微塑料和苯并[b]熒蒽暴露對泥蚶免疫的影響及其機理研究

中圖分類號：R994.6；Q172 文獻標志碼：A 文章編號：1674-3075（2025）03-0040-10

得益于優良的物化性質和低廉的價格，塑料被廣泛應用于醫療、交通、電子等眾多領域。當前全球塑料的年使用量已近3億t，其中約有 10% 會通過陸源、海源及人類活動等多種途徑進入海洋環境中（Thompsonetal，2024；李敏倩等，2024）。這些進入海洋中的塑料會在機械應力等作用下逐步碎片化，形成直徑小于 5mm 的微塑料（microplastics，MPs）。MPs的化學性質極為穩定，能夠在環境中長期存在，其對海洋生物的影響已引發全球關注（Wuetal，2023；Sharmaetal，2024）。相較于魚類和蝦蟹類，海洋雙殼貝類由于濾食特性以及相對較弱的運動能力更易受到MPs的影響（Xuetal，2024）。研究表明，MPs會干擾海洋雙殼貝類的生殖、幼體發育、生理代謝以及免疫應答等一系列生命過程（Dingetal，2022）。然而，除了自身的毒性效應，MPs較大的比表面積和疏水性，使它們亦可作為疏水性污染物的載體，促進其在環境中以及食物鏈之間的傳遞（Shietal，2020；Weietal，2023）。

近年來，海上溢油事故頻發，大量工業廢水和生活污水持續排入海洋，海洋環境中多環芳烴（PAHs）污染狀況日益惡化（Billahetal，2022）。苯并[b]熒蒽（Benzo[b]fluoranthene，BbF）作為PAHs的代表性化合物，其潛在毒性效應是目前國內外的研究熱點（Wangetal，2022）。然而，現有的研究主要集中在斑馬魚等模式生物的發育毒性和肝臟毒性，BbF對海洋生物的毒性機制及生態影響尚未充分闡明（Brancoetal，2021；Hawliczeketal，2021）。BbF具有苯環結構和較高的辛醇/水分配系數 （K_ow） ，可以與水體中的MPs等懸浮顆粒物發生吸附反應，致使其在水-沉積物界面區域呈現出較高的濃度分布（Liuetal，2021）。鑒于此，棲息在這些區域的底棲貝類等生物，極有可能同時遭受MPs與BbF的威脅，生存面臨嚴峻挑戰。此前，對蚯蚓（Eiseniafetida）的實驗發現，聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）的存在顯著加劇了BbF的毒性作用，使得蚯蚓的死亡率大幅攀升，生長也受到更為明顯的抑制（馬志峰，2021）。但MPs與BbF共同暴露對水生生物，尤其是沉積物周邊的底棲貝類等生物的影響目前仍不明確。

海洋動物的免疫防御能力對它們的生存和繁衍至關重要。貝類缺乏特異性免疫，主要依賴非特異性免疫來抵御外界病原體的侵染，識別和清除進入到體內的異己物質。血細胞吞噬是貝類的主要免疫防御手段之一，因此，血細胞的活力和組成穩定直接決定其免疫能力。盡管貝類的免疫系統是包括MPs和PAHs在內多種污染物的主要攻擊靶點（Shietal，2020；Tangetal，2022），但BbF對海洋雙殼貝類免疫的影響仍鮮有報道，MPs的存在是否會加劇其對貝類的毒性仍需深入研究。

泥蚶（Tegillarcagranosa）是典型的濾食性底棲貝類，主要分布于印度洋和太平洋沿岸，是我國沿海地區的傳統經濟養殖品種（Luetal，2023；Shietal，2022）。由于泥蚶棲息環境多為污染頻發的近岸水域，且其自身躲避污染物的能力和代謝凈化能力有限，更容易受到MPs和BbF等人源污染物的影響（Luetal，2023）。但是，目前MPs和BbF聯合暴露對泥蚶的影響尚未有報道。針對上述問題，本研究以泥蚶為研究對象，探究BbF和MPs聯合暴露對血細胞密度、血細胞組成以及吞噬率等血細胞免疫重要指標的影響。同時，為了揭示MPs和BbF暴露的致毒機理，本研究還對泥蚶代謝供能、血細胞活性氧（ROS）含量、細胞活性、DNA損傷程度，及免疫、調亡等信號通路中關鍵基因的表達量進行了分析。本研究有助于豐富MPs和BbF的生態毒理效應，可為貝類養殖產業科學應對環境污染問題提供理論依據。

1材料與方法

1.1樣品與試劑

成體泥蚶取自浙江省海洋水產養殖研究所清江基地，殼長 （37.9±5.13）mm 。實驗前，于室內水桶流水暫養2周（海水 pH8.09±0.04 ，鹽度 26.9‰ 0.1‰ ，溫度 25.3^°C±1.5^°C） ，期間每日早晚投喂活體扁藻（Tetraselmischuii）。根據已報道的方法（Sunetal，2021；Tangetal，2022），采集養殖區域的天然水體，檢測BbF和MPs濃度（均低于檢出限）。本實驗在浙江省海洋水產養殖研究所清江實驗基地進行。BbF粉末（CAS205-99-2，純度 gt;98% 和二甲基亞砜（DMSO;CAS67-68-5，純度 599% 購自上海麥克林生化科技股份有限公司。單分散PS微球（粒徑30μm） 購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，并在透射電子顯微鏡（JEM-1230，日本電子）下驗證其形態和尺寸。

1.2暴露實驗設置

暫養2周后，挑選600只大小一致、健康狀況良好的泥蚶，均分至以下5個實驗組：（1）空白對照組（砂濾海水），（2）MPs處理組 （0.26mg/L） ），（3）DMSO溶劑對照組，（4）BbF處理組 （2μg/L） ，（5）BbF與MPs復合處理組（BbF+MPs組， BbF2μg/L，MPs0.26mg/L） 。每組設3個 60L 水箱，每箱中飼養泥蚶40只，暴露實驗持續 30d 。鑒于目前海洋中檢測到的MPs成分多為PS，本研究選取PS微球用于暴露實驗（Turner，2020）。參考全球塑料廢物輸入量預測和污染區MPs質量濃度調查，設MPs濃度 0.26mg/L 以模擬未來海洋環境MPs污染情形（Goldsteinetal，2012）。據前期調查，部分污染嚴重水域的BbF濃度可達 2μg/L ，取 作為實驗濃度（Anyakoraetal，2005；Liuetal，2009）。實驗期間水箱持續充氣，早晚投喂活體扁藻，每日更換實驗海水，每2d檢測水體中MPs和BbF濃度。

1.3MPs和BbF暴露對泥蚶血細胞的影響

1.3.1血細胞分類與計數暴露結束，每組隨機挑選12只泥蚶用于血細胞計數和分類實驗。參照先前方法（Liuetal，2016），從外套膜腔抽取 200μL 血淋巴，加入戊二醛 （2.5%） 固定后用血球計數板計算血細胞數。抽取 700μL 血淋巴制血涂片，瑞氏染液染色（Shietal，2017），按朱澤聞等（2011）的方法，將血細胞分成紅色顆粒細胞、嗜堿性顆粒細胞和透明細胞，顯微鏡下統計種類和數量。為保證數據的可靠性，每個實驗樣本均隨機選取200個以上細胞用于統計。1.3.2血細胞吞噬暴露結束，每組取6只泥蚶，抽100μL 血淋巴與阿氏液等比例混合，加入 20μL 酵母懸液。混勻靜置 30min 后，制備血涂片并進行瑞氏染色。參考已報道的實驗方法（Shietal，2017），在顯微鏡下觀察并統計血細胞吞噬率。為保證數據的可靠性，每個試驗樣本均隨機選取200個以上細胞用于統計。

1.3.3血細胞活力暴露結束，每組取6只泥蚶并抽取血淋巴，用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（C0009S，碧云天）檢測血細胞活力（Sunetal，2021）。以空白對照組的細胞活力為基準（ 100% ），計算血細胞相對活力（Shietal，2020）。每次實驗每組均設3孔，取平均值，重復6次。

1.4血細胞損傷測定

1.4.1血細胞氧化損傷本研究通過檢測血細胞內ROS和丙二醛（MDA）水平測定氧化損傷程度。暴露結束，每組取6只泥蚶并抽取血淋巴，離心獲取血細胞后用熒光探針DCFH-DA（S0033，碧云天）檢測血細胞內的ROS含量。以空白對照組的熒光強度為基準（ 100% ），計算處理組的相對ROS含量（Tangetal，2022）。用MDA含量檢測試劑盒（BC0025，索萊寶）檢測MDA水平。收集血細胞按試劑盒要求加試劑孵育，檢測樣品在 532nm 和 600nm 處的OD值。每個樣品均留部分上清液檢測蛋白質濃度。通過標準曲線計算樣品MDA含量并使用蛋白質濃度校正。

1.4.2血細胞DNA損傷每組取6只泥蚶抽取血淋巴，用彗星電泳試劑盒（C2041S，碧云天）檢測血細胞DNA損傷。將重懸在PBS中的血細胞（ ?1×10⁶ 個 /mL ）與低熔點瓊脂糖混合，轉移至載玻片，黑暗中固化，用裂解緩沖液處理以釋放雙鏈DNA。 25V 電壓下電泳 15min 后，顯微鏡下記錄熒光圖像，使用ImageJ軟件量化DNA損傷程度（Shietal，2022）。

1.5MPs和BbF暴露對泥蚶代謝的影響

1.5.1耗氧率和排氨率測定暴露結束，每組取30只泥蚶，分至6個2L裝滿氧飽和海水的封閉玻璃呼吸瓶，瓶內水環境與實驗暴露條件相同。每組6個重復，每重復5只泥蚶，設置只有海水的呼吸器作空白對照。放入泥蚶待其適應 20min 后作為實驗起始時間，實驗持續 2h 。實驗前后各取 100mL 水樣測定氧含量和氨氮濃度。溶解氧用氧氣測定儀（Multi3410SET4，WTW測量，氨氮濃度用氣相分子吸收光譜法（HJ195—2023）測定。實驗結束剝離軟組織， 80^°C 烘干至恒重。根據已報道的方法（Zhaoetal，2017），計算耗氧率和排氨率。

1.5.2泥蚶血細胞ATP含量測定暴露實驗后，每組取6只泥蚶抽取血淋巴。使用ATP比色檢測試劑盒（ab83355，Abcam）測定ATP含量。將血細胞懸液裂解， 4^°C 下 13000r/min 離心 5min ，取 50μL 上清液與反應混合液等比混合。孵育 30min 后，用分光光度計（MultiskanGO）測樣本在 570nm 波長吸光度值。根據標準曲線，計算出樣品的ATP含量并用蛋白質濃度校正（ ）°

1.6熒光定量

暴露結束，每組取6只泥蚶，提取血細胞RNA并反轉錄為cDNA，使用Bio-RadCFX96系統進行實時定量PCR（qRT-PCR）。每組設置3個生物重復，每個樣本設置3個技術重復。選擇 NFκB 通路中的關鍵基因NFkB1（nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit）和TRAF6（TNF receptor associated factor 6）基因，細胞凋亡通路中的 BAX（Bcl-2 -associatedX）和Cas-pase-3基因，以及AHR-CYP通路中的AHR（aryl hy-drocarbonreceptor）、ARNT（aryl hydrocarbon receptornucleartranslocator） 和CYPlAl（cytochromeP4501A1）基因作為本研究的目的基因（Liuetal，2016；Hanetal，2019）。使用18SrRNA基因作為內參基因，采用2-△△C法計算基因表達量。引物由生工生物（上海）合成，引物序列列于表1。

1.7數據統計與分析

利用Levene's檢驗和Shapiro-Wilk's檢驗判斷數據的方差齊性和正態性。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey 檢 驗（post-hoctukeytests）檢測血細胞數量、吞噬率等數據在各實驗組間的差異。利用Duncan檢驗（duncanmultiplerangetest）分析組間目的基因表達水平差異是否顯著。所有統計分析均在OriginPro8.0軟件中完成，以 Plt;0.05 為確定數據間顯著性差異的標準，數據以平均值 ± 標準誤（Mean ± SE）呈現。

2結果與分析

2.1MPs和BbF暴露對泥蚶血細胞指標的影響

如表2所示，DMSO溶劑處理對泥蚶血細胞類群、密度和吞噬能力均無顯著影響 （Pgt;0.05） 。暴露30d后，MPs組和BbF組泥蚶血細胞密度較對照組顯著下降 （Plt;0.05） 。 BbF+MPs 組的泥蚶血細胞密度僅為 0.73×10⁸ 個 /mL ，較對照組與MPs和BbF單處理組均顯著降低 （Plt;0.05） 。與對照組相比，各處理組泥蚶的紅色顆粒細胞占比均顯著減小，MPs組和BbF組較對照組分別下降了 5.3% 和 6.4% ， BbF+MPs 組則下降了 10.8%（Plt;0.05） 。圖1顯示，MPs和BbF單一暴露使泥蚶血細胞吞噬能力顯著降低 （Plt;0.05） ，MPs組和BbF組的吞噬率僅為對照組的 87.89% 和 83.84% 。與單一處理組相比， BbF+MPs 組有更強的抑制作用，其吞噬率僅為對照組的 74.78% 0 _{（Plt;0.05）} 。

Different superscripts indicate significant differences between groups （Plt;0.05） Fig.1 Effects of BbFand MPs exposure onhaemocytephagocytosisofT.granosa

2.2MPs與BbF暴露對泥蚶血細胞的損害

如圖2所示，MPs和BbF暴露導致泥蚶血細胞活力活力明顯下降，誘導血細胞內ROS和MDA水平顯著上升，造成DNA損傷（ _{，Plt;0.05）} 。MPs組和BbF組血細胞活力分別較對照組下降了 11.59% 和 23.58% （ （Plt;0.05） 。與對照組相比，MPs組和BbF組血細胞內ROS水平分別上升 17.08% 和 12.70% ，而 BbF+MPs 組升高了 27.87%（Plt;0.05） 。泥蚶血細胞內MDA水平在MPs暴露后未出現明顯變化 （Pgt;0.05） ，但在BbF暴露后較對照組出現了 78.16% 的提升，并在與MPs的共暴露后上升至對照組的 272.31%（Plt;0.05） 。BbF單獨暴露使泥蚶血細胞DNA損傷程度較對照組升高1.97倍，BbF和MPs共暴露導致DNA損傷程度進一步上升，為對照組的2.98倍 （Plt;0.05） 。此外，與單一暴露組相比，MPs和BbF共同暴露對血細胞活力、氧化應激內穩態和DNA完整性有更顯著的影響 （Plt;0.05） ）。

2.3MPs與BbF暴露對泥蚶代謝和血細胞ATP含量的影響

如圖3所示，DMSO溶劑和MPs暴露未影響泥蚶的耗氧率、排氨率和血細胞ATP含量 （Pgt;0.05） 。BbF暴露造成了泥蚶血細胞ATP含量顯著降低，較對照組下降了 36.86%（Plt;0.05） 。經BbF暴露后，泥蚶的耗氧率減為對照組的 61.33% ，而排氨率則較之提高19.42%（Plt;0.05） 。與對照相比，各處理組泥蚶氧氮比均明顯下降 （Plt;0.05） 。MPs組、BbF組和 BbF⁺"MPs組泥蚶的氧氮比較對照組分別下降 14.11% 、47.83% 和 74.08% 。此外，與單獨暴露相比，MPs和BbF共暴露對泥蚶ATP含量、耗氧率、排氨率和氧氮比的影響更為顯著 （Plt;0.05） 。

Different superscripts indicate significant differences between groups （Plt;0.05） 元

Fig.3Effects of MPsand BbF exposure on the metabolismand haemocyte ATPcontents of T.granosa

2.4MPs和BbF暴露對泥蚶基因表達的影響

如圖4所示，泥蚶血細胞Toll-likereceptor信號通路中關鍵基因的表達量顯著改變，BbF組和 BbF⁺ MPs組泥蚶血細胞中NFκB1和TRAF6的表達量顯著降低 （Plt;0.05） 。MPs單獨暴露未影響血細胞BAX和Caspase-3基因表達 （Pgt;0.05） ，但BbF暴露誘導了其表達 （Plt;0.05） 。BbF與MPs共暴露后，泥蚶血細胞中BAX 基因的表達量進一步顯著上升 （Plt;0.05） ，較BbF單獨暴露組顯著提高了 19.21%（Plt;0.05） 。泥蚶血細胞中環境污染物代謝通路關鍵基因AHR、ARNT和CYPIA1的表達量也呈現類似現象，BbF暴露使其在泥蚶血細胞中表達量較對照組顯著提高，MPs的存在會使其表達量進一步升高 （Plt;0.05） 。

3討論

全球大部分海域以及多種海洋生物體內均已檢測到BbF和MPs的存在。MPs因其較大的比表面積，能夠吸附水環境中的BbF，這不僅改變了BbF在水環境中的分布，還可能影響其對水生生物的潛在毒性（Zhangetal，2025）。海洋灘涂貝類多棲息于污染頻發的近岸水域，且自身躲避污染物及代謝凈化能力有限，因此極易受到MPs和BbF等人源污染物的影響。然而，目前BbF和MPs共暴露對海洋灘涂貝類的影響仍不明晰。本研究發現，BbF和MPs均能顯著抑制泥蚶的免疫反應，且二者之間存在明顯的協同免疫毒性效應。

大多數海洋無脊椎動物由于缺乏抗原抗體介導的獲得性免疫，血細胞的吞噬作用成為抵御病原體侵襲的主要防線。因此，血細胞的數目和組成對泥蚶的免疫應答至關重要（Renault，2015）。本研究發現，為期30d的MPs與BbF暴露均導致泥蚶血細胞數量顯著降低，原因有以下2方面。一方面，MPs和BbF通過濾食等途徑進入泥蚶體內后，會誘導氧化應激和炎癥反應，進而造成血細胞損傷（Xiuetal，2014；Lietal，2022）。已有研究表明， PS-MPs（0.26mg/L 粒徑 lt;30μm） 暴露會通過物理作用損傷細胞膜和組織結構，致使金魚（Carassiusauratus）嗅球組織神經膠質細胞附近出現明顯的毛細血管充血、空洞和細胞間隙（Shietal，2021）；翡翠貽貝經15d的BbF脅迫（2～50μg/L） 后，外套膜和內臟團組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力和MDA濃度顯著升高，呈現出明顯的氧化損傷癥狀（Yangetal，2021）。與上述研究結果相似，本實驗中泥蚶血細胞內ROS和MDA水平在經MPs和BbF的暴露后顯著上升，這將引發血細胞的脂質過氧化，造成細胞內蛋白質變性和DNA損傷，促使血細胞凋亡或壞死。本研究中，當泥蚶暴露于MPs和BbF后，血細胞中促凋亡蛋白BAX以及作為細胞凋亡關鍵執行蛋白的Caspase-3基因的表達量均顯著升高。BAX基因表達量的升高會促使線粒體外膜通透性增加，釋放細胞色素C到細胞質中，從而激活Caspase級聯反應，而Caspase-3作為凋亡執行蛋白，其表達量升高會直接導致細胞結構破壞和DNA斷裂，最終引發細胞凋亡（Asadietal，2022）。這一結果表明，ROS和MDA的積累不僅直接損傷細胞成分，還通過調控BAX和Caspase-3的表達誘導細胞凋亡。另一方面，機體在修復MPs和BbF所造成的組織氧化損傷時，需要大量細胞協同參與。在此期間，細胞的募集和活化機制啟動，會大量消耗循環中的血細胞，致使循環系統中的血細胞數量下降（Perezamp;Fontanetti，2011）。此次研究中，MPs和BbF暴露造成血細胞中紅色顆粒細胞的比例下降，可能是由于不同類型的血細胞在吞噬能力方面存在差異。相較于嗜堿性顆粒細胞和透明細胞，紅色顆粒細胞具有更強的吞噬能力，意味著其會接觸更多的外源污染物，承受更高程度的氧化脅迫（Rocheretal，2006）。因此，在遭受MPs和BbF的脅迫后，紅色顆粒細胞的數量下降更為顯著。血細胞數量的減少，特別是紅色顆粒細胞數量的減少，會直接導致參與泥蚶病原菌吞噬作用的細胞數量相應減少，進而削弱泥蚶的免疫功能。值得注意的是，BbF具備與脂質、蛋白質以及DNA等生物大分子發生相互作用的能力，這種相互作用能夠改變生物大分子原有的結構與功能，進而引發更為廣泛的細胞損傷（Sureda etal，2005）。因此，與MPs相比，BbF所引發的氧化損傷以及DNA損傷更為嚴重。除了造成血細胞數量減少之外，MPs和BbF暴露引發的氧化損傷還會對血細胞結構的完整性造成破壞，干擾血細胞對異己物質的正常識別以及內吞功能，進而造成本研究中觀察到的血細胞活力下降以及吞噬率降低的現象（Perez amp; Fontanetti，2011;Andreyeva etal，2021）。

由于血細胞的吞噬作用是一個耗能過程（Turveyamp;Broide，2010），因此泥蚶在暴露于MPs與BbF后，用于免疫反應的能量減少是導致免疫能力下降的一個重要原因。本研究中，泥蚶在經BbF暴露后，血細胞ATP含量顯著下降會限制吞噬作用的能量供應，進而抑制其吞噬活性。有研究表明，水生生物在面對環境壓力時，會對不同生理行為之間的能量分配進行調整，以此滿足因環境壓力而增加的能量需求（Dela-porteetal，2006；Robertsetal，2013）。例如，在食物短缺的情況下，太平洋牡蠣（Crassostreagigas）會將更多能量分配至生殖器官的發育，而減少對血細胞吞噬等方面的能量供給（Delaporte etal，2006）。此外，泥蚶在MPs暴露的情況下，出現耗氧量減少和排氨率升高的現象，會進一步對其免疫功能造成限制。氧氣對于細胞內線粒體內的ATP合成至關重要，機體耗氧量的減少必然會導致血細胞中ATP生產效率降低，進而引發整體能量供應不足，損害包括吞噬作用在內的多種免疫反應（Coyne，2011）。另一方面，排氨率升高以及氧氮比的改變表明，泥蚶機體為滿足自身能量需求，啟動了蛋白質分解代謝途徑。這種分解代謝狀態會導致免疫細胞功能以及免疫相關蛋白合成所需的關鍵氨基酸和其他營養物質被大量消耗。因此，耗氧量減少與蛋白質分解增加這2個因素共同作用，致使泥蚶的免疫系統功能逐漸減弱。

在本研究中，MPs和BbF單獨及復合暴露導致泥蚶NFkB信號通路中NFκB1及TRAF6基因的表達顯著下調。在分子水平的免疫應答過程中，NFKB1和TRAF6是NF- σ_κB 信號通路的核心組分（Wuamp;Arron，2003）。NFKB1編碼p50亞基，作為NF- σ_κB 二聚體的重要組成部分，負責調控炎癥反應和免疫相關基因的表達；TRAF6則作為上游信號分子，通過介導IKK復合物的激活，促進IB的磷酸化和降解，從而釋放NF- ?κB 并使其轉位至細胞核。二者協同作用，通過激活多種免疫相關基因的轉錄，啟動炎癥反應并調控細胞因子的產生，在免疫應答中發揮關鍵作用（Wa-jantamp;Scheurich，2003）。在本次研究中，NFKB1基因在血細胞中的表達量降低會減弱炎癥反應、減少細胞因子生成，削弱免疫細胞間的協調與信息通訊，從而降低免疫應答效率，而TRAF6基因表達量的下降會進一步干擾上游信號傳遞，抑制IKK復合物的激活，阻礙NF- σ_?κB 的釋放和核轉位，加劇炎癥反應和細胞因子生成的不足，最終導致泥蚶機體免疫功能整體受損，增加對病原體的易感性。根據之前報道，細胞氧化應激產生的過量ROS會直接損傷DNA，導致NFKB1和TRAF6基因啟動子區域的氧化修飾，并通過激活氧化應激相關信號通路（如p38MAPK和JNK），抑制NFKB1和TRAF6的表達（Matsuzawaetal，2005）。另外，BbF還能通過激活AhR信號通路，使AhR蛋白與ARNT蛋白形成異二聚體，進而上調CYPIA1的表達，促進ROS的生成，進一步干擾NF-κB 信號通路，抑制NFKB1的活性（Yuanetal，2021）。因此，MPs和BbF可以通過誘導氧化應激，干擾NFKB信號通路的功能，繼而削弱泥蚶的免疫功能。

本研究結果顯示，與單獨暴露組相比，MPs與BbF的復合暴露對泥蚶的血細胞展現出更為顯著的免疫毒性。一方面，這種毒性增強的現象可能由于MPs促進了BbF在生物體內的內化過程，使得生物體內積累的BbF濃度大幅升高。另一方面，MPs與

BbF對泥蚶產生的聯合毒性效應，可能源于它們對同一目標的聯合作用。其中，MPs主要通過物理機制造成細胞損傷和引發炎癥反應，而BbF則通過化學機制誘發氧化應激和細胞凋亡（曹琳等，2024）。二者相互協同，致使免疫細胞被過度激活，其功能和數量遭受更加嚴重的損害，最終使泥蚶在面對外界病原體和環境挑戰時免疫效能降低。

綜上所述，MPs和BbF可通過損傷血細胞、削弱機體能量供給、干擾免疫信號通路，抑制泥蚶的免疫應答能力。泥蚶作為近岸生態系統重要成員，免疫受損會使其數量減少，進而影響眾多與之有生態關聯的物種，破壞生態平衡，沖擊生態系統的結構與功能。此外，在現實海洋環境中，泥蚶及眾多海洋生物將長期處于MPs和BbF的脅迫下，其在生物體內蓄積對漁業資源造成的潛在影響仍需進一步研究驗證。

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Impact of Microplastics and Benzo[b]fluoranthene Exposure on Immunity of Tegillarca granosa and Mechanism Research

LI Weifengl.2，WU Junchaol，ZHU Jun1， SHI Wei1 （1. College of Animal Science， Zhejiang University， Hangzhou 310o58， P.R. China; 2. College of Marine Science， Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， P.R. China）

Abstract： Tegillarca granosa （blood clam） is a typical filter-feeding benthic mollusk and it is a traditional economically significant aquaculture species in coastal regions of China. Blood clams predominantly inhabit nearshore waters where polution frequently occurs，so they are more susceptible to the influence of human-derived contaminants such as microplastics （MPs）and benzo[b]fluoranthene （BbF） given their limited ability to evade polutants and relatively weak metabolic purification capacity. In this study， blood clams were selected for research，and we investigated the impact of single and combined exposure to MPs and BbF on the immune response of blood cells in T. granosa as well as the toxic mechanisms induced by exposure to MPs and BbF.This research contributes to our understanding of the ecotoxicological effects of MPs and BbF，and provides a theoretical basis for the scientific management of environmental pollution issues in the shellfish aquaculture industry. Healthy blood clams of shell length of （37.9±5.13）mm were selected for the test after a two week acclimation period，and five test groups were set： a control， MPs treatment （ 0.26mg/L ），DMSO solution control group，BbF treatment （2μg/L） ，BbF and MPs combined treatment （BbF+MPs： BbF and MPs 0.26mg/L ）.The test lasted 30d ，and the effectofMPs and BbF exposure on the blood cells and metabolism of T. granosa were determined at the end of the test. Results show that both single and combined exposure to MPs and BbF for 30 days significantly suppressed the immune response of T. granosa. To elucidate the underlying mechanisms， we further explored the impacts of MPs and BbF on the cellular damage， metabolic energy supply，and immune-related signaling pathways of T. granosa. In terms of cellular damage， MPs and BbF exposure led to significant increases in intracellular reactive oxygen species （ROS） and malondialdehyde（MDA）levels， upregulation of proapoptotic proteins BAX and Caspase-3，and induction of lipid peroxidation and DNA damage. These changes resulted in blood cellapoptosis and a reduction in the proportion ofred granularcells，thereby impairing cellviability and phagocytic capacity. Regarding energy supply， BbF and MPs exposure disrupted the metabolism of T. granosa，reducing ATP levels in blood cells and consequently inhibiting phagocytic activity. In the context of immune signaling pathways，MPs and BbF exposure downregulated the expression of NFκBI and TRAF6 genes， interfering with NFkB signaling pathway transduction and ultimately impairing immune function. Furthermore，combined MPs and BbF exposure induced excessve activation of immune cels，exacerbating immune damage. In conclusion， MPs and BbF suppresses the immune response of T. granosa by causing blood-cell damage， impairing energy supply， and disrupting immune signaling pathways.

Key words： benzo[b]fluoranthene; microplastics; Tegillarca granosa; immunity; energy supply