馬鈴薯StSUT2干擾表達加劇薯塊酶促褐變

馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）屬茄科茄屬一年生草本植物，是僅次于小麥、水稻和玉米的世界第四大糧食作物，在加工過程中極易發生酶促褐變（EnzymaticBrowning），嚴重影響外觀、風味及營養價值[。酶促褐變發生的3個必要因素分別是酚類底物、酶和氧氣，即酚類化合物在酶催化下氧化成醌類化合物，隨后醌類物質與氨基酸和蛋白質等聚合生成深褐色或黑色的聚合物，從而導致褐變發生[2-3]。引起酶促褐變的主要酶類是多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）等。Chi等[4]通過人工microRNA干擾馬鈴薯 StPPOI～ StPPO4基因后，發現不同PPO基因可能獨立調控酶促褐變。POD參與褐變的能力與其接受供氫體的敏感性密切相關，在酚類和 H₂O₂ 存在下，導致褐變發生[5]。王麗等[對50個馬鈴薯品種的塊莖進行研究，結果表明酶促褐變程度與PPO和POD活性顯著相關；Liu等也發現PPO和POD在茄子果實褐變過程中具有協同作用；韓勝男等[8對帝王大麗花在組織培養時出現的初始外植體嚴重褐變的研究中發現PPO活性和苯丙氨酸解氨酶活性及總酚（Totalphenolic，TPC）含量變化趨勢與褐變程度呈現一致性； Wen 等[9]發現激光照射可以抑制鮮切馬鈴薯中StPAL、StPPO和StPOD基因的表達，并且在 450nm 激光照射30min 后可有效抑制褐變。Kasnak[10]研究表明槲皮素處理鮮切馬鈴薯可以有效抑制PPO和PAL活性，并減少丙二醛（malondialdehyde，MDA）的形成和酚類化合物的積累，從而有效控制鮮切馬鈴薯的褐變。酚類物質在馬鈴薯塊莖內種類繁多，Rytel等[1]研究了馬鈴薯塊莖加工中底物和褐變的關系，發現酚類化合物與褐變密切相關，其中綠原酸是酶促褐變的重要底物。

植物蔗糖轉運蛋白（sucrosetransporter或sucrosecarrier，SUT或SUC）是質外體途徑中蔗糖在細胞間運輸的重要跨膜轉運載體[12]，在植物蔗糖轉運過程中起重要作用[13]，同時對作物生長和發育也至關重要[14]。目前，馬鈴薯中鑒定到3個SUT基因，分別為StSUT1、StSUT2和StSUT4。研究發現，馬鈴薯StSUT1參與調控塊莖早期形成階段的鮮質量積累[14]；馬鈴薯StSUT4參與調控開花時間和結薯[15]。筆者近期研究發現，通過RNA干擾技術降低StSUT2的表達，轉基因植株的鮮質量、株高、葉面積和莖節數目等受到明顯抑制，而且塊莖產量顯著降低，由此表明，馬鈴薯StSUT2參與調控植株的生長及塊莖形成[16]。然而，StSUT2是否參與調控薯塊的酶促褐變尚不清楚。因此，本試驗以馬鈴薯品種‘夏波蒂’StSUT2RNA干擾的轉基因株系及其野生型的微型薯為材料，通過比較薯塊褐變程度、總酚含量和引起酶促褐變相關酶的活性等指標，分析StSUT2RNA干擾表達對薯塊酶促褐變的影響，探討StSUT2調控馬鈴薯酶促褐變的機理。

1材料與方法

1. 1 材料與試劑

以實驗室保存的馬鈴薯栽培品種‘夏波蒂’StSUT2RNA干擾表達的轉基因株系RNAi-1和RNAi-2（RNAi-1中StSUT2下調表達43.4% 、RNAi-2中StSUT2下調 表達62.9%^[16] ）及其野生型的微型薯為試驗材料。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸等，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；無水碳酸鈉、沒食子酸、福林酚等，購自上海源葉生物技術有限公司；愈創木酚，購自天津市大茂化學試劑廠；鄰苯二酚，購自天津市凱信化學工業有限公司；2-硫代巴比妥酸，購自上海展云化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1. 2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋，購自北京市偉永興儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機，購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；紫外一可見分光光度計，購自上海美普達儀器有限公司；酶標儀，購自美國加利福尼亞實時熒光定量；冷凍研磨儀，購自上海凈信實業發展有限公司；色差儀，購自天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理方法選取 10g 左右的微型薯各10個，自來水洗凈后瀝干水分并去皮切塊，一部分用于感官測定，其余部分取樣后用液氮速凍，貯存于 -80^°C 冰箱，以備后續各項生理指標的測定。

1.3.2感官測定鮮切薯塊顏色感官評價：將切好的長寬高分別為 2.5cm，1.5cm，1.5cm 的薯塊置于玻璃平皿中，觀察顏色變化，每隔 ¹h 進行拍照，共 ⁷h 。薯塊汁液顏色感官評價：取 5g 左右的微型薯薯塊，切碎后加入 5mL 蒸餾水，觀察其汁液顏色變化，分別在 0h，1h，4h，7h 拍照。使用CanonDS126571相機拍照記錄。

1.3.3褐變度測定參照于佳佳等[17]的方法，取薯塊 _0.2g ，加去離子水 3mL 研磨成勻漿，然后置于 水浴中 20min ，于 12 000r/min 離心 10min ，取上清液，在 420nm 波長下測定吸光值，結果以 A₄₂₀ 表示褐變度（Browningdegree，BD）。

1.3.4色度的測定對切條后的薯塊選取中心部位，放置 0h，1h，4h，7h 后進行色度參數 ΔL 值的測定，取其平均值。測定前以標準白度（L^*=89.36，a^*=0.42，b^*=-3.06） 對色差儀進行校準， ΔL 值為樣品和標樣間的明暗變化，正值說明樣品比標準板偏亮，負值說明偏暗。

1.3.5總酚含量測定參照岑忠用等[18]的方法，取薯塊 0.5g ，加人蒸餾水研磨成勻漿，提取 下 10000r/min 離心 15min ，取上清液，稀釋5倍后為待測液。分別吸取0.0、0.1、0.2，0.3，0.4，0.5mL100μg/mL 沒食子酸標準溶液于試管中，用蒸餾水補至 6mL ，混勻后加入0.5mL1mol/L 福林酚試劑， 1min 后加入2mL20% 碳酸鈉溶液，用蒸餾水補至 10mL ，搖勻，在 40°C 恒溫水浴鍋中避光水浴 2h ，冷卻至室溫，在 760nm 波長處測定其吸光度，并繪制標準曲線。樣品測定：吸取 0.2mL 待測液于試管中，按上述方法測定樣品的總酚含量?？偡雍恳悦靠缩r樣品含有沒食子酸微克數計，單位為 μg/g 。1.3.6多酚氧化酶活性測定參照馬玉榮[19的方法，稱取 0.5g 薯塊組織，然后將樣品分別加入pH6.8 的PB進行研磨，于 10 000r/min.4°C 的條件下離心 20min ，取上清液即為PPO粗酶液。測定管中加入 2.5mL 0.1mol/L 的鄰苯二酚、0.2mL 酶液，對照管加入 2.7mL 的 0.1mol/L 的鄰苯二酚，不加酶液，立即混勻后于 420nm 波長下測定吸光值 10s 記錄一次，共測定 2min ）。一個活力單位（U）為在測定條件下 1min 引起吸光值改變0.01所需酶含量。

1.3.7過氧化物酶活性測定參照李博[20]的方法，稱取 0.5g 薯塊組織，加入 5mLpH 6. 8 的PB研磨，于 10 000r/min.4°C 的條件下離心20min ，上清液為POD粗酶液，在測定管中依次加人 200μL 酶提取液 .3mL20mmol/L 愈創木酚和 10μL30% （20 H₂O₂ ，立即混勻后測定 470nm 波長下的吸光值（10s記錄一次，共測定 2min? ）。一個活力單位（U）為測定條件下 1min 引起吸光值改變0.01所需酶含量。

1.3.8苯丙氨酸解氨酶活性測定使用南京集測生物科技有限公司的苯丙氨酸解氨酶試劑盒（貨號：JC0114-S；規格： 50T/48S） 對薯塊中的苯丙氨酸解氨酶活性進行測定，參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.9丙二醛（MDA）含量測定MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法，參照劉陽等[21]稍作修改。稱取 _0.5g 薯塊組織，加入 3mL10% 三氯乙酸（TCA），研磨至勻漿，再加入 2mL 的TCA沖洗， 4000r/min 離心 10min ，上清液為提取液。取提取液 2mL ，加入 2mL 0.6% 的硫代巴比妥酸，混勻，沸水浴反應 15min ，迅速冷卻后4000r/min 離心 10min ，取上清液于 450nm、532nm 、600nm 下測吸光值。結果以每克鮮質量中的MDA含量表示，單位為 nmol/g 。

1.4 數據分析

采用MicrosoftExcel201O對試驗數據進行統計整理和作圖，顯著性檢驗采用IBMSPSSStatistics22.0軟件進行獨立樣本 χ_t 檢驗，采用Origin2021軟件進行相關性分析并制作熱圖。

2 結果與分析

2.1StSUT2干擾表達對薯塊褐變程度的影響

從圖1-a和圖1-b可以看出，鮮切薯塊和薯塊汁液隨著放置時間的延長，逐漸發生褐變，但兩個干擾株系RNAi-1和RNAi-2的褐變顏色均深于WT，且干擾株系RNAi-2較RNAi-1的褐變顏色更深。由圖1-c可以看出，干擾株系RNAi-1和RNAi-2的褐變度比WT分別高 36，5%，51.3% .差異極顯著（ Plt;0. 01） 。由圖1-d可以看出，鮮切薯塊放置 0～7h ，兩個干擾株系的色度 ΔL 值均顯著低于WT。綜上，StSUT2干擾株系的褐變程度高于野生型，即StSUT2干擾表達加劇薯塊褐變。

2.2StSUT2干擾表達對薯塊總酚含量、PAL、POD和PPO活性的影響

從圖2-a和圖2-b可以看出，兩個干擾株系RNAi-1和RNAi-2的總酚含量和PAL活性顯著高于WT，其中，干擾株系RNAi-1和RNAi-2的總酚含量分別比WT高 9.8% （ Plt;0， 05^? 和30.0% （ Plt;0. 01; ，PAL活性比WT分別高33.0% 和 25.7%（Plt;0.01） 。此外，由圖2-c和圖2-d可以看出，干擾株系RNAi-2的PPO和POD活性分別比WT高 27.3% 和 15.0% ，差異顯著 （Plt;0.05） ，而干擾株系RNAi-1的PPO和POD活性與WT差異不顯著。由此表明，StSUT2干擾表達后，增加了薯塊總酚含量、PAL活性，并對PPO和POD活性有一定程度的影響，這可能是StSUT2干擾表達加劇薯塊褐變的原因。

2.3 StSUT2干擾表達對薯塊MDA含量的影響

MDA含量反映了細胞膜的過氧化程度，它的過量積累使細胞膜遭受破壞，加快果蔬褐變的速度，其含量可以作為衡量酶促褐變程度強弱的一個重要指標[22]。從圖3可以看出，StSUT2兩個干擾株系RNAi-1和RNAi-2的MDA含量分別比野生型高 25.1% （ Plt;0.05） 和 46.1%（Plt; 0.01）。由此表明，StSUT2干擾表達后，增加了薯塊的MDA含量。

2.4薯塊褐變指標間相關性分析

從圖4可以看出，StSUT2干擾株系RNAi2、RNAi-1及其野生型的褐變度與TPC含量、PAL活性、PPO活性和MDA含量之間均呈極顯著正相關性（ ?Plt;0.01） ，相關系數為 0.50～0.79 ，而與POD活性的相關性不顯著。

3討論

馬鈴薯等果蔬酶促褐變與多酚含量、PPO活性等顯著相關[23-24]。本研究發現，馬鈴薯StSUT2干擾表達的兩個轉基因株系RNAi-1和RNAi-2的褐變程度均顯著高于野生型，總酚含量和PAL活性顯著高于野生型，且StSUT2干擾表達率較高的株系RNAi-2的PPO和POD活性也顯著高于野生型；相關性分析表明，褐變度與總酚含量、PAL和PPO活性均呈極顯著正相關。由此表明，StSUT2干擾表達加劇薯塊褐變可能干擾株系和野生型鮮切薯塊感官褐變程度、薯塊汁液感官褐變程度、薯塊褐變度和薯塊色度 是由于總酚、PAL和PPO引起的酶促褐變加劇， 暗示StSUT2可能通過影響總酚含量以及PAL 和PPO活性而參與調控馬鈴薯的酶促褐變。

MDA是膜脂過氧化反應的最終產物，其含量可以用于評估膜脂過氧化程度[25-26]，且對膜系統有毒性作用，會破壞細胞膜完整性進而促進褐變[27]。王婷婷[28]研究發現，鮮切馬鈴薯在常溫下放置 3h 后，其MDA含量顯著上升，導致褐變加重，因而推測損傷（鮮切）脅迫可能激活了膜脂過氧化反應，造成細胞膜不可逆的損傷，使細胞膜脂發生降解和過氧化，導致褐變加重。本研究中，StSUT2干擾株系RNAi-1和RNAi-2薯塊的MDA含量均顯著高于野生型。相關性分析結果顯示，薯塊褐變度與MDA含量呈極顯著正相關。由此，筆者推測，StSUT2干擾株系中StSUT2基因下調表達，引起MDA積累即膜脂過氧化程度增強，進而細胞膜結構完整性受到破壞而引發褐變程度的加深。

綜上所述，馬鈴薯蔗糖轉運蛋白StSUT2干擾表達后，薯塊褐變程度高于野生型。與野生型相比，干擾株系薯塊中的總酚含量、PAL和PPO的活性以及MDA含量均顯著增加，且與褐變度極顯著正相關。由此推測，這些因素可能是導致StSUT2干擾株系褐變程度高于野生型的原因。

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Aggravating Enzymatic Browning of Potato Tubers by Interference Expression of StSUT2

GONG Huiling，GAO Wei， FAN Sizheng and FENG Zaiping （Schoolof Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 73oo5o，China）

Abstract This study investigated the effect of the potato sucrose transporter protein gene StSUT2 on the enzymatic browning of potato tubers.Two transgenic lines of potato variety Shepody，with RNA interference （RNAi） expression of StSUT2 along with their wild type （WT），were used as experimental materials.Key indicators including browning level，total phenolic content （TPC），phenylalanine ammonia-lyase （PAL） activity，polyphenol oxidase （PPO） activity，peroxidase （POD） activity， and malondialdehyde （MDA） content were measured，and the correlation analysis of browning indicators was analyzed.The results indicated that the freshly cut tubers and tuber juice of the two StSUT2 RNAi lines exhibited significantly deeper browning and higher browning degrees，with significantly lower chromaticity ΔL values compared to the WP.This findings suggest that interference expression of StSUT2 exacerbated browning in potato tubers.Further analysis showed that compared with the wild type，the StSUT2 RNAi lines RNAi-1 and RNAi-2 showed increase in TPC by 9.8% and 30.0% （204號 respectively；PAL activity increased by 33.0% and 25.7% respectively；and MDA content increased by 25.1% and 46.1% ；PPO activity increased by 27.3% ，while POD activity increased by 15.0% Correlation analysis showed that browning degree was highly positively correlated with TPC， PAL activity，PPO activity，and MDA content， but not with POD activity.In summary，the higher browning levels in the StSUT2 RNAi lines compared to the WT are attributable to increased TPC，PAL and PPO activities，and MDA content following StSUT2 interference expression.

Key words Potato；StSUT2；Interference expression;Enzymatic browning

Received 2024-08-28 Returned 2024-12-03

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China （No.3186O397）；Key Project of Natural Science Foundation of Gansu Province （No.22JR5RA228）； Science and Technology Plan of Gansu Province （Technology Innovation Guidance Plan - Special Project for Science and Technology Commissioners） （No.23CXGA0061）.

First author GONG Huiling， female， Ph.D，associate professor.Research area： postharvest physiology of potato. E-mail：gonghl@lut. edu. cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）