小麥品種天寧38號(hào)的磷高效分子標(biāo)記鑒定

Molecular Identification on the Phosphorus Efficiency of Wheat Variety Tianning No. 38

WANG Jinfeng12，SHI Huanting2，QIAO Jixia3， WANG Xiang2， LOU Chuang2，WANG Pengfei2，KANG Guozhang1，2 （ ShennongSeddustrLboratoryZhengzhou46;ColgeofAgronmytionalEngneeringReearchCenterforWeat， HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou45o46;HenanTianningSeedIndustryCo.，Ltd.，Xinxiang453o，Henan）

磷（P，Phosphorus）是核酸、磷脂、ATP等重要化合物的組分，作為三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，在作物光合作用、呼吸作用等生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中起著重要作用，影響著作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[1]。土壤中的磷以有機(jī)磷和無機(jī)磷的形式存在，其中無機(jī)磷酸鹽（ 和 ，Pi）是作物吸收磷的主要來源。雖然土壤中磷資源豐富，但無機(jī)磷酸鹽容易與金屬離子結(jié)合形成螯合物，其流動(dòng)性和有效性較差，難以被作物直接吸收利用[2]。為實(shí)現(xiàn)作物產(chǎn)量的增加，磷肥被大量施用，然而只有 1 0 %～2 0 % 的磷肥可以被作物吸收，大量的磷肥因淋失、徑流、侵蝕和固定化而流失，導(dǎo)致環(huán)境污染和投入成本增加[3]。另外，磷礦還是不可再生資源，面臨著資源耗盡的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，挖掘磷高效基因、選育磷高效小麥品種至關(guān)重要。

磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PHTs）在作物磷素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)與再分配過程中發(fā)揮著重要作用，它包含PHT1、PHT2、PHT3和PHT4亞家族。PHT2s、PHT3s和PHT4s分別定位于葉綠體、線粒體和高爾基體，介導(dǎo)了細(xì)胞器內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)，其絕大多數(shù)成員屬于低親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；而PHT1s亞家族成員最多，主要定位于細(xì)胞膜，負(fù)責(zé)根系從外界吸收轉(zhuǎn)運(yùn)Pi，絕大多數(shù)成員屬于高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[5]。PHT1s受Pi缺乏誘導(dǎo)表達(dá)，主要負(fù)責(zé)從低Pi環(huán)境下吸收低濃度Pi，由于絕大多數(shù)土壤中Pi濃度較低，難以滿足作物生長(zhǎng)發(fā)育的需求，屬于低Pi脅迫環(huán)境，故PHT1s在作物磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[。目前在小麥中已鑒定出14個(gè)PHT1家族蛋白成員TaPHT1；1＼～TaPHT1; ，然而只有TaPHT1;4和TaPHT1；10已進(jìn)行了功能驗(yàn)證[8-9]。本團(tuán)隊(duì)前期通過同位素標(biāo)記相對(duì)定量蛋白組學(xué)（iTRAQ，isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification）技術(shù)與平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM，Parallel reactionmonitoring）靶向蛋白定量技術(shù)鑒定到一個(gè)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaPHT1；9，并通過酵母試驗(yàn)、基因編輯技術(shù)、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)技術(shù)在水培與土培環(huán)境下充分驗(yàn)證了其在磷肥吸收與利用中發(fā)揮的重要作用[10-11]。另外，還發(fā)現(xiàn)在低磷環(huán)境下TaPHTI;6的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)豐度均顯著上調(diào)，且通過缺磷酵母突變體異位表達(dá)試驗(yàn)驗(yàn)證其具有吸收磷的功能[12]。基于TaPHT1;9-4B和TaPHT1；6-5B基因序列在小麥品種間的等位變異，分別開發(fā)了2個(gè)分子標(biāo)記CAPS-799（專利號(hào)：ZL202110539032.9）和dCAPS-571（專利申請(qǐng)?zhí)枺篊N202410294852.X），可用于鑒定磷高效小麥品種[12-13]

天寧38號(hào)是河南省天寧種業(yè)有限公司以西農(nóng)979/眾麥2號(hào)//鄭麥9405為雜交組合選育出來的弱春偏冬性小麥品種，審定編號(hào)：豫審麥20200056。該品種具有低稈抗倒、早熟、抗病、多穗高產(chǎn)等特點(diǎn)，目前已被江蘇、安徽、湖北、陜西4省引種，2024年被列人河南省農(nóng)業(yè)主導(dǎo)品種[14-15]。本文利用分子標(biāo)記CAPS-799、dCAPS-571對(duì)天寧38號(hào)進(jìn)行了分子鑒定，并進(jìn)行了2年田間試驗(yàn)驗(yàn)證，旨在評(píng)價(jià)該品種是否屬于磷高效小麥品種，為該品種大面積應(yīng)用提供理論支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料參試品種天寧38號(hào)（西農(nóng)979/眾麥2號(hào)//鄭麥9405），為河南省天寧種業(yè)有限公司選育的小麥品種。對(duì)照品種為周麥18，該品種由河南省周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，綜合抗病性與抗倒伏能力強(qiáng)，曾被用作國(guó)家黃淮南片麥區(qū)與河南省小麥新品種審定的對(duì)照品種。

1.2分子標(biāo)記鑒定本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)TaPHT1；9和TaPHT1;6是2個(gè)重要的高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并辨析了其在小麥品種間的等位變異位點(diǎn)，其中TaPHT1；9-4B在小麥品種間可分為Hapl＼～Hap4等4個(gè)單倍型，TaPHT1;6-5B可分為Hapl＼～Hap3等3個(gè)單倍型，均以Hap3為磷高效優(yōu)異單倍型，進(jìn)一步開發(fā)了分別鑒定2個(gè)基因Hap3的分子標(biāo)記CAPS-799和 dCAPS-571。

用CTAB法提取天寧38號(hào)和周麥18的DNA，以2個(gè)品種的DNA為模板，使用TaPHT1;9-4B啟動(dòng)子特異性擴(kuò)增引物TaPHT1;9-4B-Pro-F/R擴(kuò)增2個(gè)品種的啟動(dòng)子序列（引物序列見表1）。以2個(gè)品種的啟動(dòng)子純化產(chǎn)物為模板，用分子標(biāo)記引物TaPHT1;9-4B-CAPS-F/R擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域，得到清晰明亮的目標(biāo)條帶后進(jìn)行純化回收，用Fmu4HI進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物用 2 . 5 % 凝膠進(jìn)行電泳鑒定。若產(chǎn)生2條擴(kuò)增片段（457bp和246bp），則為Hapl、Hap2或Hap4小麥品種，若只有單一擴(kuò)增條帶（ 7 0 3 b p ），則為TaPHT1；9-4B-Hap3小麥品種[1]。TaPHT1;6-5B分子標(biāo)記鑒定方法與TaPHT1；9-4B一致，啟動(dòng)子擴(kuò)增引物為TaPHT1;6-5B-Pro-F/R，分子標(biāo)記引物為TaPHT1;6-5B-dCAPS-F/R，使用內(nèi)切酶為 B s t B I ，酶切后若產(chǎn)生2條擴(kuò)增片段（95bp和21bp），則為Hapl或Hap2小麥品種，若產(chǎn)生1條116bp的擴(kuò)增條帶，則為TaPHT1;6-5B-Hap3小麥品種[12]

1.3田間試驗(yàn)2年田間試驗(yàn)在河南省新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行，低磷試驗(yàn)地已進(jìn)行連續(xù)4年的不施磷肥（P0：氮肥 ，磷肥 ，鉀肥 ;該處理作物生長(zhǎng)發(fā)育吸收的Pi主要來于土壤中Pi）和正常施用磷肥（P120：氮肥 ，磷肥 ，鉀肥 該處理作物生長(zhǎng)發(fā)育吸收的Pi主要來于土壤中Pi和外施Pi）處理，二者除施磷和不施磷差異外，氮肥和鉀肥施用量均相同。4年后，P0處理 0～2 0 c m 土壤中有效磷含量為 9 . 1 4 m g / k g ，只有P120處理有效磷含量 2 4 . 3 4 m g / k g 的 3 7 . 5 5 % ，故PO處理土壤已達(dá)低磷脅迫條件[12-13]

2022年度（2021年10月至2022年6月）和2023年度（2022年10月至2023年6月）2個(gè)小麥生長(zhǎng)季節(jié)，將天寧38號(hào)和周麥18種植在上述P0和P120環(huán)境下。每個(gè)品種種植小區(qū)長(zhǎng) 4 . 5 m 寬 0 . 8 m 株距 3 . 0 c m ，播種4行，3次重復(fù)。氮肥于播種前施用 5 0 % ，拔節(jié)期追施剩余 5 0 % ，磷肥和鉀肥在播種前全部基施。其余田間管理措施同常規(guī)高產(chǎn)試驗(yàn)田。

1.4測(cè)定指標(biāo)與方法分別于開花期和成熟期對(duì)天寧38號(hào)和周麥18進(jìn)行田間取樣，選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的3株剪掉根部，保留地上部，成熟期將地上部分為籽粒和營(yíng)養(yǎng)器官兩部分。 1 0 5 % 殺青 烘干至恒重后稱量地上部營(yíng)養(yǎng)器官和籽粒干重，用粉碎機(jī)磨碎備用，磷含量的測(cè)定采用鉬銻抗吸光光度法[1]

作物磷效率由磷素吸收效率（PAE，Pacquisitionefficiency）和磷素利用效率（PUE，Putilizationefficiency）組成。磷素吸收效率（磷素積累量）反映了根系吸收磷素并向地上器官轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。磷素利用效率表示每單位磷素產(chǎn)生可收獲籽粒產(chǎn)量的效率，反映了作物體內(nèi)重新分配、利用磷產(chǎn)生籽粒產(chǎn)量的能力。上述指標(biāo)計(jì)算公式參照Veneklaas等[1]的方法：磷素積累量 τ（ g） = τ 磷含量 （ % ） × 干重（g）;磷素利用效率 籽粒產(chǎn)量（g）/成熟期磷素積累量（g）。1.5試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoftexcel2019和SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析（獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)），圖表繪制使用Origin2021軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1分子標(biāo)記鑒定用TaPHT1;9-4B的分子標(biāo)記CAPS-799引物對(duì)天寧38號(hào)和周麥18的啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)天寧38號(hào)擴(kuò)增片段經(jīng)Fmu4HI酶切后，產(chǎn)生1條 7 0 3 b p 片段，屬于TaPHT1；9-4B優(yōu)異單倍型小麥品種（TaPHT1;9-4B-Hap3），而周麥18擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后，產(chǎn)生2條片段（457bp和 2 4 6 b p ），屬非優(yōu)異單倍型品種（TaPHT1;9-4B-Non-Hap3）（圖1A）

類似地，用TaPHT1;6-5B分子標(biāo)記dCAPS-571引物對(duì)上述2個(gè)品種的啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)天寧38號(hào)擴(kuò)增片段經(jīng)BstBI酶切后形成1條116bp片段，屬于TaPHT1;6-5B優(yōu)異單倍型小麥品種（TaPHT1;6-5B-Hap3），而周麥18擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后，產(chǎn)生2條片段（95bp和21bp），屬于非優(yōu)異單倍型品種（TaPHT1;6-5B-Non-Hap3）（圖1B）。

上述結(jié)果表明，天寧38號(hào)品種內(nèi)含有2個(gè)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaPHT1；9-4B和TaPHT1;6-5B序列的磷高效優(yōu)異等位變異位點(diǎn)，推測(cè)其為磷高效小麥品種。

2.2單株籽粒產(chǎn)量為驗(yàn)證上述分子檢測(cè)結(jié)果，本研究測(cè)定了2個(gè)年度天寧38號(hào)和周麥18在P0和P120處理下籽粒產(chǎn)量及產(chǎn)量變幅（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在P120環(huán)境下，2022年度天寧38號(hào)的籽粒產(chǎn)量極顯著低于周麥18，2023年度略低于周麥18，但差異不顯著；在P0環(huán)境下，2個(gè)年度試驗(yàn)中，天寧38號(hào)籽粒產(chǎn)量均極顯著高于周麥18，分別提高了 3 0 . 8 3 % 和 5 9 . 5 0 % 。與充分供磷相比，2個(gè)年度天寧38號(hào)品種單株籽粒產(chǎn)量平均降幅為 1 7 . 5 8 % ，顯著低于周麥18（平均降幅 5 0 . 8 1 % ），表明天寧38號(hào)更適應(yīng)低磷脅迫條件。

2.3磷效率鑒定進(jìn)一步對(duì)2個(gè)小麥品種的磷素積累量和磷素利用效率進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在P120條件下，天寧38號(hào)2個(gè)年度磷素積累量均低于周麥18，但差異不顯著，表明在充分供磷條件下，天寧38號(hào)的磷吸收能力與周麥18相差不

A和B分別為TaPHT1;9-4B和TaPHT1;6-5B的分子標(biāo)記酶切鑒定圖;第1＼～3泳道為天寧38號(hào)小麥品種的酶切鑒定結(jié)果；第4＼～6泳道為周麥18的酶切鑒定結(jié)果;M為Marker大。在P0條件下，天寧38號(hào)2個(gè)年度磷素積累量均顯著或極顯著高于周麥18，分別提高了 1 8 . 2 2 % 和 6 2 . 5 2 % ，表明在低磷條件下，天寧38號(hào)具有更強(qiáng)的磷吸收能力。2個(gè)品種的磷素利用效率在2個(gè)試驗(yàn)?zāi)甓冉Y(jié)果不穩(wěn)定，在P120條件下2022年度周麥18的磷素利用效率極顯著高于天寧38號(hào)，2023年度周麥18的磷素利用效率略低于天寧38號(hào)，但差異不顯著；在P0環(huán)境下，2022年度天寧38號(hào)高于周麥18，2023年度天寧38號(hào)略低于周麥18，2個(gè)年度試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷素利用效率在品種間不存在顯著差異。

3 討論與結(jié)論

分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)能快速、精準(zhǔn)、高效地培育出作物新品種，在現(xiàn)代育種中占據(jù)著越來越重要的地位，其中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記的開發(fā)是重要環(huán)節(jié)。由于吸收養(yǎng)分的根系取樣難度大、磷含量測(cè)定方法復(fù)雜繁瑣，磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)影響因子眾多等，作物磷高效性狀的基因克隆仍較為緩慢[18]。普通小麥由于基因組大（15.8Gb）異源六倍體（AABBDD）重復(fù)序列高（ 8 5 % ）等復(fù)雜的基因組特性[19]，造成了小麥磷高效基因克隆與分子標(biāo)記開發(fā)研究進(jìn)展更加緩慢，明顯落后于其他主要糧食作物（水稻和玉米）[17，20-21]。

磷效率包含磷素吸收效率（磷素積累量）和磷素利用效率2個(gè)部分。天寧38號(hào)經(jīng)TaPHT1;9-4B-CAPS-799和 TaPHT1;6-5B-dCAPS-571分子標(biāo)記鑒定后，發(fā)現(xiàn)均含有2個(gè)基因的磷高效等位變異位點(diǎn)（Hap3）。連續(xù)2年低磷（P0）田間試驗(yàn)結(jié)果表明，天寧38號(hào)磷素積累量顯著高于對(duì)照品種周麥18（Non-Hap3），表明天寧38號(hào)確實(shí)屬于磷高效小麥品種。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種間磷素利用能力差異不顯著，表明2個(gè)基因的磷高效優(yōu)異等位變異位點(diǎn)主要提高了磷素吸收效率，而對(duì)磷利用效率影響較小，這與前期研究結(jié)果基本一致[13]。另外，在充分供磷條件下（P120），天寧38號(hào)磷素積累量、籽粒產(chǎn)量與周麥18差異不顯著或顯著降低，可能與TaPHT1;9-4B和TaPHT1;6-5B均屬于高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在低磷條件下發(fā)揮功能有關(guān)[10-12]。在P0條件下，天寧38號(hào)磷素積累量提升幅度（ 4 0 . 3 7 % ）大于前期研究中單一的TaPHTI;9-4B或TaPHT1;6-5B磷高效單倍型品種（小于 3 3 . 8 0 % ）[13]，表明天寧38號(hào)的磷高效可能是TaPHT1;9-4B和TaPHT1;6-5B優(yōu)異等位變異共同作用的結(jié)果。

綜上所述，天寧38號(hào)基因組上存在高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaPHT1；9-4B和TaPHT1;6-5B的優(yōu)異等位變異位點(diǎn)，屬于磷高效小麥品種，該品種的大面積推廣應(yīng)用可進(jìn)一步減少磷肥投入，加快小麥綠色生產(chǎn)進(jìn)程。

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