭全營養液 值7.0）的水培箱培養，每孔1株，每箱24株，共4盆。每隔10d換一次培養液，培養20d后（三葉期），將配置的不同濃度鹽溶液倒人營養液中。NaC1濃度設置為0，75，150，225mmol· ，分別記為 處理。使用pH儀每天用 的KOH或HCI將營養液pH值調節至7.0左右。每隔3d選取長勢基本一致的幼苗5株，拍攝RGB圖像并測定植株SPAD值、株高、葉面積、葉片重量、莖重量等生長性能指標。

1.3 圖像獲取及分析

將每盆植株放入表型分析儀的同一位置，拍攝頂視和正視RGB圖像后，手動旋轉植株 拍攝側視圖像。使用表型分析儀的圖像分析軟件，經過Lab灰度設置閾值，轉化為二進制格式，選擇感興趣區域等操作流程，獲取表型數據（圖2）。圖像表型參數包括投影總面積（Objectarea，OA）、最小外接圓直徑（Min enclosingcircle diameter，MECD）、最小外接矩形面積（Minarearectanglearea，MARA）、Y軸長度（Object extentY，OEY）、X軸長度（ObjectextentX，OEX）、緊密度（Compactness）、周長（Circumference）、偏心率（Excentricity）、卡尺長度（CaliperLength，CL）、圓度（Roundness）外接多邊形周長（Convexhullcircumference，CHC）和外接多邊形面積（Convexhullarea，CHA）。

注： ，225mmol·L？1。（a），（b），（c），（d），（e）分別為 下第0，4，8，12，16d的幼苗，（f）， ，（h），（i），（j）分別為 下第0，4，8，12，16d的幼苗；（k），（1）， ，（n），（o）分別為 下第0，4，8，12，16d的幼苗；（p），（q），（r），（s），（t）分別為 下第0，4，8，12，16d的幼苗Note： ，75 mmol-L ， ， .（a），（b），（c），（d），（e）showedthe seedlingsafter0，4，8，12，16dunder ，respectively.（f）， ，（h），（i），（j）showed the seedlings after O，4，8，12，16d under ，respectively.（k），（1）， ， ，（o）showedtheseedlingsafterO，4，8，12，16dunder ，respectively.（p），（q），（r），（s），（t）showed the seed-lings after0，4，8，12，16dunder ，respectively

并通過以下公式計算相關參數

式中 為正視圖像投影總面積 為側視圖

像投影總面積， 為頂視圖像投影總面積，Asauerage為As.0和As.90的平均值。VIAP，VIntegratedAnalysis Platformo

1.4生長性能指標和測定方法

測定拍攝圖像后植株的SPAD值、株高、葉面積、葉鮮重、葉干重、莖鮮重和莖干重，具體測定方法如下：

SPAD值：每株選擇從頂部向下第1片完全展開葉的中間小葉進行測定，使用便攜式葉綠素測定儀（SPAD-502Plus，KONICA，日本）測定SPAD值。

株高：使用直尺量取植株莖基部到頂部葉尖的絕對高度。

葉面積：將每株植株的葉片分離出來，使用葉面積儀（YMJ-CH智能葉面積測量系統，托普云農，中國）測定總葉面積。

地上生物量：將每株植株分為莖和葉片，使用天平分別稱量鮮重，之后裝入信封放人烘箱內， 殺青 后 烘至恒重，分別稱量干重，總十重重為葉重和莖重之和。

1.5 數據處理

統計植株的株高、SPAD、葉面積、葉鮮重、葉干重、莖鮮重、莖干重、總鮮重、總干重等生長性能指標和側視圖和頂視圖表型參數等指標的最小值、最大值、平均值、標準偏差和變異系數。使用Pearson法分析生長性能指標和表型參數之間的簡單相關關系，繪制建立側視圖最小外接圓直徑與株高、側視圖投影總面積與葉面積、三視圖經公式（1（2）3）（4（5）計算出的指標與總干重線性回歸模型及相應驗證模型。使用統計分析軟件SIMCA-P14.1計算基于表型參數的幼苗干重的變量投影重要性指數（Variableprojectionimportance index，VIP）。株高、葉面積和總干重預測模型建立時，隨機選擇29個紫花苜蓿品種 70 % 的樣本數據訓練線性模型，使用29個紫花苜蓿品種剩余 30 % 的樣本數據驗證所擬合的線性模型，同時使用‘402OMF'品種的全部樣本數據再次驗證預測模型，并使用公式（6（7（8）計算真實值與預測值擬合模型的決定系數 、均方根誤差（Root mean square error，RMSE）、相對誤差（Relative error，RE）[20]。

式中， 和 分別是真實值、預測值和真實值的平均數，n為樣本數。

2 結果與分析

2.1實測參數和圖像表型數據的統計分析

29個紫花苜蓿品種的葉面積、葉鮮重、莖鮮重、葉干重、莖干重和總干重均具有較高變異，變異系數分別為4 8 . 5 0 % ， 5 4 . 0 5 % ， 5 8 . 8 1 % ， 5 1 . 7 7 % ， 5 5 . 2 2 % ， 5 2 . 3 4 % 其中總干重為 株高和SPAD變異系數較低，分別為 2 9 . 0 7 % 和 3 3 . 9 3 % 表2）。

紫花苜蓿樣本的側視圖投影總面積、最小外接矩形面積、周長、圓度、外接多邊形面積均具有較高變異，變異系數分別為 5 7 . 4 4 % ， 5 6 . 7 3 % ， 1 0 0 . 6 7 % 1 6 8 . 0 9 % ，57. 14 % （表3）。紫花苜蓿樣本的頂視圖投影總面積、最小外接矩形面積、周長、偏心率、圓度、外接多邊形面積均具有較高變異，變異系數分別為 5 8 . 6 4 % ， 5 3 . 2 1 % ， 1 6 4 . 2 9 % 5 7 . 9 3 % 6 7 8 . 5 9 % 5 2 . 0 8 % （表3）。

2.2實測參數與圖像表型參數的相關分析

實測參數與圖像表型參數的相關分析結果表明，除了頂視圖的周長與SPAD、葉鮮重和葉干重以及圓度和實測所有指標無顯著相關性以外，其余圖像表型指標均與實測參數之間具有顯著相關性 0其中，獲取的圖像表型參數中，株高與側視圖的最小外接圓直徑相關系數的平方 最高，為0.88；葉面積與側視圖投影總面積的 最高，為0.82；總干重與側視圖投影總面積的 最高，為0.84（圖3）。

2.3基于表型參數的幼苗干重VIP指數

基于偏最小二乘回歸，12個表型參數中，側視

圖和頂視圖的投影面積均對幼苗干重預測的貢獻最高，VIP指數均高于1.4（圖4）。

2.4株高、葉面積和總干重預測模型建立及驗證

使用29個紫花苜蓿品種中 70 % 的樣本的實測數據和表型參數進行建模，獲得側視圖投影總面積預測葉面積的線性模型 548.82， 為0.71（圖5A）；側視圖最小外接圓直徑預測株高的線性模型 為0.84（圖5B）。

通過圖像分析得到正視、側視和頂視圖像投影總面積，經計算得到Green area， 和

應用‘4020MF'品種樣本數據驗證以上3個模型，側視圖最小外接圓預測株高、側視圖面積預測葉面積和 預測總干重驗證模型 分別為0.99，0.94，0.91，預測模型具有較高的精確度（圖7）。

2.5 鹽脅迫下紫花首蓿RGB圖像參數的主成分分析

分別對鹽脅迫第4，8，12d植株的12個圖像參數以及總數據進行主成分分析，0和 處理植株的圖像參數與150和 處理植株的圖像參數可明顯被分開（圖8），說明不同鹽濃度梯度對紫花苜蓿幼苗圖像參數的影響存在差異。

2.6鹽脅迫對紫花苜蓿RGB圖像參數投影總面積和最小外接圓直徑的影響

在脅迫后第 的側視圖、正視圖和頂視圖投影總面積均顯著高于 在脅迫后第8和 的側視圖和頂視圖投影總面積均顯著高于 ；在脅迫后第4和 的正視圖投影總面積顯著高于 和 的側視圖、正視圖和頂視圖投影總面積之間均無顯著差異（圖9）。在脅迫后第 和 的側視圖最小外接圓直接顯著高于150和 0 ，且0和 之間差異不顯著；在脅迫后第4和 的側視圖最小外接圓直接顯著高于 0

3討論

RGB技術對于未來作物育種具有較大前景，它有助于更快的鑒定適合地區栽種的種質，可高效地完成目標性狀的篩選評價工作。本研究中，在從植株RGB圖片提取得到的表型參數中，紫花苜蓿葉片干重、莖干重和總干重均與側視圖和頂視圖的投影面積之間相關性最強（圖2），且基于頂視圖、正視圖和側視圖投影面積計算的 預測植株總干重時具有較好效果（圖5）。目前，已有研究證明了無損技術評估植物抗逆性的優勢，Aris等[21]學者基于RGB圖像分析得到的植株投影面積和枯死植株面積，可以用來預測植株生物量，進而評價水稻植株的耐鹽能力。Rajendran等22學者使用植物表型系統（Scanalyzer3D，LemnaTec）拍攝12份小麥資源的植株RGB圖像，從圖像中提取得到的投影面積與葉片面積之間具有較高的相關關系，研究者們使用投影面積鑒定區分參試資源的鹽脅迫耐受性，以實現高通量評價小麥耐鹽能力的自的。同樣，基于RGB圖像的植株投影面積也被用作估算植株生物量，以評價大麥[23]、土豆[24]、鷹嘴豆[18]、扁豆[5]、豌豆[17]、紫花苜蓿等作物的抗逆性。以往研究表明，基于多角度拍攝植物RGB圖片提取計算的投影面積預測生物量模型要優于單個相機拍攝，正視、頂視、側視等多角度拍攝可以降低由于植株葉片重疊、卷曲、皺縮等造成的投影面積誤差[]。例如，利用頂視相機拍攝RGB圖片估算擬南芥農藝性狀時，無法準確估算垂直生長相關指標[25]，需增加側視相機可解決該問題。除了利用RGB圖片提取的投影面積估算植株生物量以外，還可以用于估算其他生長性能指標，如葉面積等[7]。本研究結果也表明，側視圖提取的投影面積與葉面積之間具有較高的相關性（圖2）。

本研究通過提取分析21個紫花苜蓿品種植株頂視圖和側視圖RGB圖片中的投影面積、最小外接圓直徑、緊密度、外接多邊形面積等12個表型參數與株高、葉面積和生物量相關實測指標的相關關系，最終確定了用于估算總干重、葉面積和直徑等實測指標對應的表型參數分別為側視圖投影面積、側視圖投影面積和側視圖最小外接圓直徑（圖2）。并且以上表型參數在不同鹽脅迫下表現出顯著差異，可用于評價紫花苜蓿耐鹽能力（圖9）。除了投影面積以外，基于植物RGB圖像提取的色彩參數、外接多邊形面積、緊密度、最小外接圓直徑等表型參數亦可以用于評價植物生長和發育表現[5.7，26]。Pratap等學者26根據RGB圖片中提取的綠色和非綠色的色彩表型參數差異區分扁豆耐鹽脅迫能力差異。汪輝等7利用RGB圖片提取的最小外接圓直徑可估算紫花苜蓿的株高。Honsdorf等學者[27]利用RGB圖片中提取的緊密度和外接多邊形面積等表型參數定位了野生大麥的抗旱相關的QTL（Quantitativetraitloci）位點。

“植物表型”是指植物的表面特征，包括形態、顏色和基本維度等，是基因型和環境共同作用的結果。表型組學屬于“組學”的范疇，應用了自動化控制、光學成像、圖像分析、計算機技術等現代科學技術，可數字化描述植物體的全部表型信息。以農作物栽培和育種為實際需求為導向，利用RGB成像等表型組學系統成像模塊是未來開展作物表型數據獲取、解析、管理和挖掘工作的重要手段。

4結論

本研究基于LemnaTecScanalyzer表型組學平臺拍攝RGB圖像提取的側視圖投影面積和最小外接圓直徑可以用于估算紫花苜蓿生物量、葉面積和株高，低鹽脅迫濃度（0和 和高鹽脅迫濃度（150和 處理的幼苗可用圖像表型參數明顯分開，RGB圖像用于評價紫花苜蓿幼苗在鹽脅迫下的適應性具有可行性。

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（責任編輯劉婷婷）