貯藏溫度和芽孢桿菌添加對高丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)和硝酸鹽含量的影響

中圖分類號：S153 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2025）05-1669-08

Abstract：The aim of this study was to investigate the effects of storage temperature and Bacillus aditives on the fermentation quality，nutritive value and nitrate contents of sorghum-sudangrass （Sorghum bicolorX sudanense）silage，and to provide atheoretical basis forthe improvementof the fermentation characteristics and nutritional value of sorghum-sudangrass silage at low-temperature. The experiment included two storage temperatures （ 15^°C and 25^°C ） and four types of additives （control group，Bacillus coagulans，B. licheniformis，and B subtilis at 1.0×10⁵ cfu·g^-1 FM）.The results showed that compared with 25^°C ，the contents of neutral deter gent fiber， lactic acid and acetic acid were significantly decreased，and the pH and water-soluble carbohydrate were significantly increased at 15^°C storage temperature （Plt;0.05） .When the storage temperature was 15^°C the nitrate content of the thre Bacillus treatments was significantly decreased compared with the control group 0 ?lt;0.05 ）．Theaddition of B .subtilis significantly increased the content of lactic acid and decreased the pH and soluble carbohydrate content of silage （ ?Plt;0.05 ）；inoculation with B . licheniformis significantly decreased the content of nitrite and soluble carbohydrate ?Plt;0.05） . In conclusion，compared with 15^°C ， 25^°C storage conditions significantly improved the fermentation quality of sorghum-sudangrass silage，and B .subtilis signifi cantly improved the fermentation quality of silage at 15^°C storage temperature and promoted the degradation of nitrate.

Key words：Sorghum-sudangrass; Silage ;Bacillus; Temperature ;Nitrate ;Fermentation quality

高丹草（SorghumbicolorXsudanense）為禾本科一年生優(yōu)質(zhì)飼草，是以高梁［Sorghumbicolor（L.）Moench]和蘇丹草[Sorghumsudanense（Piper）Stapf]雜交培育而成，聚集了高梁與蘇丹草生物產(chǎn)量高、再生性強、含糖量高、抗旱、耐鹽性強，適應(yīng)性廣等優(yōu)良特點，在北方農(nóng)區(qū)逐漸受到廣大種養(yǎng)戶的青睞[1]。高丹草含水量高，且生長季在雨季，不易加工成干草，適宜進行青貯，調(diào)制成功的青貯飼料能較好地保持高丹草的營養(yǎng)特性，具有柔嫩多汁、氣味芬芳、適口性好、消化率高等優(yōu)點[2]。

由于禾本科牧草自身不具備固氮能力，其生長發(fā)育所需的氮素主要依靠根系從土壤中吸收，但土壤中可利用的氮素往往難以滿足禾本科牧草高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的需要[2]。因此，氮肥是飼草產(chǎn)量和養(yǎng)分積累的重要保障。研究發(fā)現(xiàn)，高丹草硝酸鹽含量隨著施氮量的增加而增加，導(dǎo)致高丹草青貯原料中的硝酸鹽大幅增加[4]。硝酸鹽是植物吸收氮素的一種形態(tài)，它能被植物機體同化為氨基酸或氨，作為植物自身合成蛋白質(zhì)的氮源，但當植物吸收硝酸鹽的量超過還原與同化的量時，則就造成硝酸鹽的累積[5]。飼喂了含有高濃度硝酸鹽的青貯飼料時，硝酸鹽會在瘤胃中被還原為亞硝酸鹽，導(dǎo)致動物中毒[。

高丹草可一年多次刈割利用，北方地區(qū)在高丹草后期劉割時環(huán)境溫度較低，日平均氣溫在 15^°C 左右，導(dǎo)致青貯時的溫度低于最適溫度[。貯藏溫度在青貯飼料生產(chǎn)中起著重要作用，不同的貯藏溫度顯著影響青貯發(fā)酵品質(zhì)。研究表明，低溫會導(dǎo)致青貯飼料的pH值升高，十物質(zhì)損失增加，且在青貯期間pH值下降速度緩慢，抑制微生物的活性，減緩青貯發(fā)酵的效率，降低青貯品質(zhì)[8。目前，有關(guān)高丹草低溫青貯的研究較少，且尚缺乏有效提高高丹草青貯飼料品質(zhì)的手段。

用微生物添加劑改善青貯發(fā)酵品質(zhì)是常用的青貯技術(shù)措施，可在青貯初期通過促進有益菌快速增殖迅速降低青貯飼料pH值，抑制有害微生物[9]。

芽孢桿菌是一種新型青貯添加劑，研究表明，芽孢桿菌作為添加劑可產(chǎn)生纖維素酶，釋放出可溶性糖，促進乳酸菌增殖，同時還能抑制霉菌和酵母菌等不良微生物，改善發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性[10-12]。Zhao等[13研究發(fā)現(xiàn)，在高丹草中添加枯草芽孢桿菌可提升高丹草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，降低青貯飼料中的硝酸鹽含量。青貯添加劑中的菌株通常是在相對溫暖的溫度下篩選所得，因此在低溫下的部分功能可能會受損，導(dǎo)致其原有功效喪失[14-15]。芽孢桿菌抗逆性強，能夠在熱處理和低溫貯藏過程中表現(xiàn)出優(yōu)良的穩(wěn)定性[16]。但芽孢桿菌在低溫條件下對高丹草青貯品質(zhì)的改善效果尚未見報道。

因此，本試驗以芽孢桿菌為添加劑調(diào)制高丹草青貯飼料，將其分別置于 15^°C 和 25^°C 的環(huán)境中貯藏，假設(shè)芽孢桿菌在低溫條件下能夠降解硝酸鹽，并且可以改善青貯品質(zhì)。探究不同的貯藏溫度和芽孢桿菌添加劑對高丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)與營養(yǎng)成分的影響，以及為高丹草青貯飼料的生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗種植區(qū)在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)百草園科研基地 ，位于遼寧省沈陽市沈河區(qū)，屬河流沖積平原，土壤為棕壤。年平均氣溫為 6.7～ 8.4^°C ，無霜期為 150～170d ，年平均降水量 600～ 800mm ，主要集中在7一8月，屬溫帶季風氣候。

試驗材料高丹草品種為‘冀草二號’，是二茬再生草，達到 1.4m 進行劉割，留茬高度為 15cm 。青貯添加劑分別為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulans），活菌量為 2.0×10¹⁰ cfu·g^-1 ;地衣芽孢桿菌（ B .licheniformis），活菌量為 2.0×10¹⁰ cfu·g^-1 ;枯草芽孢桿菌 （B， subtilis），活菌量為 2.0×10¹⁰ cfu·g^-1 ，選自威凱海思生物工程有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用雙因素設(shè)計，第一個因素為溫度，采用 15^°C 和 25^°C 。第二個因素為不同的芽孢桿菌，分別為對照組（CK），凝結(jié)芽孢桿菌（BC， 1.0×10⁵ cfu·g^-1） ，地衣芽孢桿菌（ .BL，1.0×10⁵ cfu·g^-1 ），枯草芽孢桿菌 （BS，1.0×10⁵ cfu·g^-1. ，共8個處理，每個處理設(shè)置4次重復(fù)。將劉割后的高丹草后用植物粉碎機（ZTO.8，東港新農(nóng)機械有限公司）粉碎至 1～ 2cm ，迅速帶回實驗室將配置好的菌液分別均勻地噴灑于青貯飼料中，菌液用量為 ，對照組使用等量的無菌水。隨機稱取 250g 高丹草裝入青貯袋，真空密封。用聚乙烯袋 （20cm×30cm ）進行青貯，置于 15^°C 和 25^°C 生理生化培養(yǎng)箱中，青貯80d后開袋取樣測定。

1.3 指標測定及方法

取高丹草青貯飼料 10g ，加入 90mL 蒸餾水，混合均勻在 4^°C 下保存 ^18h ，用 0.22μm 濾膜過濾取浸提液，用于測量發(fā)酵指標。使用 pH 計（PB-lO，SartoriusGroup）測定浸提液的pH值；乳酸（Lacticacid，LA），乙酸（Aceticacid，AA）及丁酸（Butyricacid，BA）含量采用高效液相色譜法測定（Watersl525，WatersCorporation），配備色譜柱（H-HP5，蘇州賽分科技股份有限公司）；2.5μmol?L^-1 硫酸流動相，流速 0.6mL?min^-1 ；柱溫 55^°C ；示差檢測器（Waters2414，WatersCorporation），檢測波長 210nm ;進樣量 10μL^[4] 。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定高丹草青貯飼料氨態(tài)氮（Ammonianitrogen，AN）含量[17]。采用平板計數(shù)法，分別使用MRS瓊脂培養(yǎng)基（MRSagar）和結(jié)晶紫中性膽鹽瓊脂（Violet-RedBileAgar）培養(yǎng)基測定高丹草青貯飼料的乳酸菌和大腸桿菌的數(shù)量[18]

將高丹草青貯飼料樣品置于 105^°C 烘箱中烘 20min 后取出，置于 65^°C 烘箱中烘 48h 至恒重后，計算干物質(zhì)（Drymatter，DM）含量。采用凱氏定氮法測定粗蛋白（Crudeprotein，CP）含量[19]；依據(jù)范氏法采用纖維儀（A20Oi，ANKOM）測定中性洗滌纖維（Neutraldetergentfiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Aciddetergentfiber，ADF）[2o]；蒽酮硫酸比色法測定可溶性碳水化合物（Watersolublecarbohydrate，WSC）含量用葡萄糖制作標準曲線，加入 80% 乙醇，置于 80^°C 水浴中提取 30min ，冷卻過濾定容，在待測液中加入蒽酮硫酸，在 640nm 波長下測定吸光度，通過標準曲線計算其所含WSC含量[20]。稱取 5g 干燥樣品，然后在 180r?min^-1 下振蕩 20min 并通過0.22μm 濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定硝酸鹽與亞硝酸鹽的含量（Watersl525，WatersCorpora-tion）。配備色譜柱（NH2P-504E，ShimadzuCorporation）;流動相，磷酸鹽緩沖液;流速為 0.8mL?min^-1 柱溫 40^°C ；檢測器，紫外線檢測器（Waters2489，WatersCorporation）;波長 210nm ;進樣體積為 10μL^[21] 車

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)通過Excel2019初步整理后，采用SPSS26.0軟件進行雙因素方差分析，兩個因素互作時，用Duncan氏對各組進行多重比較和獨立樣本T檢驗進行比較， 為差異顯著。利用Origin2022軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高丹草原料特性

高丹草青貯原料屬性如表1所示。原料高丹草的pH值為5.65，高丹草青貯前的含水量較高，達到82% 左右；WSC的含量為 11.78%DM ;CP含量為11. 95%DM ；NDF和ADF的含量分別為52.42%DM 和 19.24%DM 。硝酸鹽含量為2570.22mg?kg^-1DM ；乳酸菌數(shù)量低于5lgcfu g^-1 FM，且檢測到大腸桿菌數(shù)量為 M。

2.2貯藏溫度和添加劑對高丹草青貯飼料發(fā)酵品 質(zhì)的影響

由表2可知，貯藏溫度顯著影響 pH 、有機酸和AN的含量 （Plt;0.05） 。在 15^°C 條件下， pH 值顯著高于 25^°C ，LA和AA含量顯著低于 25^°C（Plt;0.05） 。芽孢桿菌添加劑顯著影響有機酸和AN的含量（ Plt; 0.05），貯藏溫度和添加劑對AA以及AN含量存在交互作用 （Plt;0.05） 。在 15^°C 條件下，BS處理的 pH 值顯著低于CK（ Plt;0.05） ，LA的含量顯著高于CK P lt;0.05） ；在 25^°C 條件下，BS處理LA含量高于CK，但無顯著性差異。在兩個貯藏溫度下，BC處理的AA含量均顯著高于（ ;貯藏溫度 25^°C 時，BL和BS處理的AA含量顯著高于 。在 25^°C 條件下，BS處理的AN含量顯著高于 。在高丹草青貯飼料中未檢測到丁酸的存在。貯藏溫度和添加劑并未對乳酸菌數(shù)量產(chǎn)生顯著性影響，但在15^°C 條件下，芽孢桿菌處理組與CK相比有一定的上升趨勢。在青貯飼料中未檢測到大腸桿菌。

2.3貯藏溫度和添加劑對高丹草青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，貯藏溫度對WSC和NDF的含量有顯著影響（ Plt;0.05） 。在貯藏溫度為 15^°C 時，WSC含量顯著高于2 ，NDF的含量顯著低于 。芽孢桿菌添加劑顯著影響高丹草飼料中的WSC含量（ Plt; 0.05）。BL和BS處理的WSC含量顯著低于CK（ ，BC處理的WSC含量與CK差異不顯著。

2.4貯藏溫度和添加劑對高丹草青貯飼料硝酸鹽 含量的影響

如圖1（A）所示，貯藏溫度對硝酸鹽含量存在顯著影響，CK的硝酸鹽含量在貯藏溫度 15^°C 時顯著高于 25^°C（Plt;0.05） 。芽孢桿菌添加劑顯著影響硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量 （Plt;0.05） 。在貯藏溫度15^°C 時，三種芽孢桿菌處理組的硝酸鹽含量均顯著低于 ，但在貯藏溫度 25^°C 時，硝酸鹽含量顯著高于CF ∴（Plt;0.05） 。圖1（B）所示，貯藏溫度 15^°C 時，BL處理的亞硝酸鹽含量顯著低于CK（Plt;0.05）

3 討論

3.1貯藏溫度和添加劑對高丹草青貯飼料發(fā)酵品 質(zhì)的影響

貯藏溫度是影響青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要因素之一。研究表明，貯藏溫度通過影響乳酸菌的活性而改變pH值，在適宜溫度范圍內(nèi)，pH值隨溫度的升高呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，提高了青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[22-23]。本試驗也得出類似結(jié)論，這可能與 15^°C 低于乳酸菌發(fā)酵的適宜溫度，部分乳酸菌的生長受到限制有關(guān)。秦麗萍等[24]研究垂穗披堿草（ElymusnutansGriseb.）青貯發(fā)現(xiàn)，與 15^°C 處理相比， 25^°C 處理明顯增加了乳酸含量，本試驗得出的結(jié)論與其研究結(jié)果一致。由于溫度升高有利于乳酸菌活動，快速產(chǎn)酸，而在低溫條件下貯藏的高丹草乳酸含量降低。在 15^°C 下的乙酸含量低于 25^°C ，這可能是由于溫度對微生物菌群活動的影響。在一定溫度范圍內(nèi)AA含量隨溫度的上升而升高，這與張丙云等[25]研究結(jié)果一致。在 15^°C 的貯藏溫度下，AN含量顯著低于 25^°C ，Liu等[2也報道了相似的結(jié)果。青貯飼料中AN的積累受到植物蛋白酶的活性影響，植物蛋白酶在較高溫度時的水解活性更高，導(dǎo)致了青貯飼料里AN含量更高[27]。

本試驗中在 15^°C 條件下，BS處理的pH顯著低于CK，LA的含量顯著高于CK，Bai等1研究表明枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生抗菌肽物質(zhì)，加速乳酸菌的活動，增加乳酸含量，改善青貯發(fā)酵，抑制不良細菌的生長。說明在高丹草青貯飼料添加枯草芽孢桿菌可促進青貯過程中乳酸的產(chǎn)生從而降低 pH^[28] 。適量的AA，可以抑制酵母菌生長，提高有氧穩(wěn)定性[29]。在本試驗中乙酸含量增加，這一發(fā)現(xiàn)與Bai等[10]和Xu等[30]的研究結(jié)果一致，即芽孢桿菌作為添加劑有利于提高青貯飼料中AA含量。蛋白被多種厭氧微生物消耗代謝轉(zhuǎn)化成AN和胺類物質(zhì)，因此AN的含量間接反映出青貯飼料中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)消耗[31]。朱佳文等[32]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌能降低AN的含量，在本試驗中，貯藏溫度 25^°C 的條件下，BS處理組的AN含量高于對照，但仍不足 5%TN ，分析可能與原料屬性的差異有關(guān)，此研究結(jié)果有待進一步驗證。

青貯飼料中微生物的種類和數(shù)量直接影響青貯發(fā)酵品質(zhì)，其中乳酸菌是青貯發(fā)酵的關(guān)鍵微生物[32]。乳酸菌數(shù)量一般需達 5lg cfu·g^-1 以上才易保障青貯發(fā)酵質(zhì)量[34]。本研究中高丹草原料附著乳酸菌數(shù)量僅為 3.76lg cfu. g^-1 ，乳酸菌數(shù)量少，且大腸桿菌的數(shù)量較高 （5.37lg cfu·g^-1） ，可能會影響高丹草青貯發(fā)酵品質(zhì)。本試驗中添加芽孢桿菌對乳酸菌的數(shù)量無顯著影響，可能是在青貯后各組的乳酸菌數(shù)量已經(jīng)達到優(yōu)質(zhì)飼料的特征且整體的pH值較低，已經(jīng)處于一個較酸的環(huán)境，不適宜乳酸菌的增長[35]。青貯發(fā)酵后的pH值迅速下降，而大腸桿菌適宜生存環(huán)境 pH 值在 5.3～9.2 之間[3]，本試驗中未檢測到大腸桿菌。

3.2貯藏溫度和添加劑對高丹草青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

青貯飼料在不同溫度下貯藏對DM含量無顯著性影響[3，本研究也得到類似結(jié)論。WSC作為青貯過程中微生物發(fā)酵的主要基質(zhì)，其含量對青貯品質(zhì)有著較大影響[38。高丹草原料的WSC含量較高（11. 78% DM），達到了制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料并良好保存的標準[39]。本試驗中低溫條件抑制了微生物的活動，減少了WSC的消耗，因此 15^°C 條件下的WSC含量高于 25^°C 。呂竑建等4報道不同貯藏溫度對辣木（MoringaoleiferaLam.）發(fā)酵品質(zhì)的影響，可以得出NDF的含量隨溫度升高而增加。與本試驗結(jié)論相同。ADF的主要成分是木質(zhì)素和纖維素，很難在短期內(nèi)被微生物分解[25]。本研究中ADF含量未受到溫度的影響，李茂等[41]對不同溫度下王草[PennisetumpurpureumSchumacher ?×P. glaucum（Linnaeus）R.Brown]的發(fā)酵品質(zhì)的影響研究也得出類似結(jié)論。

玉米（ZeamaysL.）青貯飼料發(fā)酵過程中添加枯草芽孢桿菌能夠提高CP含量[42]，本試驗中添加芽孢桿菌對CP的含量無顯著影響，說明芽孢桿菌并不參與蛋白的降解。BC處理的WSC含量顯著高于其他芽孢桿菌處理，Wang等43對凝結(jié)芽孢桿菌處理下苜蓿（MedicagosatiuaL.）發(fā)酵特性的研究得出，凝結(jié)芽孢桿菌減少WSC的消耗，本試驗得出與其相同的結(jié)論，可能是因為BC起到抑制不良微生物生長的作用并減少了WSC的消耗。BL與BS處理下的WSC含量低于CK，這種現(xiàn)象可能是由于纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶的酶促作用，它們都能水解植物細胞壁中的碳水化合物，從而釋放出可溶糖用于發(fā)酵[44]。穆勝龍等[45]用枯草芽孢桿菌和布氏乳桿菌青貯甘蔗尾（SaccharumofficinarumL.）發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以降低NDF和ADF的含量。朱佳文等[46]用復(fù)合芽孢桿菌對桑葉（MorusalbaL.）發(fā)酵品質(zhì)的研究表明，NDF和ADF含量均呈下降趨勢，說明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌都具有降解纖維的作用。本研究中添加芽孢桿菌處理的NDF和ADF含量在 15^°C 下有下降趨勢，但無顯著差異，可能與原料和貯藏條件的差異有關(guān)。

3.3溫度和添加劑對高丹草青貯飼料硝酸鹽含量 的影響

青貯前原料高丹草的硝酸鹽含量為2570.22mg?kg^-1 DM，在 25^°C 下青貯過后的各個處理硝酸鹽的含量均低于原料值，這說明了在青貯過程中能夠降解部分的硝酸鹽，與韓立英等4在玉米青貯中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類似。研究表明，帕諾桿菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬與高丹草的硝酸鹽含量呈負相關(guān)[21]。呂文龍等[48]的研究表明，在青貯發(fā)酵的過程中腸桿菌是降解硝酸鹽的主要微生物。根據(jù)潘港49的報道，在一定的溫度范圍內(nèi)硝酸鹽含量隨溫度的升高而降低，在本試驗中在 15^°C 下硝酸鹽含量高于 25^°C ，與其結(jié)果一致。可能是由于腸桿菌在25^°C 活性更好，促進硝酸鹽的降解。Zhao等[13]的研究發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌能夠促進硝酸鹽的降解，本試驗在低溫貯藏條件下，三種芽孢桿菌添加劑顯著降低了硝酸鹽的含量。可能是由于芽孢桿菌的抗逆性強，在低溫下也能發(fā)揮效果。本試驗中在25^°C 下添加芽孢桿菌并未起到降解硝酸鹽的作用，可能是在 25^°C 下菌群比較活躍，在發(fā)酵過程中與硝酸鹽降解有關(guān)的細菌和芽孢桿菌存在競爭關(guān)系，但還有待進一步的研究證實。

4結(jié)論

貯藏溫度和芽孢桿菌添加劑顯著影響了高丹草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和硝酸鹽降解程度。與15^°C 相比，在貯藏溫度為 25^°C 時，顯著提高了高丹草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，促進了硝酸鹽的降解。在15^°C 下，3種芽孢桿菌添加劑均顯著降低了高丹草青貯飼料的硝酸鹽含量，BS處理還顯著提高了發(fā)酵品質(zhì)。綜上，在 25^°C 下高丹草青貯飼料具有更好的發(fā)酵品質(zhì)，低溫下不利于高丹草的發(fā)酵；添加枯草芽孢桿菌可以改善高丹草在低溫條件下的青貯發(fā)酵品質(zhì)以及促進硝酸鹽的降解。

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（責任編輯付宸）