金黃色葡萄球菌模板制備的比較研究

[中圖分類號]Q939.1;TS 207.4[文獻標志碼]A[文章編號]1005-0310（2025）03-0045-08

Abstract：The present study displayed five diferent methods of template DNA extraction from Staphylococcus aureus cultures，including Simple boiling pyrolysis，SDS cracking，SDS combined with heat cracking，commercial kits extraction method and instrument automatic extraction. By using the conventional PCR and fluorescence quantitative PCR，the effects of the DNA template prepared by these methods for PCR test are compared.The study revealed that template DNA extracted using the SDS cracking and SDS combined with heat cracking methods was undetectable in both conventional PCR and fluorescence quantitative PCR without prior dilution.Template DNA extracted by simple boiling pyrolysis at dilutions ranging from 10^υ to 10⁵ was successfully detected by conventional PCR，while template DNA extractedusing the commercial kits extraction methodand instrument automatic extraction at a 10^° dilution was undetected. In fluorescence quantitative PCR， template DNA obtained via the boiling pyrolysis at dilutions from 10⁰ to 10⁵ was consistently detected，while DNA at a 10⁵ dilution prepared by the other four methods mentioned above was undetected.Given its high suitability for PCR-based detection，simplicity，and minimal laboratory requirements，the boiling pyrolysis method was identified as the optimal approach for template DNA preparation in Staphylococcus aureus PCR assays.

Keywords ： staphylococcus aureus ; PCR ;fluorescence quantitative PCR ; template DNA

金黃色葡萄球菌是一種典型的革蘭氏陽性球型細菌，可以大量分布于空氣、水、人和動物的排泄物中，富含蛋白質的食品如蛋奶類、肉類容易受到污染。由金黃色葡萄球菌產生的金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒是國際上重要的公共食品衛生問題。在我國，金黃色葡萄球菌造成的細菌性食物中毒約占 1/4^[1] ，所以需要從食品安全的角度對其進行分析研究。

目前，我國食品中金黃色葡萄球菌主要以國家標準GB4789.10—2016作為檢驗依據[2]，據此進行的檢驗一般需要5d左右，操作繁瑣，受環境及主觀因素影響較大。新興的食品檢驗技術中，金黃色葡萄球菌檢測技術有核酸探針技術、免疫磁珠技術、酶聯免疫吸附技術、表面等離子共振技術、毛細管電泳檢測技術、環介導等溫擴增技術等，新型檢測方法雖然省時省力，但因成本高導致使用率不高[3]

聚合酶鏈反應（PCR）技術是金黃色葡萄球菌的主流檢測技術之一。PCR技術具有快速、高效、特異性強和靈敏度高等特點[4-5]。PCR 檢驗中模板DNA制備的方法有很多，主要分為酶法、物理法（如微波法、樹脂吸附法、熱煮沸裂解法、反復凍融法）[6-7]、化學法（如堿性裂解法、SDS 法、CTAB 法等）[8-9]。本研究采用煮沸裂解、SDS 裂解、SDS與加熱裂解結合、商品化試劑盒提取以及儀器自動提取5種方法分別從金黃色葡萄球菌培養物中提取模板DNA，并進行常規PCR和熒光定量PCR檢測，比較這5種方法制得的模板DNA用于PCR檢驗的效果，從而篩選出最優的適用于金黃色葡萄球菌常規PCR以及熒光定量PCR檢驗的制備模板DNA的方法。

1材料與方法

1. 1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（中國科學院微生物研究所，CGMCC1.2465），營養瓊脂（北京陸橋技術有限責任公司）、TSB胰蛋白脈大豆肉湯（北京陸橋技術有限責任公司），SYBRPremixEx TaqTMTaKaRa（生工生物工程（上海）股份有限公司）PCR擴增試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）、4sGreenPlusNucleicAcidStain核酸熒光染料（生工生物工程（上海）股份有限公司）、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），細菌DNA提取試劑盒（托摩根公司）（與核酸提取儀配套使用），溶菌酶（ 20000U/mg ，Solarbio 公司），蛋白酶K（ 10mg/mL ，Solarbio 公司）、SDS（Solarbio公司）、Tris（純度 ?99.9% ，Solarbio 公司）EDTA（純度 ?99.5% ，Solarbio公司），瓊脂糖（純度 ?99% ，BestaTM美國進口），鹽酸（分析純，北京化工廠），硼酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），金黃色葡萄球菌引物（生工生物工程（上海）股份有限公司），上游引物為 5^′ 1GCGATTGATGGTGATACGGTT- 3^′ ，下游引物為 5^′ 1AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC- 3^′ ，擴增基因為金黃色葡萄球菌DNA片段高保守序列的nuc基因，該基因具有特異性，擴增長度為 279bp^[10]

1. 2 儀器與設備

熒光定量PCR儀Rotor-Gene600O（澳大利亞Corbett公司）、PCR儀PTC-200（美國伯樂公司）、核酸提取儀MM12（Thmorgan公司）、化學發光成像系統MG8800（Thmorgan公司）、電泳儀HC2000（Thmorgan公司）、高壓蒸汽滅菌器（日本Tony公司）、生化培養箱BSP-250（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、天平BT224S（賽多利斯科學儀器有限公司）高速離心機（美國BECKMAN公司）、超微量紫外分光光度計NanodropND1000（美國Spectrophotometer公司）

1. 3 方法

1.3.1 實驗菌種及PCR檢驗菌液的制備

將金黃色葡萄球菌轉接至營養瓊脂培養基中，于 36^circC±1^°C 培養箱中培養 16～24h ，連續傳代 2～ 3次，以增加細菌活力，提高細菌的靈敏度。實驗前一天，用接種環將培養了 16～24h 的菌種轉接至TSB胰蛋白陳大豆肉湯培養液中，于 36^circC±1^°C 培

養箱中培養 16～20h 。

1.3.2 模板DNA的提取[5-8]

模板DNA的提取：分裝菌液至EP管，分5組，每組12管，每管 0.5mL，12000rpm 離心 5min ，棄去上清液。

1）方法1：按照上海生工細菌基因組DNA快速提取試劑盒的方法

向12個裝有菌體沉淀的EP管中分別加入溶菌酶 80μL （ 10mg/mL ）， 37^°C 酶解 30min 。加入20μL 蛋白酶K和 100μL BufferDigestion 振蕩混勻， 65^°C 水浴 至細胞完全解離。水浴過程中每10min 顛倒混勻一次，水浴結束后向EP管中再加人 200μL BufferPB，充分顛倒混勻，放置于 -20^°C 冰箱中 5min 。室溫 10000rpm 離心 5min ，將上清液轉移到新的EP管中;向有上清的新EP管中加入等體積的異丙醇，顛倒8次使之充分混勻，室溫放置 3min 。室溫 10 000rpm 離心 5min ，棄上清。向該EP管中加入 1mL75% 乙醇，顛倒漂洗1＼～3（2 min，10 000rpm 離心 2min ，棄上清，重復漂洗一次，開蓋室溫倒置 5～10min 至殘留乙醇完全揮發，得到的DNA用 100μL TE Buffer 溶解。

2）方法2：按照核酸自動提取儀及配套細菌DNA提取試劑盒的方法

向12個裝有菌體沉淀的EP管中分別加入溶菌酶 80μL（10mg/mL） 37^°C 酶解 30min 。酶解后向 EP 管中加入 200μL DATL Buffer渦旋 30s ，徹底混勻。再向 EP 管中加入 20μL 蛋白酶K，渦旋30s混勻。 60^°C 水浴 10～20min ，期間渦旋混勻一次。 8 000rpm 離心 15min ，轉移上清到 2mL 樣品管中。使用核酸提取儀MM12進行DNA自動提取，獲得模板量為 100μL 0

3）方法3：煮沸裂解法

向12個裝有菌體沉淀的EP管中分別加入TEBuffer 100μL ，隔水煮沸 10min ，置 4‰ 冰箱中30min，8 000rpm 離心 15min ，取上清。

4）方法4：SDS裂解法

向12個裝有菌體沉淀的EP管中分別加入溶菌酶 80μL（10mg/mL） ， 37^°C 酶解 30min 。向EP管中加入蛋白酶 K20μL ，SDS裂解液（ 0.5% ）100μL，56^°C 水浴 30min 進行細菌裂解，水浴過程中每10min 顛倒混勻一次， 8 000rpm 離心 15min ，取上清。

5）方法5：改良SDS裂解法向12個裝有菌體沉淀的EP管中分別加入溶菌酶 80μL （ 10mg/mL ） 37^°C 酶解 30min 。加入蛋白酶 K20μL ，SDS裂解液 100μL，56°C 水浴 30min 進行細菌裂解，水浴過程中每 10min 顛倒混勻一次。 98^°C 水浴 10min，8 000rpm 離心 15min ，取上清。

1.4 模板DNA提取的評價方法

1. 4.1 紫外分光光度法

使用超微量紫外分光光度計ND1000對上述5種方法提取的模板DNA進行核酸濃度檢測（OD260）和純度檢測（ ?0D230、0D260、0D280） 。

1. 4.2 瓊脂糖凝膠電泳法

用 0.5×TBE 電泳緩沖液制備 1% 的瓊脂糖凝膠（1克瓊脂糖加 100mL0.5×TBE 電泳緩沖液，加熱溶解），核酸染料為4sGreenPlusNucleicAcidStain，電泳電壓為 80V ，Marker 大小為 2000bp 。將每種方法制得的12管模板DNA混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

1.4.3 常規 PCR 法[11-12]

將上述5種方法提取的模板DNA分別進行10倍系列稀釋，獲得稀釋度分別為 10⁰、10¹、10²、10³ 、10⁴?10⁵ 的模板DNA。

50μL 體系：上下游引物各 2μL （引物濃度為10μmol/L ），dNTP 1μL ，氯化鎂 5μL ，氯化鉀5μL ，Taq 酶 0.25μL ，模板 3μL ，定容至 50μL 。

PCR反應條件： 94^°C 預變性 變性10s，60^°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，40 個循環，循環結束后 72^°C 保溫 10min 。

1.4.4 熒光定量 PCR 法[13-14]

將上述5種方法提取的模板DNA分別進行10倍系列稀釋，獲得稀釋度分別為 10⁰、10¹、10²、10³ 、10⁴ 的模板DNA。

25μL 體系：SYBR Premix 12.5μL ，上下游引物各 0.25μL （引物濃度為 10μmol/L ），模板 1μL 超純水 11μL 。

熒光定量 PCR反應條件： 95^°C 預變性 30s ，95^°C 變性 10s，60^°C 退火 40s，40 個循環， 95^°C 保溫 15s 。

2 結果與分析

2.1 紫外分光光度法對提取模板DNA的檢測結果及分析

使用超微量紫外分光光度計測得的模板DNA濃度和純度（OD260/OD280、OD260/OD230）結果如表1所示。

使用MATLAB軟件分別對上述5種方法制備的模板DNA的濃度數據、OD260/OD280的比值數據、OD260/OD230的比值數據進行方差分析（ANOVA）。模板DNA的濃度數據ANOVA計算結果中， P 值為 1.38×10^-99 Plt;0.05 ，證明5組數據存在明顯差異。 OD260/OD280 的比值數據ANOVA計算結果中， P 值為 4.56×10^-34 ， Plt;0.05 ，證明5組數據有明顯差異。 OD260/OD230 的比值數據ANOVA計算結果中， P 值為 3.46×10^-23 ， Plt;0.05 ，證明5組數據有明顯差異。

自動提取法制備的模板DNA濃度最低，為 ，但OD260/OD280比 值為1.49，OD260/OD230的比值為2.44，模板DNA純度較好。SDS裂解法和改良SDS裂解法制備的模板DNA含量較高，分別為 506.8ng/uL 和 735ng/uL SDS 裂解法的OD260/OD280 比值為0.75，OD260/OD230的比值為1.70，改良SDS裂解法的 OD280比值為 0.77，0D260/0D230 的比值為 1.69 。SDS裂解法和改良SDS裂解法制備的模板DNA純度較差。試劑盒法制備的模板DNA含量較低，為41.2ng/uL ，OD260/0D280比值為1.90，OD260/OD230的比值為2.37，純度較好。煮沸裂解法制備的模板 DNA 含量較高，為 120.9ng/uL ，OD260/OD280的比值為1.98，OD260/0D230的比值為1.89，純度較好。純凈的DNA的OD260/OD280比值在 1.7～2.0 之間，OD260/OD230 比值在1.8＼～2.2之間。

2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測結果及分析

采用ImageJ軟件對 100bp 處的電泳條帶進行分析，結果顯示，自動提取法、煮沸裂解法、SDS法、改良SDS法、試劑盒法的灰度值依次為37、56、38、41和22，其中煮沸裂解法的灰度值最高（見圖1）。

2.3常規PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果及分析

只有煮沸裂解法制備的模板在稀釋度為 10⁰ ＼～10⁴ 時可以通過常規PCR法檢測到（見表2，圖2（a）），自動提取法、試劑盒提取法制備的模板在稀

1：自動提取法;2：煮沸裂解法;3：SDS法;

4：改良SDS法;5：試劑盒法;M：Marker

釋度為 10^°～10³ 時可以通過常規PCR法檢測到，但在稀釋度為 10⁴ 時不能通過常規PCR法檢測到（見表2，圖2（b）、2（c））。SDS裂解法和改良SDS裂解法制備的模板未稀釋時不能通過常規PCR法檢測到，稀釋后模板的稀釋度在 10¹～10⁴ 時可以通過常規PCR法檢測到（見表2，圖2（d）、2（e））。因此，在進行常規PCR法檢測時，煮沸裂解法是模板制備的最優方法。

2.4熒光定量PCR結果及分析

對獲得的DNA模板進行10倍系列稀釋后，得到DNA模板原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液、1 000 倍稀釋液、10000倍稀釋液和100000倍稀釋液，將上述稀釋液分別作為模板進行熒光定量PCR檢測，檢測結果如圖3所示。圖3（a）3（c）、3（e）3（g）3（i）上標注的1＼～6依次為以DNA模板原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液、1000倍稀釋液、10000倍稀釋液和100000倍稀釋液為模板進行熒光定量PCR檢測的擴增曲線。

SDS裂解法和改良SDS裂解法未經稀釋的模板（稀釋度為 10⁰ ）在進行熒光定量PCR檢測時均未檢測到相對應的擴增曲線和熔解曲線，CT值為空白（見表3），但這兩種方法制備的模板在 10¹～ 10⁴ 稀釋度時均在熒光定量PCR中被檢測到（見圖3（e）σ，3（g）σ， 。其他3種方法制備的模板，在 10⁰～ 10⁴ 稀釋度時均在熒光定量PCR中被檢測到。只有煮沸裂解法制備的模板在稀釋度為 10⁵ 時仍能被熒光定量PCR法檢測到（見圖3（c），擴增曲線6），其CT值為32.2，其他方法在該稀釋度時均未被檢測到（見圖3（a 。因此，在進行熒光定量PCR檢測時，煮沸裂解法是模板制備方法中的最優方法。

對5種方法制備的模板進行熒光定量PCR檢測時，其熔解曲線均為單峰，峰的位置均在 82.5± 0.2^°C （見圖 3（b）、3（d）、3（f）、3（h）、3（j）） ，特異性良好。熔解曲線的峰值和峰面積與模板DNA的含量正相關。例如：試劑盒法的擴增曲線1為模板DNA原液的擴增曲線（見圖3（a）），與其他稀釋度相比，模板中DNA含量最高，其擴增曲線的CT值最小，為16.37（見表3），位置最靠前；與擴增曲線對應的熔解曲線（與擴增曲線顏色一致）的峰值最高，峰面積最大（見圖3（b））。試劑盒法中的擴增曲線5為稀釋度為 10⁴ 模板DNA的擴增曲線（見圖3（a）），與其他稀釋度相比，模板中DNA含量最低，其擴增曲線的CT值最大，為25.9（見表3），位置最靠后；與擴增曲線對應的熔解曲線（與擴增曲線顏色一致）的峰值最低，峰面積最小（見圖3（b））。

3結束語

在PCR檢測中，模板DNA的制備方法主要有酶法、物理法、化學法等，但缺少對模板制備方法的系統比較研究。本研究采用煮沸裂解法、SDS裂解法、改良SDS裂解法，試劑盒提取法以及儀器自動提取法5種方法，分別從金黃色葡萄球菌培養物中提取模板DNA，并進行常規PCR和熒光定量PCR檢測。實驗結果表明，煮沸裂解法是最優的制備模板DNA的方法。煮沸裂解法制備的模板，在稀釋度為 10^°～10⁵ 時，檢測到6條擴增曲線，均在金黃色葡萄球菌熒光定量PCR檢驗中檢出。其稀釋度在 10^°～10⁴ 時，均在金黃色葡萄球菌常規PCR檢驗中檢測到電泳條帶。SDS裂解法、改良SDS裂解法制備的模板DNA，其原液在金黃色葡萄球菌熒光定量PCR中均未檢測到對應的擴增曲線1。其原液在金黃色葡萄球菌常規PCR的凝膠電泳中均未檢測到對應的電泳條帶，灰度值均為0。因此，SDS裂解法、改良SDS裂解法制備的模板DNA，其原液在金黃色葡萄球菌熒光定量PCR和常規PCR中均未檢出。SDS裂解法、改良SDS裂解法、試劑盒提取法以及儀器自動提取法制備的模板DNA，在 10⁵ 這個稀釋度時的金黃色葡萄球菌熒光定量PCR檢驗中均未檢測到對應的擴增曲線6。試劑盒提取法以及儀器自動提取法制備的模板DNA在 10⁴ 這個稀釋度時的金黃色葡萄球菌常規PCR檢驗中均未檢測到對應的電泳條帶，其灰度值均為0。SDS裂解法、SDS與加熱裂解結合法制備模板的過程中使用了SDS裂解液，該成分對后續PCR檢測產生干擾，由于原液中SDS含量多、干擾大，因此未能檢出。通過對樣品進行稀釋，干擾減小，故其他稀釋度均檢出模板DNA。試劑盒提取法以及儀器自動提取法制備模板時，由于過程復雜，提取步驟多，模板DNA損耗大，因此在稀釋度過大時未能在PCR中檢出。煮沸裂解法制備模板DNA時使用試劑少，制備步驟少，避免了上述問題

該研究僅限于上述5種模板DNA制備方法的比較分析，并且僅限于金黃色葡萄球菌的PCR檢驗，有一定的局限性。今后研究工作應擴大模板制備方法的范圍，開展多種細菌的PCR法檢驗，提高了研究成果的適用性。

本研究中，煮沸裂解法與其他4種提取方法相比，操作簡單，儀器配置和試劑要求較低，且獲得的模板DNA的質量和含量均較好，在常規PCR和熒光定量PCR中均能檢出。采用熱裂解法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA作為檢測模板，簡化了使用試劑盒等常規提取步驟，大大降低了檢測成本，并且方法的重復性好，PCR檢驗中易檢出，操作簡單，值得推廣。

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（責任編輯 柴智;責任校對 白麗媛）