TTC-MMP12184-225疫苗對肺癌的影響及其機制

[中圖分類號] R734.2 [文獻標志碼] A

Effect of TTC-MMP12184-22s vaccine against lung cancer and associated mechanismsHUANG Huan ， LIU Fengjun，WANG Shan， LI Xu ，WANG Bin（Department of Pathogen Biology，School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigatetheeffectof theTTC-MMP12184-25 Vaccine，which is derived from matrix meallo proteinase12（MMPl2）and tetanustoxin C-fragment（TTC），forthetreatmentoflung cancerand theunderlying mechanisms. MethodsThe Tumor Immune Estimation Resource（TIMER）database was used to analyze the relative mRNA expresionof MMP12 inthe tumortissues andadjacent normaltissuesofpatients withlungcancer.Asubcutaneoustumor modeloflung cancer was established by subcutaneously inoculating Lewis lung carcinoma （LLC） cells at 2-3 cm below the right axilla of 6-8 week-old C57BL/6J female mice. When the tumor volume reached approximately 100mm³ ，the lungs and tumors were isolated to determine the mRNA expression of MMP12 byRT-qPCR. The CD8⁺T cell epitopes， CD4⁺T cell epitopes，and B cell epitopes of MMP12 werepredictedontheNetCTL-1.2，SYFPEITHI，and SVMTripwebsites，respectively.Theimmunogenicityofthedominant epitopes wasanalyzedusing the VaxiJen-2.O server.The secondarystructure and hydrophilityof MMP12 wereanalyzed byusing DNAstar software.TTC-MMP12184-2s protein was synthesized through the Escherichia coli prokaryotic expresion system，and the product was identified with Coomassie blue staining. Subcutaneously inoculated with LLC cels at 2-3cm below the right axilla，a group of 6-8 week-old C57BL/6J female mice were randomized to receive intramuscular injection of 100μL PBS containing either 20μg TTC（control group）or 20μg TTC-MMP1 2_184-225 （experimental group），once every 7 d for a total of 3 times.On the third day after the last injection，the tumors were isolated for volume measurement；the proportions of CD4⁺T cells and CD8⁺T cels intmors weredeterminedbyflowcytometry；andtherelativemRNAexpresionlevelsofC-Cmotifchemokineligand5 （CCL5），C-X-Cmotifchemokineligand9（CXCL9），interleukin-2 （IL-2），interferon gamma（IFN-γ），granzyme B（GRZB），and perforin（PFP）in tumors were measured by RT-qPCR. Results

The TIMER andRT-qPCR results showed thatthe expresionof MMP12 wassignificantly increased in both patients with lung cancer and the mouse model of lung cancer compared with adjacent normal tissues and lung tissues （ Plt;0.001，0.05 ）. The epitope prediction results showed that MMP12_184-225 contained 12CD8⁺T cell epitopes， 9CD4⁺T cell epitopes，and 3 B cell epitopes. The VaxiJen-2.O analysis results showed that the immunogenicity score of MMP12_184-225 was O.61. The DNAstar analysis showed that （20 MMP12_184-225 was composed of hydrophilic peptides mainly consisting of β -turns.The Coomassie blue staining results showed that TTC- MMP12_184-225 protein exhibited a clear band below the relative molecular mass of 60 Ooo.Compared with those in the control group，the mice intheexperimental group showed a significantlyreduced tumor volume，significantly increased proportionsof CD4⁺T cells and CD8⁺T cells in tumors，and significantly increased relative expression levels of CCL5，CXCL9， IL-2，IFN-γ， GRZB ，and PFP mRNA in tumors （t=2.57-4.60，Plt;0.05） .Conclusion The TTC-MMP12184-225 vaccine exerts an anti-lung cancer effect by promoting the recruitment of CD4⁺T cells and CD8⁺T cells and increasing the expression of antitumor-related cytokines in tumor tissues.

[KEY WORDs]Matrix metalloproteinase 12； Tetanus toxin；Cancer vaccines； Lung neoplasms；Chemotactic factors；T-lymphocytes

肺癌是中國乃至全球人群中發病率和死亡率最高的腫瘤之一[1-2]。傳統放療和化療對肺癌雖有一定療效，但效果有限，且常引起嚴重不良反應[3-4]。腫瘤疫苗因其可以主動誘導機體免疫系統殺傷腫瘤細胞，被視為極具前景的腫瘤免疫治療手段之一。腫瘤疫苗由腫瘤抗原和佐劑組成，主要包括全細胞疫苗、多肽疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗4類[5]?；|金屬蛋白酶12（MMP12）是一種腫瘤相關抗原，其在正常組織中不表達或僅有少量表達，而在肺癌、胃癌以及肝癌等多種惡性腫瘤中呈高表達[6-8]MMP12已被證實可作為重要的調節因子參與腫瘤生長、遷移、血管生成以及免疫逃逸等多個階段[9]破傷風毒素C片段（TTC）是一種來源于破傷風毒素C端結構域的無毒片段，因其含有可被人類或小鼠T細胞識別的通用T細胞輔助表位，已被廣泛用作腫瘤疫苗佐劑[10-11]。本研究擬利用MMP12 優勢表位肽段和佐劑TTC合成一種治療性腫瘤疫苗，并通過小鼠皮下腫瘤模型探究其對肺癌的治療作用，旨在為腫瘤疫苗的研發提供新視角。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

卡那霉素和超快速凝膠蛋白染色液購自大連美侖生物技術有限公司，異丙基 β -D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，速溶型蛋白上樣緩沖液購自上海雅酶生物科技有限公司，小鼠腫瘤浸潤組織淋巴細胞分離試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，CD16/32抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，APC-抗小鼠CD3抗體、PerCP/Cy5.5-抗小鼠CD4抗體和APC/Cyanine7-抗小鼠CD8抗體購自北京達科為生物技術有限公司，FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit、HiScript II Q RT SuperMix（+gDNA wiper）和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2采用腫瘤免疫評估資源（TIMER）數據庫分析肺癌患者組織中MMP12的表達

從 TIMER 數據庫（https：//cistrome.shin-yapps.io/timer/）中選取DiffExp模塊，分析肺癌患者腫瘤組織和鄰近正常組織中 的相對表達水平。

1.3 肺癌小鼠皮下腫瘤模型的構建

6～8 周齡C57BL/6J雌性小鼠6只，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，飼養于SPF級動物實驗室，溫度 21～26^°C ，濕度 50%～60% ， 12/12h 晝夜光照節律，自由進食飲水，實驗前適應性飼養1周。將Lewis肺癌（LLC）細胞[賽百慷（上海）生物技術股份有限公司]加入含 10% FBS和 1% 雙抗的高糖DMEM培養基中，置于 、含體積分數0.05CO₂ 的培養箱中培養。取對數生長期LLC細胞，胰酶消化后離心得到細胞沉淀，PBS重懸，皮下接種于小鼠右側腋窩下 2～3cm 處（每只接種 1×10⁶ 個細胞）。待腫瘤體積約達到 100mm³ 時，腹腔注射1.25% 即用型三溴乙烷 （30mL/kg） 麻醉后脫頸椎處死小鼠，解剖并分離肺組織和腫瘤組織用于后續實驗。

1.4 MMP12表位預測

分別使用NetCTL-1.2[12]、SYFPEITHI（ht-tp：//www.syfpeithi.de/）[13] 和 SVMtrip （http：//sysbio. unl. edu/SVMTriP/prediction. php ）[14]對MMP12蛋白中 CD8⁺T 細胞表位、 CD4⁺T 細胞表位和B細胞表位進行預測。 CD8⁺T 細胞表位和B細胞表位的設置選擇默認閾值， CD4⁺T 細胞表位的設置選擇HLA-DRB1等位基因且評分 gt;20 。使用VaxiJen-2.0服務器[15]分析優勢表位的免疫原性，評分 gt;0.5 視為強免疫原。使用DNAstar軟件分析MMP12的二級結構和親水性，選擇位于β轉角和無規則卷曲處且親水性較好的表位，避免選擇位于α 螺旋和 β 折疊處且親水性較差的表位。

1.5TTC-MMP12184-225蛋白的表達、純化與鑒定

構建包含有 TTC-MMP12_184-225 DNA片段的pET30a重組質粒，轉化到BL21（DE3）感受態細胞中，使用含有 30mg/L 卡那霉素的LB培養基培養，使用酶標儀在波長 600nm 下檢測培養液吸光度值，當吸光度值達到0.6時，向細胞培養體系中加入IPTG誘導 TTC-MMP12_184-225 蛋白的表達。利用Ni-NTA純化系統對TTC- MMP12_184-225 蛋白進行純化，透析到 pH 值為8.0的緩沖液 （50mmol/L Tris.300mmol/LNaCl，0.1% 肌氨酰、 2mmol/L DTT）中，使用PEG20000濃縮，與速溶型蛋白上樣緩沖液混勻，于沸水中加熱 10min ，使用聚丙酰胺凝膠進行電泳。電泳后的凝膠浸泡在超快速凝膠蛋白染色液中振搖 15min 進行考馬斯亮藍染色。

1.6 小鼠分組及處理

6～8 周齡 C57BL/6J 雌性小鼠12只，同1.3中方法進行飼養并接種LLC細胞。在細胞接種后第7天（大部小鼠腫瘤體積達到 50～75mm³ ），剔除腫瘤體積不足 50mm³ 或超過 75mm³ 的小鼠。將剩余小鼠隨機分為對照組和實驗組，每組4只。對照組和實驗組小鼠分別肌肉注射 100μL 含有 20μg TTC或TTC-MMP12184-225蛋白的PBS，每7d注射1次，總共注射3次；在末次注射后的第3天，腹腔注射 1.25% 即用型三溴乙烷 （30mL/kg） 麻醉后脫頸椎處死小鼠，分離腫瘤組織用于后續實驗。測量腫瘤的最長直徑 （L） 和最短直徑（W），并計算腫瘤體積 （V） 。 V=L×W²/2 。

1.7流式細胞術檢測兩組小鼠腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）表型

用眼科剪將兩組小鼠腫瘤組織剪碎至直徑約1～2mm 的碎塊，使用DNAse I（0.01g/L） 和膠原酶 IV（1g/L） 對腫瘤組織進行消化，并按照小鼠腫瘤浸潤組織淋巴細胞分離試劑盒說明書步驟制備TIL單細胞懸液。兩組小鼠各取 80μL TIL單細胞懸液于EP管內，每管加入 1.0mgCD16/32 抗體室溫封閉 10min ，而后按照各抗體說明書推薦稀釋比向每管中加入APC-抗小鼠CD3抗體、 .PerCP/Cy5.5- 抗小鼠CD4抗體以及APC/Cyanine7-抗小鼠CD8抗體，于 4^°C 下避光染色 30min 。染色結束后，PBS清洗細胞，使用BDFACSAriaI流式細胞儀對CD4⁺T 細胞以及 CD8⁺T 細胞進行檢測，以 CD3⁺ CD4⁺ 細胞的比例作為 CD4⁺T 細胞比例，以 CD3⁺ CD8⁺ 細胞的比例作為 CD8⁺T 細胞比例。

1.8RT-qPCR實驗檢測肺組織和腫瘤組織中MMP12和各細胞因子mRNA的相對表達水平

以 FastPure Complex Tissue/Cell Total RNAIsolationKit提取1.3和1.6中肺組織和腫瘤組織中的總 RNA，并使用 HiScriptII Q RT SuperMix（+gDNA wiper）將RNA 樣本逆轉錄為cDNA，據ChamQSYBRqPCRMasterMix說明書配置反應體系，使用羅氏LightCycle480qPCR儀進行相關基因檢測，以 β-actin為內參，采用 2^-ΔΔCT 的方法計算目的基因的相對表達水平。引物序列見表1。

1.9 統計學處理

采用GraphPadPrism9.5.O軟件對數據進行統計學分析。計量資料以 表示，兩組間比較采用 Ψ_t 檢驗。以 Plt;0.05 為差異有顯著性。

2結果

2.1肺癌患者腫瘤組織以及肺癌小鼠皮下腫瘤模型組織當中MMP12的表達

TIMER數據庫分析結果顯示，MMP12在肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細胞癌（LUSC）患者腫瘤組織中mRNA的相對表達水平顯著高于鄰近正常組織（ Plt;0.001 ，見圖1。RT-qPCR實驗結果顯示，肺癌小鼠皮下腫瘤模型中肺組織和腫瘤組織MMP12mRNA的相對表達水平分別為 1.02±0.24 以及2.61±0.85 ，腫瘤組織中 的相對表達水平顯著高于肺組織 （t=3.61，Plt;0.05） 。

2.2 MMP12表位預測結果

NetCTL-1.2、SYFPEITHI以及SVMtrip表位預測服務器的評分分析結果顯示，MMP12蛋白上的第184到第225個氨基酸 ?MMP12_184-225， 包含12個 CD8⁺T 細胞表位、9個 CD4⁺T 細胞表位以及3個B細胞表位，見表2。VaxiJen-2.0服務器免疫原性分析的結果顯示， MMP12_184-225 免疫原性評分為0.61。DNAstar軟件二級結構以及親水性分析的結果顯示， MMP12_184-225 是以 β 轉角為主的親水肽段。詳見圖2。

2.3 TTC-MMP12184-225的鑒定

考馬斯亮藍染色結果顯示，TTC-MMP12184-25蛋白在相對分子質量60000位置下方出現明顯蛋白條帶，見圖3。

2.4各組小鼠腫瘤體積比較

對照組和實驗組小鼠腫瘤體積分別為 （1.10± 0.26）和 （0.57±0.12）cm³ ，與對照組相比較，實驗組小鼠的腫瘤體積顯著性減小 （t=3.25，Plt;0.05） 。見圖4。

2.5各組小鼠腫瘤組織內TIL表型比較

流式細胞術結果顯示，對照組和實驗組小鼠腫瘤內 CD4⁺T 細胞的比例分別為 （10.11±2.72）% 和（16.88±1.11）% CD8⁺T 細胞比例分別為 （6.30±1.53% 和 （10.29±2.71）% 。實驗組小鼠腫瘤組織內 CD4⁺T 和 CD8⁺T 細胞比例均顯著高于對照組0 _t=4.60，2.57，Plt;0.05） 。見圖5。

2.6各組小鼠腫瘤組織中各細胞因子mRNA相對表達水平比較

RT-qPCR實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠腫瘤組織當中的C-C基序趨化因子配體5（CCL5）、C-X-C基序趨化因子配體9（CXCL9）、白細胞介素-2（IL-2）、γ干擾素（ ?IFN-γ ）、顆粒酶B（GRZB）和穿孔素 （PFP）mRNA 的相對表達水平均顯著升高 （t=2.90～4.18，Plt;0.05） ，腫瘤壞死因子 -α（TNF-α ）mRNA相對表達水平無顯著差異中 ?Pgt;0.05） 。見表3。

3討論

基于抗原表位的多肽疫苗因其精準靶向、高安全性和易于生產等優勢，已成為腫瘤免疫治療的有效方法之一[16]。多肽疫苗開發的第一步是腫瘤抗原的選擇。理想的腫瘤抗原應具備以下特點： ① 在腫瘤中高表達，而在正常組織中低表達甚至不表達；② 與腫瘤細胞的存活和增殖密切相關； ③ 具有較高的免疫原性[17]。MMP12是一種蛋白水解酶，可降解包括彈性蛋白在內的多種細胞外基質成分，其已被證實在包括肺癌在內的多種腫瘤中高表達，參與腫瘤發生發展的多個階段9]，此外在患者體內亦可檢測到MMP12抗體[18]].

本研究中，TIMER數據庫分析和RT-qPCR實驗結果顯示，MMP12在肺癌患者和肺癌小鼠皮下腫瘤模型腫瘤組織中均呈顯著高表達，與先前研究結果相同。因此，本研究選擇MMP12作為候選抗原并對其 CD8⁺T 細胞表位、 CD4⁺T 細胞表位和B細胞表位進行預測。免疫原性以及二級結構和親水性分析結果顯示， MMP12_184-225 是一段以 β 轉角為主的包含多個表位的親水肽段，且可作為一種強免疫原，這提示 MMP12_184-225 可作為MMP12的優勢肽段，用于腫瘤多肽疫苗的制備。

然而，有研究表明多肽的相對分子質量較小，在體內半衰期短且免疫原性低，單獨使用時往往不足以刺激機體產生強烈免疫應答，因此導致其在體內的生物學作用有限[19]。TTC是一種含有T細胞輔助表位的佐劑。本研究通過大腸桿菌原核表達系統將 MMP12_184-225 與佐劑TTC 相融合，得到具有T細胞輔助表位的 TTC-MMP12_184-225 蛋白。對該蛋白進行提取、純化、凝膠電泳后，考馬斯亮藍染色結果顯示，在相對分子質量60000附近出現明顯蛋白條帶，表明 TTC-MMP12_184-225 蛋白合成且純化成功。

促進腫瘤特異性 T 細胞介導的抗腫瘤反應，尤其是 CD8⁺T 細胞介導的免疫反應，是腫瘤免疫治療的關鍵[20]。與 CD4⁺T 細胞相比， CD8⁺T 細胞具有更強腫瘤細胞殺傷作用。腫瘤微環境中 CD8⁺T 細胞的數量被認為是腫瘤預后的關鍵標志物[21]。CD8⁺T 細胞可通過顆粒胞吐途徑（釋放穿孔素和顆粒酶）和死亡受體途徑直接殺傷腫瘤細胞，此外也可以分泌TNF- ?α 等細胞因子間接殺傷腫瘤細胞[22]。CD4⁺T 細胞可通過分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子促進 CD8⁺T 細胞的增殖、分化，并且可提高其細胞毒性，在維持 CD8⁺T 細胞免疫應答當中發揮重要作用[23-24]。趨化因子在介導免疫細胞向腫瘤內遷移過程中發揮重要作用，其中CXCL9、CXCL1O和CX-CL11是介導T淋巴細胞遷移的主要趨化因子[25]。研究表明，CCL5和CXCL9與腫瘤中 CD8⁺T 細胞浸潤的相關性最高，CXCL9、CXCL10和CCL5在募集效應T細胞進入腫瘤過程中具有協同作用[26]。本研究結果顯示，肌肉注射 TTC-MMP12_184-225 疫苗能夠使小鼠肺癌皮下腫瘤模型的腫瘤體積減小，并使腫瘤組織中與T細胞遷移和抗腫瘤功能相關的CXCL5，CXCL9，IL-2，IFN-γ，GRZB 以及PFPmRNA相對表達水平上調，同時提高腫瘤組織中CD4⁺T 細胞和 CD8⁺T 細胞的占比。上述結果提示，TTC-MMP12184-225疫苗可以通過上調腫瘤組織中IL-2、IFN- ?γ 、CXCL9等細胞因子的表達，促進CD4⁺T 細胞和 CD8⁺T 細胞向腫瘤內的募集和對腫瘤細胞的殺傷力。

本研究結果表明， TTC-MMP12_184-225 疫苗具有顯著的抗肺癌效果，這提示以MMP12為靶點的腫瘤疫苗開發具有一定可行性。本研究的局限性在于只探究了TTC-MMP12184-225疫苗對肺癌的抗腫瘤作用，后續應進一步探究其在其他MMP12高表達腫瘤（如胃癌和肝癌）中的作用。

目前，聯合治療是腫瘤免疫治療的新方向之一，多種聯合治療方案已進入臨床試驗階段。一項I期臨床試驗結果顯示，腫瘤疫苗mRNA-4157和免疫檢查點抑制劑帕博利珠單抗的聯合使用有助于促進特異性 CD8⁺T 細胞免疫反應[27]；另一項黑色素瘤Ⅲ期臨床試驗顯示，在維莫非尼和考比替尼的靶向藥物治療中加入免疫檢查點抑制劑阿替利珠單抗，顯著延長了患者無進展生存期并降低了疾病進展風險[28]。以上研究結果提示，后續研究可進一步探討

TTC-MMP12184-225疫苗與靶向藥物療法、免疫檢查點抑制劑療法等其他治療方式聯合應用的抗腫瘤效果及其機制。

綜上所述， TTC-MMP12_184-225 疫苗能夠促進肺癌小鼠腫瘤組織中 CD4⁺ 和 CD8⁺T 細胞的募集以及抗腫瘤相關細胞因子的表達，從而發揮其對肺癌的抗腫瘤效果。本研究有望為腫瘤疫苗的研發提供新思路。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過大學醫學倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-2024732）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的條例進行。作者聲明：黃歡、劉俸君、王斌參與了研究設計；黃歡、李旭、王珊參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 李京蔓 厲建強）