嫁接嵌合體紅肉胡柚實生后代四倍體 發掘與形態特征評價

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）05-0969-10

Abstract： 【Objective】 Plant organs are composed of multiple celltypes，and organs of dicotyledonous plants normally have three distinct layers ofcels，L1，L2 and L3.LayerL1 is the single layerof cells makingup the epidermis，and layer L2 is the single cell for sub-epidermal layer，and layer L3 constitutes the rest of the internal cells.Chimera refers to an organism made of the cell layers with different genotypes，and chimeric plants in citrus were often produced through grafting.Polyembryony hampers the efficiency ofsexual hybridization in citrus，and seedlings from citrus chimera canadditionally exhibit characteristics closer to the features of the donor of cell layer contributed to the gamete origination.

Hongrou Huyou （Citrus unshiu + C.aurantium） is a periclinal chimera consisting ofL1 cell layer denoted by C. unshiu and L2/L3 cell layers derived from Changshan Huyou （C.aurantium）. Tetraploids are important for rootstock application in citrus production，and for enhanced tolerance or resistance to biotic stress and abiotic stress，and for seedless triploid varieties breeding.Autotetraploid sedlings have been reported in some citrus species with a variable frequency of occurrence. However，tetraploid seedlings generated from chimera are rarely reported in citrus.In this study，one tetraploid seedling of Hongrou Huyou was identified from a population of seedlings transplanted successfully. The ploidy level and genetic origin of the tetraploid seedling were analyzed，and the morphological characteristics of the tetraploid sedling were explored using the diploid seedlings as control， suggesting an application of seedlings of peripheral chimera in citrus.【Methods】In this experiment， the embryo number per seed of Hongrou Huyou was check and identified based on the investigation of one hundred seeds selected randomly.Flow cytometry （FCM） was used to determine the ploidy level of the seedlings of Hongrou Huyou using a diploid species Hongrou Huyou as control. Folowing DNA extraction， the genetic identification of the seedlings was analyzed using 28 pairs of Simple Sequence Repeat （SSR） primers distributed in 9 chromosomes ofcitrus species.Morphological differences including leaf length，leaf width， internodal distance，leaf thickness，and leaf shape index were compared between the tetraploid seedling and the diploid sedling of Hongrou Huyou.The semi thin sections were used to observe the anatomical structure of leaves， and the thicknesses of the upper epidermis，lower epidermis，palisade tissue， and sponge tissue were compared between the tetraploid seedling and the diploid sedling under an optical microscope.The density of lipid granules and starch granules in the chloroplast were compared between the tetraploid and the diploid seedlings based on the ultramicrotomic observation under a transmission electron microscope （TEM）. The stomatal density and the size of stoma and guard cels in the leaves were also observed under a scanning electron microscope （SEM）. The contents of chlorophylls were measured with spectrophotometry.【Results】The results indicated that Hongrou Huyou is a polyembryonic species. The proportion of monoembryos was 42% ，and polyembryos 58% . FCM identified one tetraploid seedling of Hongrou Huyou among the 12O seedlings transplanted successfully. The results of SSR molecular markers amplified with 28 pairs of primers showed that the tetraploid seedling had identical genotype to C .aurantium， which was the Layer 2 （L2） cell donor of Hongrou Huyou. Morphological comparison showed that the leaf length，the internodal distance，and the leaf shape index were significantly decreased in the tetraploid seedling compared with the diploid seedling. Semi thin sections showed that the leaf thickness，the thicknesses of the upper and lower epidermis，palisade tissue， and sponge tissue were significantly greater in the tetraploid seedling.The SEM analysis showed that the tetraploid sedling had a significantly reduced in the stomatal density and an enlarged size of guard cells compared with the diploid seedling.The TEM observation showed that the density of lipid globules increased but the density of starch granules decreased in the chloroplasts of the tetraploid seedling compared to the diploid seedling. The chlorophyll and carotenoid contents were significantly increased in the tetraploid seedling.【Conclusion】In this study，one tetraploid seedling was identified from 120 seedlings of periclinal chimera Hongrou Huyou. SSR ploymorphism analysis showed that the tetraploid seedling was identical to C aurantium，the L2 donor to Hongrou Huyou. The tetraploid seedling displayed the typical morphological and anatomical characteristics in leaf shape and thickness， stomatal density and size，and chlorophylland carotenoid content of polyploid plants.This work provides a novel tetraploid germplasm for the application of triploid breeding in citrus in the future.

Keywords：Hongrou Huyou;Periclinal graft chimera; Tetraploid; SSR

柑橘是蕓香科柑橘屬的重要經濟果樹，中國柑橘產量居全球首位。在果樹生產中，通常利用嫁接繁殖具有優良性狀的果樹品種。偶然情況下，嫁接口的砧木細胞和接穗細胞會共同發育成不定芽并生長為一個新的枝條，形成嫁接嵌合體[2]。Schmidt3]“原套原體”學說提出植物莖尖分生組織由原套和原體兩部分組成，由外向內，分別為L1層、L2層、L3層。通常，L1層發育成表皮細胞，L2層發育成生殖細胞，L3層形成器官內部組織[2]。當某個細胞層或三層細胞的一個扇區發生突變，就形成植物嵌合體4。

人工合成的周緣嵌合體，在植物組織發生規律研究中具有重要作用。Chen等[5通過離體嫁接培養獲得了榨菜（Brassicajuncea）和紫甘藍（Brassicaol-eracea）種間嵌合體，研究表明該嵌合體含有兩個嫁接供體的染色體，且具有兩個供體的寶貴性狀。Zhang等在溫州蜜柑（Citrusunshiu）作為中間砧高接羅伯遜臍橙（C.sinensis）的樹上發現了嫁接嵌合體早紅臍橙，其果實汁胞主要來源于L1供體溫州蜜柑，而果皮、果形和葉片香氣等性狀來源于L2供體羅伯遜臍橙。Zhang等在湖北省秭歸縣的一個果園進行芽變調查時發現嫁接嵌合體紅肉桃葉橙（C.si-nensis+C.unshiu），研究發現其果肉性狀主要來源于L1層，花粉、種子和果皮香氣特征來源于L2/L3層。Yasuda等對Meiwa金柑的突變體Yubeni進行流式細胞術分析，發現Yubeni是一個由二倍體和四倍體細胞構成的周緣嵌合體，其L1層細胞為二倍體，L2和L3層為四倍體。Nukaya等發現Meiwa金柑周緣嵌合體葉片、花瓣、花絲、花柱、子房、果皮著色層是二四混倍體，表明這些部分由L1和L2/L3共同構成；而葉中脈、種子和果實白皮層均是純合四倍體，表明這些組織只來源于L2/L3。

由于存在組織異質性，周緣嵌合體的配子或珠心胚由莖尖分生組織中的哪一層細胞發育而來，對其實生后代表型有著決定性作用4。Schmulling等[]研究表明在煙草嵌合體中，L2產生雄性和雌性配子。Zonneveld等[利用流式細胞術對玉簪（Hos-taTratt.）嵌合體12個組織和器官進行起源分析，發現 95% 的配子來源于L2層，表明L2細胞層是配子形成的主要細胞層。柑橘類植物還具有多胚現象[2，多胚柑橘實生后代往往由珠心細胞發育而來并表現出母本的性狀。因此，柑橘周緣嵌合體實生后代表型特征還需要考慮配子或珠心胚來源于哪個供體[13]。

柑橘四倍體有著重要的育種價值[14]。與二倍體砧木相比，柑橘四倍體砧木對鹽脅迫[15-1d]、重金屬毒害[17-18]、干旱脅迫[19]以及低溫脅迫[20]等非生物脅迫的耐受力更強2]。柑橘四倍體往往表現出大果、少核的表型特征[22-23]，比如，金柑四倍體具有少核、厚果皮、含糖量高等特點，具有良好的市場潛力[。最重要的是，柑橘四倍體可以作為倍性雜交親本創制多倍體砧木和三倍體接穗品種[24。研究表明，利用多胚柑橘品種珠心細胞存在自然加倍的特點，通過實生播種已從多個柑橘品種發掘出四倍體種質[1。但四倍體發生頻率在品種間存在差異，且同一品種的發生頻率因生長環境不同而存在顯著差異[25]。在高緯度、高海拔、低溫條件下，柑橘四倍體發生頻率顯著提高[25]。目前，通過實生播種結合倍性分析，已報道很多四倍體柑橘種質。謝善鵬等2通過實生播種在常山胡柚、溫嶺高橙、新會橙、橘血橙雜種、衢州香橙和酸橙中獲得四倍體；周銳等[通過實生播種在紅江橙、貢柑、年橘、新會柑、滑皮金柑中獲得四倍體；Ren等[4通過秋水仙素原位活體誘導在秋輝橘、黃陵廟蜜橘、琥珀甜橙和HB柚等單胚性品種中獲得四倍體；Aleza等2利用秋水仙素誘導結合莖尖微嫁接在克里曼丁橘中獲得四倍體。但柑橘周緣嵌合體實生多倍體后代發掘鮮有報道。

紅肉胡柚（C.unshiu+C.aurantium，“OCC\"）是筆者課題組前期報道的周緣嵌合體，經SSR（simplesequencerepeat）分子標記證明紅肉胡柚葉片中含有兩個供體的細胞核、葉綠體和線粒體基因組，表明紅肉胡柚是常山胡柚（C.aurantium，“C\"）和溫州蜜柑（C.unshiu，“O\"）嫁接形成的周緣嵌合體，其L1層來源于溫州蜜柑，L2/L3層細胞來源于常山胡柚，其果肉顏色、質地和風味與溫州蜜柑相似，果實大小、種子數量、果皮著色層和白皮層等性狀與常山胡柚相似[2，28]。配子通常由L2層細胞發育而來，但仍有研究發現某些周緣嵌合體實生后代在形態學上表現出異于L2供體的特征，并在表觀遺傳等方面受到L1供體的影響，因此，挖掘周緣嵌合體的四倍體實生后代，有可能獲得具備L1供體性狀特征的新種質。Yu等[4在研究榨菜（Brassicajuncea）（L1供體）和紫甘藍（Brassicaoleracea）（L2供體）合成的嵌合體時發現，其實生后代表現出葉色更綠、蠟質顯著減少等區別于L2供體的表型特征，同時伴隨著siRNA和基因組甲基化改變。Marcotrigiano等[2]在研究6組普通煙草（Nicotianatabacum）和光煙草（Nicotia-naglauca）的周緣嵌合體時也發現，部分實生后代表現出與L1供體表型一致的情況。目前，柑橘周緣嵌合體實生后代研究和多倍體發掘鮮有報道。因此，筆者在本研究中以柑橘周緣嵌合體紅肉胡柚四倍體實生后代為材料，通過SSR分子標記分析其遺傳規律，對實生后代四倍體單株的性狀進行評價，為柑橘周緣嵌合體實生后代用于育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2022年10月，在浙江農林大學實驗基地，采集紅肉胡柚花后6個月的果實，剝出種子后在 1mol?L^-1 NaOH溶液中搖晃浸泡 5min ，洗凈種子后，使用0.2mol?L^-1 次氯酸鈉溶液對種子進行消毒，將處理好的種子用MT（Murashge-Tucker）培養基 （4.43g） MT+30g 蔗糖 +7g 瓊脂粉）進行無菌接種。待種子萌發并長至 8cm 株高時，將小苗移栽入 V 是 3 ： 1 0 }$ ： 的栽培土壤。

1.2種子單多胚鑒定

收獲紅肉胡柚成熟果實，剝出種子后隨機挑選100粒種子，參考張斯淇3的方法統計每粒種子胚數

并在體視顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 倍性鑒定

以成年態二倍體紅肉胡柚葉片為對照，剪取實生后代植株 0.5cm² 嫩葉，參照解凱東等[]的方法進行樣品制備，并采用流式細胞儀（Cy-Flow PloidyAnalyser，Sysmex，Germany）檢測植株倍性。

1.4SSR分子標記鑒定四倍體實生后代

采用SimgenPlantDNAKit試劑盒，提取紅肉胡柚及其實生后代、嫁接供體溫州蜜柑和常山胡柚的葉片DNA。SSR分子標記的反應體系為 10μL ：無菌水 2μL ，正反向引物各 1μL ，DNA模版 Accurate TaqMasterMix 。使用 T100^rm Ther-malCyclerPCR儀（Biorad，America）進行PCR擴增，PCR擴增程序為： 95^°C 預變性 3min，95^°C 變性15s，61^°C 退火 延伸 30s，35 個循環后72^°C 延伸 5min，4^°C 保存。擴增產物用 12% PAGE膠先于 90V?400mA 電壓下電泳 30min ，再于 200V 1400mA 電壓下電泳 90min ，后進行銀染 7min ，顯影5min ，結束后拍照觀察。利用分布于柑橘9條染色體的28對SSR引物分析紅肉胡柚實生四倍體后代的遺傳組成，SSR引物序列源自相關參考文獻，由杭州有康生物技術有限公司合成。表1列出了其中3對引物的序列。

1.5葉片形態學觀察

以紅肉胡柚二倍體實生后代植株作為對照，測定同一生長發育時期的四倍體植株形態指標，包括葉長、葉寬、節間距、葉片厚度。節間距用直尺測量，葉長、葉寬、葉片厚度用游標卡尺測量，取平均值。

1.6葉片透射電鏡樣品制備與觀察

取紅肉胡柚實生四倍體和二倍體后代植株的葉片，在葉中脈附近剪取 0.5cm² 的正方形，樣品放置于 2.5% 戊二醛溶液中固定，使用真空泵抽除樣品中的空氣， 4^°C 條件下固定 24h 。采用Chen等的方法，對樣品進行固定、脫水、滲透、包埋，將處理好的部分樣品在LKB11800PYRAMITOME型半薄切片機中進行切片，獲得厚度為 2μm 的半薄切片，使用次甲基藍對切片進行染色，染色完成后在光學顯微鏡下觀察切片并拍照。其余樣品通過半薄切片觀察定位，使用LEICAEMUC7型超薄切片機切片，得到厚度為 70～90nm 的超薄切片，經過檸檬酸鉛溶液、醋酸雙氧鈾 50% 乙醇飽和溶液分別染色 5min 后，在HitachiH-7650型透射電鏡中觀察。

1.7葉片掃描電鏡樣品制備與觀察

取紅肉胡柚實生四倍體和二倍體后代植株的葉片，雙面刀片將葉片切成 1.0cm² 的正方形，采用Chen等5的方法處理和制備樣品，樣品經過干燥和鍍膜后，在HitachiSU-8010型掃描電鏡中觀察并拍照。

1.9 數據分析

1.8葉片葉綠素和總類胡蘿卜素含量測定

稱取剪碎的紅肉胡柚實生四倍體和二倍體后代植株的新鮮葉片各 0.1g ，置于棕色試管，在每個試管中加入 5mL95% 乙醇，置于暗處 24h ，將提取液倒入光徑 1cm 的比色杯內，以 95% 乙醇作為對照，使用分光光度計在波長 665，649，470nm 下測定吸光度。試驗設置3個生物學重復。參照張澤群[34的方法計算紅肉胡柚實生四倍體和二倍體后代植株葉片的葉綠素和總類胡蘿卜素含量。

使用ImageJ2.14.0版本軟件進行葉片解剖結構和氣孔特征參數測量。試驗數據均采用IBMSPSS25.0中的獨立樣本T檢驗進行統計分析。采用Ex-cel2010和PhotoshopCS6軟件制圖。

2 結果與分析

2.1紅肉胡柚種子單多胚鑒定

拍攝紅肉胡柚及其兩個供體的果實（圖1-A），隨機挑選100粒紅肉胡柚種子統計胚數。結果顯

A.溫州蜜柑（O，左），紅肉胡柚（OCC，中），常山胡柚（C，右）的果實橫切面;B.紅肉胡柚單胚型種子;C.紅肉胡柚多胚型種子;D.紅肉胡柚單胚種子的再生植株;E.紅肉胡柚多胚種子的再生植株;F.紅肉胡柚二倍體和四倍體后代植株;G.紅肉胡柚二倍體和四倍體后代葉片;H.紅肉胡柚實生后代植株倍性檢測；白色箭頭所指為胚。

2.2紅肉胡柚后代植株倍性鑒定

移栽成活的120株紅肉胡柚實生后代單株，參照解凱東等3的方法，以成年態紅肉胡柚二倍體葉片作為對照，采用流式細胞儀對其進行倍性鑒定。結果表明，120株實生后代中，二倍體119株，四倍體1株。圖1-H顯示成年態紅肉胡柚二倍體與四倍體后代葉片等比例混合進樣，四倍體后代的熒光強度對應的橫坐標數值為二倍體的兩倍。

2.3紅肉胡柚實生四倍體后代SSR分子標記鑒定

利用分布于柑橘9條染色體的28對SSR引物分析紅肉胡柚實生四倍體后代的遺傳組成，表明四倍體單株與紅肉胡柚L2供體常山胡柚帶型一致，即紅肉胡柚四倍體后代具有常山胡柚雙二倍體的帶型特征。圖2顯示其中3對引物的擴增圖譜。

2.4實生四倍體和二倍體后代葉片形態比較

觀察結果表明，四倍體葉片相較于二倍體更寬、更厚（圖1-F、G）。紅肉胡柚四倍體植株的葉寬和葉厚顯著大于二倍體，葉長、節間距和葉形指數顯著小于二倍體（表2）。

1.DNAMarker;2.常山胡柚；3.紅肉胡柚；4.溫州蜜柑；5.紅肉胡柚四倍體后代。

2.5實生四倍體和二倍體后代葉片解剖學觀察

紅肉胡柚二倍體和四倍體后代葉片的半薄切片顯示，四倍體薄壁細胞面積大于二倍體，且四倍體上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織的厚度顯著大于二倍體，分別增加了 47.1%，34.2%，77.0% 和 64.6% （圖3-A＼～D，表3）。紅肉胡柚二倍體和四倍體后代葉片的超薄切片顯示，四倍體葉片的細胞增大，胞內脂肪球數量顯著高于二倍體，平均密度為40.0個 100μm^-2 ；淀粉粒數量較二倍體顯著減少，平均密度為8.67個 100μm^-2 （圖 3-E～H ，表3）。

2.6實生四倍體和二倍體后代葉片氣孔形態學觀察

在掃描電鏡下觀察紅肉胡柚實生二倍體與四倍體后代葉片的氣孔，結果表明，二倍體和四倍體葉片下表皮的氣孔形狀大多數為橢圓形。四倍體的氣孔和保衛細胞均顯著大于二倍體，四倍體氣孔的平均長度為 6.76μm ，平均寬度為 4.34μm ，四倍體保衛細胞的平均長度為 25.07μm ，平均寬度為 18.64μm 0四倍體氣孔的平均密度為269.80個 ?mm^-2 ，相較于二

A、C.二倍體后代植株葉片橫截面解剖結構;B、D.四倍體后代植株葉片橫截面解剖結構;E、G.二倍體后代植株葉片透射電鏡結構;F、H.四倍體后代植株葉片透射電鏡結構;I、K.二倍體后代植株葉片氣孔表型;J、L.四倍體后代植株葉片氣孔表型;UE.上表皮；LE.下表皮；ST.海綿組織;PT.柵欄組織;Ph.韌皮部;X.木質部;Pa.薄壁細胞;CH.葉綠體;SG.淀粉粒;FA.脂肪球。

2.7實生四倍體和二倍體后代光合色素含量比較

表明，紅肉胡柚四倍體葉片中的葉綠素含量和總類胡蘿卜素含量均顯著高于紅肉胡柚二倍體。四倍體葉片中的葉綠素a含量 ，后同）為 1.75mg?g^-1 ，葉綠

對葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量進行測定，結果

素b含量為 0.75mg?g^-1 ，葉綠素總含量為 2.49mg?g^-1 總類胡蘿卜素含量為 0.34mg?g^-1 ，相較于二倍體分別高 17.4%?23.0%?19.1%?6.3% （表5）。四倍體植株的葉色相較于二倍體植株更濃綠。

3討論

研究周緣嵌合體實生后代的遺傳規律，對嵌合體后代的應用具有重要意義。在雙子葉植物中，配子通常由莖尖分生組織L2層細胞發育而來[29]。徐遠濤[3利用開發的InDe1標記，對紅肉桃葉橙嵌合體實生后代遺傳組成進行研究，結果表明紅肉桃葉橙外種皮、子葉、胚以及實生苗的遺傳組成與L2供體桃葉橙一致。Goffreda等[5]在研究野生番茄（Lycop-ersiconpennelli）和栽培番茄品種（Lycopersicones-culentum）種間嵌合體時，通過細胞層標記基因和顏色標記分析嵌合體自交后代，發現后代植株只有一種基因型，且與L2供體基因型一致。筆者在本研究中利用位于柑橘9條染色體的28對SSR引物對紅肉胡柚實生四倍體后代進行分子標記鑒定，結果顯示四倍體單株與紅肉胡柚L2供體常山胡柚帶型一致，與徐遠濤[13的研究結果是一致的。

柑橘實生四倍體發生途徑主要有珠心細胞自然加倍產生同源四倍體，或通過染色體未減數 2n 雌配子與 2n 花粉自然授粉產生異源/同源四倍體，以及合子自然加倍產生四倍體3。紅肉胡柚及其嫁接供體品種均為二倍體，生長栽培環境附近不存在多倍體柑橘品種，紅肉胡柚是單多胚并存的柑橘品種，其實生子代可能存在雜交子代和珠心苗兩種情況。因此，筆者在本研究中獲得的1株四倍體后代植株可能是通過自身未減數的 2n 花粉與 2n 雌配子自交途徑形成的，也可能由紅肉胡柚珠心細胞自然加倍而成。然而，曹麗雯[在研究榨菜（Brassicajuncea）和紫甘藍（Brassicaoleracea）合成的周緣嵌合體時，發現與L2層供體榨菜相比，部分自交后代植株葉形發生變異，表現出趨向于L1供體紫甘藍的葉形特征，而且自交后代植株在siRNA數量和表達量以及CHH甲基化等表觀遺傳方面發生顯著改變，體現出周緣嵌合體層間細胞互作。雖然分子標記分析表明筆者在本研究中發掘的四倍體單株只具備L2供體常山胡柚的SSR帶型特征，但L1供體溫州蜜柑對紅肉胡柚實生四倍體后代是否存在表觀遺傳等方面的影響，還需要進一步研究。

植物四倍體較二倍體會有明顯的形態差異，通常表現為葉片變寬、變厚及葉形指數變小，同時抗逆性更強。在本研究中，紅肉胡柚四倍體的葉寬及上下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度較二倍體顯著增大，四倍體葉片葉綠素含量和類胡蘿卜素含量顯著高于二倍體，且四倍體脂肪球數量豐富，淀粉粒數量較二倍體顯著降低，這些特點有利于凈光合速率、電子傳遞量子效率和光化學猝滅系數的提高，有助于葉片進行光合作用[22]。在本研究中，四倍體氣孔密度顯著減小，氣孔和保衛細胞大小較二倍體顯著增大；Ren等[14對秋水仙素誘導獲得的秋輝橘、黃陵廟蜜橘、琥珀甜橙、HB柚四倍體與其二倍體進行形態差異比較，表明氣孔密度隨著植物倍性增加而顯著減小。

4結論

筆者在本研究中從柑橘周緣嵌合體紅肉胡柚實生后代中發掘到1株四倍體，分子標記鑒定其遺傳組成與紅肉胡柚L2供體常山胡柚一致。對該四倍體單株進行了形態學、解剖學、色素含量等的評價，為未來培育三倍體無核新品種提供了四倍體新種質。

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