玫瑰精油對鱘魚源陰溝腸桿菌的抑菌作用

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2025.06.002

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A 文章編號：1004-6755（2025）06-0013—0：

Antibacterial Effectofrose essential oilon Enterobacter cloacae isolated from sturgeon ?

YANG Wenjing1，MIAO Qiang1， XIA Mingxue1， SUI Aishan1，WANG Xiaolei2， SUI Zhihai1 （1.ColegeofLifcesofUvsity；lgeouatiofUvsity） Abstract：A dominant strain was isolated from tisues of the diseased hybrid sturgeon and the moist，small and protruding，translucent round white colonies were formed on LB plate. The 16S rRNA gene sequence and phylogenetic tree analysis showed that the isolated strain shared the 99.79% identity with Enterobacter cloacae PHLTA -11 and was on the same branch with PHLTA -11 and E . cloacae PFl09X. Therefore，the isolated strain was identified as E cloacae. The minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of rose essential oil （REO） against the isolated strain were 5μL/mL and 10μL/mL ，respectively. The antibacterial effect of REO was in a dose-dependent manner.

Key words：hybrid sturgeon; 16S rRNA; Enterobacter cloacae ; rose essential oil;antibacterial effect

鱘魚（Acipenseriformes）是重要的冷水魚養殖品種之一[1]。由于其肉質鮮美、富含不飽和脂肪酸及市場對魚子醬的高需求，2022年國內養殖產量達到 130 951t^[2-3] 。然而鱘魚常因細菌、真菌、病毒及寄生蟲等感染而頻發病害，引起死亡，造成嚴重的經濟損失[4-5]。

陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae）是一種革蘭氏陰性菌，可感染人類及多種水生生物，引起皮膚軟組織感染、泌尿系統感染、呼吸道感染和敗血癥等[6-8]。鑒于目前臨床上分離的陰溝腸桿菌已對部分抗生素產生耐受性，亟需開發新型抗生素或探尋替代品[9]。

玫瑰精油從玫瑰中提煉，具有特殊的香味，無毒，安全，已廣泛應用在醫療保健、化妝品和保鮮行業等[10]。玫瑰精油對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都具有抗菌活性，可用于治療和預防細菌性疾病[11]。因此，本研究從鱘魚患病魚體中分離純化優勢菌并鑒定種類，探究玫瑰精油體外抑菌活性。

1材料與方法

1.1 試驗用魚

從省市河東區某鱘魚養殖場收集瀕臨死亡的雜交鱘_西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）吊 x 史氏鱘（Acipenserschrencki）]。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌分離與純化

在超凈工作臺中，按照10倍稀釋并取100μL 涂布在LB平板上， 28^°C 過夜培養。挑取優勢菌株，在LB劃線。

1.2.216SrRNA的克隆與序列比對

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，作為PCR的模板。使用16SrRNA的通用引物（27F和1492R），按照TaqPCRMas-terMix（KT201，天根）說明書配置反應體系和設置反應程序。擴增結束后，PCR產物送至生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 系統發育分析

測序結果采用NCBI中的BlastN比對[12]，下載16SrRNA同源基因序列，用MEGA-X軟件采用鄰接法（Neighbor—joiningmethod，NJ）構建系統發育樹。

1.2.4 測定最低抑菌濃度（Minimum inhibitoryconcentration，MIC）

制備含有不同濃度（20，10，5，2.5，1.25，0.625， 0.3125， 0.15625μL/mL） 精油的MH肉湯培養基，取 200μL 加入96孔板中，然后加入菌液（終濃度為 1×10⁵ （ CFU/mL） ，設置陰性對照。每組3個平行，置于 的培養箱中培養24h 。使用酶標儀測定 OD₆₀₀ ，以每組澄清孔（ OD₆₀₀lt;0.05） 對應的最小濃度為最低抑菌濃度。1.2.5測定最低殺菌濃度（Minimumbacteri-cidal concentration，MBC）吸取 100μL 上述在4MIC、2MIC和1MIC條件下的培養物，直接涂布于LB固態平板上，倒置培養于 28^°C 培養箱中， 24h 后，觀察平板是否存在細菌生長現象。

1.2.6玫瑰精油對細菌生長的影響測定

過夜培養細菌，按照 1% 轉接至新鮮的LB培養基中，再加入玫瑰精油，使其終濃度為 1，1/2 ，1/4，1/8，1/16，1/32 和0MIC（作為對照）， 培養，分別在 0，2，4，6，8，10，12 和 ^14h 測定OD₆₀₀ 值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態特征

從患病鱘魚中分離得到一株優勢菌，其菌落呈圓形，濕潤，邊緣整齊，中間凸起，半透明，乳白色（圖1）。

2.2 16SrRNA的擴增和序列比對

PCR擴增 基因：在不同的退火溫度下，均產生了單一條帶，大小在 1 000～2 000bp （20中間，與預期相一致（圖2A）。利用在線BlastN比對顯示：該菌株與EnterobactercloacaePHL-TA—11（GenBank：FN401343.1）相似度最高，達到 99.79% ；系統發育樹顯示：分離菌株與 E cloacaePHLTA-11和 E .cloacaePF109X聚集在同一個分支上（圖2B），從而判定該分離菌株為陰溝腸桿菌。

注： M 是Marker， _1-4 是在不同的退火溫度 .52^°C ， 54^°C ，56^°C ， 58^°C 下擴增，5是陰性對照。

2.3玫瑰精油對陰溝腸桿菌的抑制活性

通過微量稀釋法測定玫瑰精油對陰溝腸桿菌 的MIC為 5μL/mL 。涂布平板法顯示玫瑰精油 對陰溝腸桿菌的MBC為 10μL/mL。

2.4不同濃度的玫瑰精油對陰溝腸桿菌生長曲線的影響

陰溝腸桿菌在不同濃度玫瑰精油處理下生長速度降低，并且在穩定期 OD₆₀₀ 值也顯著減少；這種抑制作用呈現劑量依賴關系（圖3）。

3討論

目前已發現維氏氣單胞菌、海豚鏈球菌、溫和氣單胞菌等病原菌可感染雜交鱘，引起出血癥和內臟組織損傷等而導致其死亡[13-14]，但尚未見陰溝腸桿菌的報道。本研究從患病雜交鱘分離鑒定其為陰溝腸桿菌。本結果增加了陰溝腸桿菌的感染宿主。

目前已從不同種的養殖病魚體分離出多重耐藥菌株，如遲緩愛德華氏菌、熒光假單胞菌、魯氏耶爾森菌等[15-16]，因此，尋找新型高效的抗生素替代品迫在眉睫。這也成為促進水產養殖業綠色高質量發展的重要舉措[17]。植物類精油是一種綠色安全的抗生素替代品，已經被證實存在抑菌、抗氧化等活性，可作為防霉劑、促生長劑、免疫刺激劑和保鮮劑等應用在水產養殖和水產品存儲環節[18]。本研究確認了玫瑰精油對陰溝腸桿菌存在抑菌和殺菌活性，并且抑菌活性存在劑量效應。

參考文獻：

[1]李思忠.中國鱘形目魚類地理分布的研究[J].動物學雜志，1987，22（4）：35-40.

[3]BRONZI P，ROSENTHAL H，GESSNER J. Global stur-geon aquaculture production：an overview[J]. Journal of Ap-plied Ichthyology，2011，27（2）：169-175.

[4]張金峰.鱘魚人工養殖常見病害的發生及防控對策[J]．江西水產科技，2021（2）：51-52.

[5]YANG J，TIAN T，XIAO K，et al.Pathogenic infection andimmune一related gene expression of Chinese sturgeon （Acipensersinensis）challenged by Citrobacter freundii[J].Developmentaland Comparative Immunology，2020（1l4）：103872

[6］李席席，皮大明，高曉建，等．羅氏沼蝦病原陰溝腸桿菌藥物敏感性測定與分析[J]．淡水漁業，2018，48（5）：48-53.

[7]冀召帥，劉岸，安揚，等．2018—2021年某院陰溝腸桿菌耐藥特征及與抗菌藥物使用強度的相關性分析[J]．檢驗醫學與臨床，2023，20（16）：2334-2338.

[8]PREENA PG，DHARMARATNAM A， RAJ N S， RAJA SA，NAIRRR，SWAMINATHAN TR. Antibiotic-resist-ant Enterobacteriaceae from diseased freshwater goldfish[J].Archives of microbiology，2021，203（1）：219-231.

[9］孫倩，溫海楠，秦璞，等．河北省2016—2021年血標本分離陰溝腸桿菌耐藥性分析[J]．中國熱帶醫學，2023，23（3）：221—226，245.

[10]安比芳，陳創業，喬桂芳，等．玫瑰精油的提取及應用研究進展[J]．安徽農業科學，2024，52（10）：6-10.

[11]DEMIREL S. Medical evaluation of the antimicrobial activi-ty of rose oil on some standard bacteria strains and clinicallsolatesJ].Alternative Therapies in Health and Medicine，2022，28（6）：52-56.

[12]National Institutes of Health. BLAST，N[DB/OL]. [2025-03—26]http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.

[13］劉家星，陶麗竹，陳健，等．雜交鱘源維氏氣單胞菌的分離鑒定及人工感染后組織中HSP70基因的表達分析[J]．黑龍江畜牧獸醫，2023（14）：125—131.

[14]王靜，鄧玉婷，姜蘭，等．雜交鱘海豚鏈球菌分離鑒定及藥物敏感性[J]．云南農業大學學報（自然科學），2020，35（6）：1010—1015.

[15］李敏，葉毅飛，李永福，等．黃唇魚遲緩愛德華氏菌分離鑒定及藥敏分析[J]．南方水產科學，2024，20（2）：140-149.

[16]王曉磊，姜彤彤，張潔，等．一株草魚源熒光假單胞菌的分離鑒定及其耐藥特性分析[J]．河北漁業，2023（6）：14—17.

[17］本刊訊.農業農村部部署 2024年水產綠色健康養殖技術推廣“五大行動\"[J].中國水產，2024（4）：22-25.

[18] BANDEIRA G，PES TS， SACCOL E M， et al. Potential u-ses of Ocimum gratissimum and Hesperozygis ringens es-sential oils in aquaculture[J]. Industrial Crops and Prod-ucts，2017（97）：484-491.