金花菌ISSR-PCR反應體系的建立與優化

中圖分類號：Q949.32 文獻標志碼：A

Abstract： 【Objective】 Golden flower fungus is a kind of potential probiotic fungus in black tea. It can give tea a unique taste，and has a variety of health care effects such as supplementing vitamins and minerals for human，producing saliva to quench thirst，breaking down greasiness，reducingfat and losing weight，and is one of the important indexes to evaluate the quality of Fuzhuan tea and Liubao tea. In this study，the genetic diversity and structure of golden flower fungus were analyzed，and the ISSR-PCR reaction system of golden flower fungus was established and optimized， aiming to provide a method for further systematic study of the genetic diversity and intraspecific and interspecific relationships of golden flower fungus using ISSR molecular marker technology. 【Method】In this study，the DNA of Aspergillus cristatum was used as a template，single-factor experiments were used to optimize the amount of template DNA，primer， PCR Mix and ISSR-PCR cycle number that affect the ISSR-PCR reaction system. The stability of the reaction system was verified by the strains of four golden flower fungi species，A.cristatum，A. chevalieri，，A. pseudoglaucus and A. cibarius.【Result】An ISSR-PCR system for golden flower fungus was established，which consisted of 50ng/μL template DNA 0.3μL ， primer 0.8μL ，2SanTaq PCR Mix amount 9.0μL ， ddH₂O9.9μL ，and their total volume was 20μL . The ISSR-PCR reaction conditions were pre-denaturation at 94.0^°C for 5min ，denaturation at 94.0^°C for 30s ，annealing for 30s ，extension at 72.0^°C for 2min ，with a total of35 cycles；extension at 72.0^°C for 10min . The optimal ISSR-PCR reaction system was obtained through verifying four different golden flower fungi species stains，which showed its high polymorphism and repeatability.The optimized system was used to select 11 ISSR primers with high polymorphism and repeatability that could be used for genetic diversity analysis of golden flower fungus and their annealing temperatures were also determined. 【Conclusion】This study established and optimized the ISSR-PCR reaction system of golden flower fungus，and the results showed high polymorphism and repeatability， proving that it is a new method for the genetic diversity analysis of golden flower fungus.

Keywords： Golden flower fungus; ISSR-PCR；single factor test;reaction system

0 引言

【研究意義】金花菌是黑茶中一類潛在的益生真菌，金花在茶葉中表現為一種金黃色的顆粒狀物質，能賦予茶葉獨特的味道，同時具備補充人體所需維生素和礦物質、生津止渴、分解油膩、降脂減肥等多種保健作用（吉杰麗等，2016）。然而，不同學者在金花菌分類和命名上存有爭議，在一定程度上影響了金花菌優良菌種資源的開發和利用。研究金花菌的遺傳多樣性對于探索菌株遺傳變異規律和分類具有一定指導意義。【前人研究進展】金花菌存在于茯磚茶（趙仁亮等，2016；譚玉梅等，2017；劉蘭等，2021；趙宏朋等，2022；梁瑞娜等，2024）、青磚茶（陳云蘭等，2006）、康磚茶（陳云蘭等，2006）、普洱茶（馬燕等，2011；李肖宏等，2020）、六堡茶（毛彥等，2013；鄧慶森等，2014；歐惠算等，2017；周夢珍等，2018）、白茶（陳勇強，2016；吳鳳等，2021）等發酵型茶葉中，其中在茯磚茶和六堡茶中大量存在，是評價茯磚茶和六堡茶品質的重要指標之一（呂嘉等，2020；吳新惠等，2023）。金花菌在分類上一直存在爭議，許多學者認為金花菌是一類既可以以閉囊殼子囊孢子進行有性繁殖又可以以分生孢子進行無性繁殖的、形態學及生理生化特性類似的菌群，包括冠突曲霉（A.cristatum）、謝瓦氏曲霉（A.chevalieri）、灰綠曲霉（A.glaucus）、阿姆斯特曲霉（A.amstelodami）等分類歸在散囊菌屬（Eurotium）和曲霉屬（Aspergillus）曲霉組內的物種，并以A.cristatum分布最為廣泛（丁婷，2012；趙仁亮等，2016；呂嘉等，2018，2019）。除了分類方面的爭議，金花菌的命名也存在爭議，以曲霉屬還是散囊菌屬命名，如以冠突曲霉命名還是冠突散囊菌（E.cristatum）命名，不同學者有不同看法，加之金花菌在培養基上菌落形態多樣，其分類至今未有明確的定論（呂嘉析等，2020）。探討金花菌的種內和種間遺傳關系可為金花菌的分類和命名提供依據。隨著分子生物學的發展，分子標記已成為群體遺傳研究的重要手段，ISSR（inter-simplesequence repeat）、RFLP（restriction fragment lengthpolymorphism）和 SSR（simple sequence repeat）等分子標記技術被廣泛應用，其中ISSR具有快速、高效、靈敏且操作簡單、成本低廉、穩定性與重復性高等優點，已被應用于各類真菌，如黃曲霉（A.fla-vus）（張初署，2013）、疫霉菌（Phytophthora sp.）（MOHAMMADBAGHERIetal.，2021）、鐮孢菌（Fusariumsp.）（孫常青等，2019；王喜剛等，2020）、黑粉菌（Ustilagosp.）（張家齊等，2019）、鏈格孢菌（Alternariasp.）（楊濤等，2018）、炭疽菌（Colletotri-chumsp.）（王義勛等，2024）、羊肚菌（Morchella sp.）（朱西強等，2024）等的遺傳多樣性、種間及種內關系和群體遺傳分化等研究。不同真菌的最優ISSR-PCR反應體系不同，且ISSR-PCR易受反應體系中多種因素的影響，可能會出現不一樣的擴增結果從而影響多態性分析（徐玉梅等，2011）。為了確保結果的穩定性，需要提前摸索ISSR的最優反應體系。關于金花菌遺傳多樣性研究的相關報道較少。劉石泉（2014）從30條10堿基隨機引物篩選6條引物對不同產地茯磚茶中的5株優勢金花菌進行了RAPD分析，認為不同產地的優勢金花菌存在明顯差異。王亞麗（2018）采用酯酶同工酶電泳技術對18株金花菌進行分類，在相似水平為 77% 時可分為三類。胡治遠（2021）基于金花菌菌體轉錄組測序數據，通過查找SSR位點，篩選獲得30條EST-SSR引物，在遺傳相似系數為0.983的水平上15株金花菌可分為5個類群。【本研究切入點】目前國內外對金花菌遺傳多樣性的研究甚少，ISSR分子標記技術用于金花菌遺傳多樣性和菌種資源鑒定的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】為明確金花菌的ISSR-PCR最優反應體系，本研究對ISSR-PCR的影響因素進行優化，旨在為進一步利用ISSR分子標記技術系統研究金花菌遺傳多樣性及其種內種間親緣關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為分離并保存的4株金花菌菌株，前期經形態學和分子生物學分別鑒定為A.cristatum、A.chevalieri、假灰綠曲霉（A.pseudoglaucus） ?A cibari-us。選取冠突曲霉（A.cristatum）作為試驗菌株進行ISSR-PCR反應體系的優化。4株不同的金花菌菌株作為反應體系穩定性驗證的試驗菌株。

1.1.2 供試試劑

引物選自哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。真菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司； 2× SanTaqPCRMix、TAE、瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司；100bpPlusIIDNALadder購自北京全式金生物技術股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金花菌基因組DNA的提取

按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取金花菌基因組DNA，使用 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，紫外微量分光光度計測定濃度和純度，統一稀釋至濃度為 50ng/μL，4^°C 保存備用。

1.2.2 金花菌ISSR-PCR反應體系優化

選取冠突曲霉的DNA作為模板，使用初篩引物889（5'-AGAGAGAGAGAGAGAGCTC-3'）進行擴增，ISSR基礎反應體系為 50ng/μL 的模板DNA0.4μL，10μmol/μL 的引物 0.8μL 、 2× SanTaqPCRMix 10.0μL ， 補足至 20μL 。ISSR-PCR反應條件為： 94.0^°C 預變性 5min 94.0^°C 變性 30s 退火 延伸 2min ，循環次數為35次； 72.0^°C 終延伸 保存。對上述反應體系模板DNA、引物、PCRMix用量以及循環次數等4個因素進行單因素實驗（表1）。取 2μL 擴增產物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，PCR重復3次，根據3次的試驗結果，確定最優反應體系。

1.2.3ISSR引物及退火溫度的篩選和確定

使用獲得的最優反應體系，分別對參試ISSR引物進行篩選，通過設定不同的退火溫度進行優化驗證，根據擴增結果，選出條帶清晰可辨的組合，從而確定適用引物并獲得不同引物的最優退火溫度。

1.2.4ISSR-PCR最優反應體系的穩定性驗證

使用獲得的最優反應體系，從篩選出來的引物中隨機選取3條引物擴增4株不同的金花菌的DNA，進行反應體系穩定性驗證。

2 結果與分析

2.1模板DNA用量對金花菌A.cristatumISSR-PCR 的影響

不同模板DNA用量對金花菌A.cristatumISSR-PCR擴增結果有明顯影響。如圖1所示，在設置的8個不同模板DNA用量中，模板DNA用量為 0.1μL 時，擴增條帶數量較少且條帶較暗；模板DNA用量在 0.3～0.5μL 時，條帶數量基本一致，且擴增條帶清晰可見；模板DNA用量在 0.6～0.8μL 時，擴增條帶數量減少。為節省成本，選用 0.3μL 為最優模板DNA用量。

2.2 引物用量對金花菌A.cristatumISSR-PCR的 影響

不同引物用量對金花菌A.cristatumISSR-PCR擴增結果有明顯影響。如圖2所示，在設置的8個不同引物用量中，引物用量在 0.2～0.6μL 時，只有3條較明顯清晰可見的條帶，條帶數量較少；引物用量為 時，擴增的條帶數量較多且基本一致，條帶清晰可見。為節省成本，選用 0.8μL 為最優引物用量。

2.3PCRMix用量對金花菌A.cristatumISSR-PCR 的影響

不同PCRMix用量對金花菌A.cristatumISSR-PCR擴增結果有明顯影響。如圖3所示，在設置的8

M：100bpPlusIIDNALadder;1＼～8：模板DNA（ 50ng/μL 用量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μL M：100bpPlusIIDNALadder;1＼～8：TemplateDNA （50ng/μL ）dosages0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8μL

M：100 bpPlusIIDNALadder;1＼～8：引物 用量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μLM：100bpPlusIIDNALadder; 1～8： amountsof primer（ ）0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8μL個不同PCRMix用量中，PCRMix用量為 6.0～ 8.0μL 時，擴增條帶較亮的只有3條，條帶數量較少且條帶較暗；PCRMix用量為 時，條帶數量較多較亮，擴增條帶數量基本一致，條帶清晰可見。因此，選用 9.0μL 為最優PCRMix用量。

2.4PCR循環次數對金花菌A.cristatumISSR-PCR 的影響

不同PCR循環次數對A.cristatumISSR-PCR擴增結果的影響如圖4所示。PCR循環次數為15和20次時，無擴增條帶；PCR循環次數為25次時，條帶較暗且不明顯；PCR循環次數為30次時，部分條帶較暗，效果不明顯；PCR循環次數為35和40次時，條帶較亮較多，擴增條帶數量基本一致，條帶清晰可見。上述結果表明不同PCR循環次數對ISSR-PCR擴增結果有明顯影響，因此選用35次循環為最優PCR循環次數。

2.5金花菌ISSR-PCR引物的篩選及其退火溫度的確定

使用上述獲得的最優ISSR-PCR反應體系，通過設置引物的不同退火溫度，最終篩選獲得適用于金花菌遺傳多樣性分析的11條多態性、重復性高的ISSR引物（表2）。不同引物的不同退火溫度對ISSR-PCR的影響不同。如圖5所示，以引物834、881、888為例，使用上述獲得的最優ISSR-PCR反應體系進行ISSR-PCR，在6個退火溫度中，引物834、881、888分別在 46.0，50.0，46.0^°C 時條帶最多且條帶較亮，表明不同引物的退火溫度不同。

2.6金花菌ISSR-PCR最優反應體系的穩定性驗證

隨機選取表2中的3條引物，使用最優的反應體系，用4株不同種金花菌DNA對優化后的ISSR-PCR反應體系進行穩定性驗證，結果（圖6）顯示，4株供試菌株使用引物834、881、888擴增出的條帶

M：100 bp Plus IIDNALadder;1＼～8：Mix用量6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0 μLM：100bpPlusIDNALadder;1＼～8：amounts ofMix 6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0μL

M：100bpPlusIIDNALadder;1＼～6：PCR循環次數15、20、25、30、35、40次M：100 bpPlusIIDNALadder；1＼～6：number ofPCRcycles，15，20，25，30，35，40

Fig.5Effectsofdierentaealingtemperaturesofprimers834，881，nd8onISSR-CRforgoldenflowerfungusA.cstatum

M：100bpPlusIIDNALadder;1＼～6：引物834退火溫度 ：引物881退火溫度50.0、 52.0、54.0、56.0、58.0、60.0℃；13＼～18：引物888退火溫度 46.0，47.0，48.0，49.0，50.0，51.0^oC M： 100 bp Plus IIDNA Ladder; 1＼～6： Annealing temperatures for primer 834，42.0，44.0，46.0，48.0，50.0， 52.0^°C .

7＼～12：Annealing temperatures for primer 881，50.0，52.0，54.0，56.0，58.0， 60.0^°C ；13＼～18：Annealing temperatures for primer 888，46.0，47.0，48.0，49.0，50.0， 51.0^°C

明亮清晰，具有高多態性和可重復性，表明上述優化的ISSR-PCR反應體系適用于金花菌不同種的遺傳多樣性分析。

3 討論

ISSR-PCR是基于普通PCR的一種分子標記，雖然具有簡單高效等特點，但結果易受PCR反應體系及反應過程中多種因素的影響，例如模板DNA用量、引物用量、PCRMix用量、PCR循環次數、退火溫度等（王興紅和李紅葉，2016）。不同物種類型的ISSR-PCR反應體系及擴增程序均存在差異（包金花等，2022）。因此，在開展金花菌ISSR-PCR分子標記前有必要對其反應體系進行優化，以便獲得適用于該類真菌的ISSR最優反應體系。許多研究者通過單因素實驗分析建立和優化ISSR-PCR反應體系，如王興紅和李紅葉（2016）、陳丹和張曉芳（2017）、李朋朋等（2021）采用單因素實驗分析分別建立和優化了柑橘葉點霉菌、玉米彎孢病菌、玉米

Fig.6Results ofISSR-PCRamplificationof4 strains ofdifferent goldenflower fungispecies using primers 834，88land88：

M：100bpPlusIIDNALadder;1＼～4：引物834;5＼～8：引物881;9＼～12：引物888M：100 bp PlusIIDNALadder；1＼～4：primer834；5＼～8：primer 881；9＼～12：primer 888鞘腐病菌的ISSR-PCR反應體系。本研究應用單因素試驗分析，對可能影響ISSR-PCR擴增結果的模板DNA用量、引物用量、 2× SanTaqPCRMix用量、PCR循環次數等因素進行逐一優化篩選。研究發現，模板DNA用量過少時凝膠電泳所獲得的擴增條帶較暗且不清晰，引物用量較少或者PCRMix用量較少時PCR擴增條帶數量減少，PCR循環次數過少時無條帶或者條帶較暗不清晰。不同引物的最優退火溫度不同，溫度過高或者過低均會導致擴增條帶數量及明亮程度的改變，本研究通過使用優化后的反應體系，設置不同的退火溫度對ISSR引物進行篩選，最終獲得11條能夠擴增出條帶明亮清晰且穩定性高的ISSR引物。用A.cristatum、A.chevalieri、A.pseudoglaucus、A.cibarius4個種金花菌DNA對優化后的ISSR-PCR反應體系進行驗證，結果不同引物擴增出的條帶明亮清晰，具有高多態性和可重復性，表明本研究優化后的ISSR-PCR反應體系可用于后續金花菌菌種資源的鑒定以及遺傳多樣性分析。

4結論

本研究通過采用單因素實驗分析，對影響ISSR-PCR擴增結果的模板DNA用量、引物用量、Mix用量以及擴增循環次數4個因素進行優化，建立了適用于金花菌的最優ISSR-PCR反應體系：在總體積為 20μL 的反應體系中， 50ng/μL 的模板DNA用量 0.3μL，10μmol/μL 的引物用量 0.8μL 、Mix用量 9.0μL 補足 20μL 。ISSR-PCR反應條件： 94.0^°C 預變性 5min 94.0^°C 變性 30s ，退火30s，72.0^°C 延伸 2min ，循環次數為35次； 72.0^°C 終延伸 10min 。驗證結果表明，應用此方法可獲得具有高多態性和可重復性的結果，可用于后續金花菌菌種資源的鑒定以及遺傳多樣性分析。

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（責任編輯 謝紅輝）