一種人類巨細胞病毒間接ELISA檢測方法的建立

[中圖分類號] R446.6 [文獻標志碼] A

Establishment of an indirect ELISA method for detection of human cytomegalovirusLI Xu，WANG Shan，HUANG Huan，WANG Bin，QIAN Dongmeng （School of Basic Medicine，Qingdao University，Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjetiveToestablish an indirect ELISA method forthe detection of human cytomegalovirus（HCMV） basedon HCMVIE1/pp65/ppl50recombinant protein.MethodsFrom Juneto December 2024，5 serum samples from HCMV IgG-positive patients，50 serumsamples from HCMV IgG-negative patients，as wellas8 serum samples each from the patients with positive herpessimplexvirus-1（HSV-1），herpessimplex virus-2（HSV-2），andEpstein-Barr virus（EBV），and349 serum samplesfromvoluntersundergoingphysical examinationwerecolectedfromQingdaoMunicipal Hospital.AnindirectELISA method for HCMVwas establishedbyoptimizingthedetectionconditionssuchasserumdilutionratioand thetypeofblocking solution，and the cut-off value of this method was determined;coefficient of variation （ CV_? ）wascalculated to verifythe repeatability of themethod;thesensitivityandspecficityof themethodwereassessdbydetectingtheserumsamplesfromthepatientswithpositive HCMV IgG，HSV-1，HSV-2，andEBVatvarious dilutionratios；theconsistencyrate between HCMVindirectELISA and cytomegalovirus IgGELISAkitwasassessedbyanalyzing theserumsamplesof349healthyvoluntersundergoing physicalexamination atthe outpatient service.ResultsThe optimal antigen-coating concentration of HCMV indirect ELISA assay was 3.0mg/ （204號 L，with an optimal serum dilution ratio of 1：200 ，an optimal blocking solution of 5% bovine serum albumin，an optimal blocking time of 2h ，an optimal serum incubation time of 90min ，an optimal dilution ratio of the second antibody of 1：8 000 ，an optimal incubation time of the second antibody of 30min ，and an optimal color development time of 15min . The cut-off value of HCMV indirect ELISA assay was O.36O，with an intra- or inter-batch CV of 10% and a sensitivity of 1：3 200 ，and the absorbance values of serumsamplesfrom HSV-1，HSV-2，andEBV-positive patients wereallbelowthecut-off value.Theoverallconsistencyrate between HCMV indirect ELISA and cytomegalovirus IgG ELISA was 94.0% .ConclusionAn indirect ELISA method is successfull establishedfordetecting HCMVwithHCMVIE1-pp65-ppl50recombinant proteinasthecoatingantigen，andthis method has good repeatability，specificity，sensitivity，and consistency rate.

[KEY WORDs]Cytomegalovirus; Immediate-early proteins;Phosphoproteins; Recombinant proteins； Serologic tests;Enzyme-linked immunosorbent assay

人類巨細胞病毒（HCMV）是一種線性雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒的 β 亞家族，在人群當中流行廣泛，對于宿主物種具有嚴格的趨向性[1-3]。

HCMV的原發性感染和再激活可能會導致免疫功能低下的患者出現嚴重的并發癥甚至死亡。因此，選擇具有較高診斷效能的抗原標志物對于實現HCMV感染的早期精準鑒別至關重要。HCMV即刻早期蛋白1（IE1）是調控病毒早期及晚期基因時序性表達的分子開關，其功能缺失將導致病毒基因組沉默及感染進程中斷[4]；磷蛋白 65（pp65） 在不同HCMV株間高度保守，在病毒顆粒的組裝和釋放過程中起重要作用[5]；pp150是病毒衣殼蛋白，幾乎100% 與HCMV血清陽性個體的 IgG 抗體發生特異性反應，與其他皰疹病毒蛋白質沒有同源性。本研究基于HCMV IE1/pp65/pp150 重組蛋白，旨在建立一種檢測人類血清中HCMVIgG抗體的間接ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2024年6一12月于青島市市立醫院收集HC-MVIgG陽性患者血清樣本5份和HCMVIgG陰性患者血清樣本50份（經巨細胞病毒核酸檢測和巨細胞病毒IgGELISA試劑盒檢測驗證），單純皰疹病毒（HSV）-1型、HSV-2型、人類皰疹病毒4型（EBV陽性患者血清樣本各8份，門診健康體檢志愿者血清樣本349份。

1.2 主要試劑和耗材

96孔聚乙烯微量反應板購買于美國Costar公司，HRP標記的山羊抗人IgG抗體（二抗）購買于武漢愛博泰克生物科技有限公司，酶標儀購買于德國BMGLABTECH公司，四甲基聯苯胺（TMB）顯色液購買于浙江彼安德生物科技有限公司，巨細胞病毒 IgG ELISA試劑盒購買于珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司。 HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白，濃度為 0.5g/L ，為本實驗室保存，其具體蛋白序列如下：SPMTTTSTSQKPVLGKRVATPHASAR-AQTVTSTPVQGRLEKGGSGGGSGSSMLSSASP-SPAKSAPPSPVKGRGSRVGVPSLKGGSGGGSG-SSRAASTTPTYPAVTTVYPPSSTAKSSVSNAPP-VASPSILKPGGGSGGGSGSGSAGMGGAKTPSD-AVQNILQKIEKGGSGGGSGSEPMSIYVYALPL-KMLNIPSINVHHYGGSGGGSGSISHIMLDVAF-TSHEHGGSGGGSGSYQEFFWDANDIYRIFGGS-GGGSGSQIKVRVDMVRHRIKEHMLKKGGSG-GGSGSMLAKRPLITKPEVISVMKRRIEEICMK-VFAQY.

1.3 HCMV間接ELISA檢測方法優化

1.3.1HCMV間接ELISA 檢測方法初始步驟將HCMV IE1/pp65/pp150 重組蛋白用 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 （pH9.6） 稀釋為濃度 3.0mg/L 的工作液，以 100μL/ 孔包被于96孔聚乙烯微量反應板中， 4^°C 孵育過夜。而后每孔加入 200μL5% 牛血清白蛋白（BSA），于 下封閉 ²h ;待測血清用5% BSA按 1：200 比例稀釋，每孔加入 100μL ，于 下孵育 ¹h ；二抗用PBST按 1：8 000 比例稀釋，每孔加入 100μL ，于 下孵育 ¹h 。而后每孔加入 100μL TMB顯色液，于 下避光反應15min 后，每孔加入 100μL1mol/L 磷酸溶液終止顯色。使用酶標儀在波長 450nm 下檢測每孔的吸光度值 （A₄₅₀） 。

1.3.2 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數的確定采用棋盤滴定法篩選最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數。將 HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白用 0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液 （pH9.6） 稀釋為濃度 0.5，1.0，3.0，5.0，7.0mg/L 的工作液，縱向包被于96孔聚乙烯微量反應板中，每孔 100μL 4^°C 孵育過夜；將 HCMVIgG 陽性和陰性患者血清樣本用 5% BSA按照 1：200.1：400.1：800.1 ：1600 比例稀釋，橫向加入封閉后的96孔聚乙烯微量反應板中，每孔 100μL，37^°C 孵育 ;其余步驟同1.3.1。陽性血清吸光度值與陰性血清吸光度值的比值（ ΔP/N 值） 陽性血清 A₄₅₀ /陰性血清 A₄₅₀ 。以 P/N 值大于2.1且為最大值時所用的抗原包被濃度和血清稀釋倍數為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數。

1.3.3最佳封閉液和最佳封閉時間的確定將HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以 100μL/ 孔包被于96孔聚乙烯微量反應板中， 4^°C 孵育過夜，分別用 5% 脫脂奶粉、 5% BSA、酪蛋白封閉液、 5% 雞卵白蛋白（OVA）和無蛋白快速封閉液作為封閉液，每孔 200μL，37^°C 分別孵育 1.2.3.4h ，將待測血清以最佳血清稀釋倍數稀釋，每孔加入 100μL，37^°C 孵育 ，其他步驟同1.3.1。每個條件均設置3個復孔，進行吸光度值檢測，結果取均值，用于計算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時所用的封閉液和封閉時間為最佳封閉液和最佳封閉時間。

1.3.4最佳血清孵育時間的確定將 HCMVIE1/pp65/pp150重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以最佳封閉液按照最佳封閉時間進行封閉。將待測血清以最佳血清稀釋倍數稀釋，每孔中加入 100μL 下分別孵育 10，20，30，60，90，120min ，其余步驟同1.3.1。每個條件均設置3個復孔，進行吸光度值檢測，結果取均值，用于計算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時所用的血清孵育時間為最佳血清孵育時間。

1.3.5 最佳二抗稀釋倍數和最佳二抗孵育時間的確定 將 HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以最佳封閉液按照最佳封閉時間進行封閉，將待測血清以最佳血清稀釋倍數稀釋，按照血清最佳孵育時間進行孵育。將二抗用PBST按 1：2000，1：4 000，1：6 000，1：8 000. 1：10 000 比例稀釋，每孔加入 100μL，37^°C 下分別孵育 10，20，30，60，90，120min ，其余步驟同1.3.1。每個條件均設置3個復孔，進行吸光度值檢測，結果取均值，用于計算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時的二抗稀釋倍數和孵育時間為最佳二抗稀釋倍數和最佳二抗孵育時間。

1.3.6最佳顯色時間的確定將HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白稀釋至最佳抗原包被濃度，以最佳封閉液按照最佳封閉時間進行封閉，將待測血清以最佳血清稀釋倍數稀釋，按照血清最佳孵育時間進行孵育，以最佳稀釋倍數稀釋二抗，按照二抗最佳孵育時間進行孵育。各孔加入 100μL TMB顯色液于 下避光顯色1、5、10、15和 20min ，其余步驟同1.3.1。每個條件均設置3個復孔，進行吸光度值檢測，結果取均值，用于計算 P/N 值。以 P/N 值大于2.1且為最大值時的顯色時間作為最佳顯色時間。

1.4HCMV間接ELISA檢測方法的臨界值確定

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法，檢測5O份HCMVIgG陰性患者血清樣本吸光度值，每份血清樣本重復檢測3次，計算平均值 和標準差（s），臨界值 。若待測樣本吸光度值高于臨界值則判定為HCMV感染陽性，反之則為HCMV感染陰性。

1.5 HCMV間接ELISA檢測方法的重復性分析

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法，采用5份HCMVIgG陽性患者血清樣本測定批內和批間變異系數 （CV） 。使用同一批次的HC-MVIE1/pp65/pp150 重組蛋白檢測血清樣本吸光度值，每個樣本設置3個復孔，根據檢測結果計算批內 CV 。使用3個不同批次的HCMVIE1/pp65/ppl50重組蛋白檢測血清樣本吸光度值，根據測定結果計算批間 CV 。 CV=s/π×100% 。

1.6 HCMV間接ELISA檢測方法的靈敏度和特異度檢測

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法，將HCMVIgG陽性患者血清樣本從 1：200 倍比稀釋至 1：12 800 ，檢測吸光度值時，每個稀釋度均設置3個復孔，結果取平均值，將吸光度值大于臨界值的最高稀釋度視為HCMV間接ELISA檢測方法的靈敏度。

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法，檢測HSV-1型、HSV-2型和EBV 陽性血清吸光度值，每個血清樣本重復檢測3次，結果取平均值。將HCMVIgG陽性患者和陰性患者血清分別作為陽性對照和陰性對照。通過比較HSV-1型、HSV-2型和EBV陽性血清吸光度值與臨界值的大小來考察HCMV間接ELISA檢測方法的特異度。

1.7 HCMV間接ELISA檢測方法符合率檢測

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法和巨細胞病毒IgGELISA試劑盒同時檢測349份門診健康體檢志愿者血清樣本，最終根據檢測結果計算兩種方法的陽性符合率、陰性符合率和總體符合率。陽性符合率 真陽性樣本數/（真陽性樣本數 + 假陰性樣本數） ×100% ；陰性符合率 真陰性樣本數/（真陰性樣本數 + 假陽性樣本數） x 100% ；總體符合率 （真陽性樣本數 + 真陰性樣本數）/總樣本數 ×100% 。上述計算公式中，真陽性樣本為兩種方法檢測結果均呈現陽性的血清樣本，真陰性樣本為兩種方法檢測結果均呈現陰性的血清樣本，假陰性樣本為HCMV間接ELISA檢測方法檢測結果呈現陰性而巨細胞病毒 IgG ELISA試劑盒檢測結果呈現陽性的血清樣本，假陽性樣本為HC-MV間接ELISA檢測方法檢測結果呈現陽性而巨細胞病毒IgGELISA試劑盒檢測結果呈現陰性的血清樣本。

2結果

2.1最佳抗原包被濃度以及最佳血清稀釋倍數的確定

HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白的包被濃度 為 0.5mg/L ，血清的稀釋倍數為 1：200.1：400 、 1：800.1：1 600 時， P/N 值分別為9.470、8.400、 5.400.4.250 ；包被濃度為 1.0mg/L ，上述各稀釋倍 數對應的 P/N 值分別為 9.740，7.380，6.020，4.540 包被濃度為 3.0mg/L ，上述各稀釋倍數所對應的 P/N 值分別為11.170、10.180、7.770、4.380；包被濃 度為 5.0mg/L ，上述各稀釋倍數所對應的 P/N 值 分別為 10.960，9.160，6.880，4.500 ；包被濃度為 7.0mg/L ，上述各稀釋倍數對應的 P/N 值分別為 10.740、9.580、7.770、4.690。

2.2最佳封閉液和最佳封閉時間的確定

使用 5% 脫脂奶粉、 5% BSA、酪蛋白封閉液、5% OVA、無蛋白快速封閉液作為封閉液時，各封閉液所對應的 P/N 值分別為6.801、8.895、4.778、7.640、6.322。使用 5% BSA封閉 1，2，3，4h 后，計算的 P/N 分別為 8.096，9.004，7.821，7.858，

2.3最佳血清孵育時間的確定

血清孵育時間為 10，20，30，60，90，120min 時，各個時間點所對應的 P/N 值分別為4.700、7.078、8.490、8.215、8.648、7.930。

2.4最佳二抗稀釋倍數以及最佳二抗孵育時間的確定

二抗采用 1：2000，1：4000，1：6000，1： 8000及 1：10 000 比例稀釋時，各稀釋比所對應的P/N 值分別為8.312、8.424、8.951、9.290、7.888；二抗孵育時間為 10，20，30，60，90，120min 時，各個時間點所對應的 P/N 值分別為5.864、8.041、8.394、7.675、7.574、7.576。

2.5 最佳顯色時間的確定

在顯色1、5、10、15和 20min 時，各個顯色時間所對應的P/N值分別為5.557、6.324、8.599、9.843、9.477。

2.6 HCMV間接ELISA檢測方法的臨界值確定

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法檢測50份HCMV IgG 陰性患者血清樣本，檢測結果顯示吸光度值 為 0.269，s 為0.030，臨界值為0.360。

2.7 HCMV間接ELISA檢測方法重復性分析

以本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法檢測5份 HCMVIgG 陽性患者血清樣本，檢測結果顯示該方法的批內 CV 分別為 4.138%.4.115% 2.825%.3.879%.8.401% ，該方法的批間 CV 分別為 4.363%.7.270%.5.227%.7.167%.9.115% 。

2.8 HCMV間接ELISA檢測方法的靈敏度和特異度分析

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法， HCMVIgG 陽性患者血清樣本采用 1：200 、1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1： （204號12800比例稀釋時，吸光度值分別為2.399、1.671、1.319、0.892、0.591、0.313、0.242。

使用本研究所建立的HCMV間接ELISA檢測方法檢測HCMVIgG陽性患者血清樣本的吸光度值為1.337，HCMVIgG陰性患者血清樣本的吸光度值為0.234，HSV-1型、HSV-2型及EBV陽性血清樣本吸光度值分別為0.226、0.220、0.193。

2.9 HCMV間接ELISA檢測方法的符合率檢測

使用本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法和巨細胞病毒 IgG ELISA試劑盒同時檢測349份門診健康體檢志愿者血清樣本。其中，真陽性樣本276份，真陰性樣本52份，假陽性樣本13份，假陰性樣本8份。經計算，上述兩種方法的陽性符合率為 97.2% ，陰性符合率為 80.0% ，總體符合率為 94.0% 。

3討論

HCMV是一種感染率極高的皰疹病毒，其血清陽性率因不同國家的社會經濟背景而異，其中發達國家人群的HCMV血清陽性率為 45%～85% ，而發展中國家人群的HCMV血清陽性率則幾乎可達100%^[6-8] 。與其他皰疹病毒相比，HCMV可以感染大多數類型細胞或器官，并具有較高的發病率和病死率[9]。HCMV感染可分為原發性感染和繼發性感染兩種臨床類型，其中繼發性感染又包括再激活感染和再感染[10-12]。免疫功能正常人群感染 HC-MV后不會表現出明顯病癥[13-14]，但免疫功能不全人群（如艾滋病患者和實體器官/骨髓移植受者）體內病毒處于再激活階段時容易發生肝炎、結腸炎、食管炎等疾病甚至導致死亡[15]

病毒分離培養法是HCMV感染診斷的金標準[16]，但該方法靈敏度低、陽性率低、操作復雜，不利于早期快速診斷。許多新型HCMV檢測方法（HCMV抗原血癥測定[4]、定量聚合酶鏈反應[17-18]]ELISA[19-20]、靶向質譜[21-23]等）被陸續開發出來，應用于HCMV感染的早期診斷。在上述各種方法中，ELISA是應用最廣泛的免疫學檢測技術，具有操作簡便、靈敏度高、高通量等優點，可以滿足大批量樣品檢測的需求[24]

HCMV在宿主細胞內的基因轉錄和表達呈現一定時序性，可分為3個階段：即刻早期、早期和晚期[7]。其中，病毒IE1 基因產物的表達對于病毒基因表達的時間級聯至關重要， IEI 基因表達后，病毒早期基因和晚期基因才開始轉錄。已有研究發現，HCMV感染單核/巨噬細胞 4～5 d后產生可達到檢測水平的IE1蛋白，而病毒晚期蛋白在7d左右才開始積累[25]。因此，在晚期蛋白 pp65 和 pp150的基礎上添加IE1蛋白作為包被抗原，可能有助于縮短HCMV感染檢測的空窗期。

本研究基于HCMV IE1/pp65/pp150 重組蛋白，通過優化反應條件，建立了一種檢測人類血清當中HCMVIgG抗體的間接ELISA檢測方法。結果顯示，HCMV間接ELISA檢測方法的最佳反應條件：最佳抗原包被濃度為 3.0mg/L ，最佳血清稀釋倍數為 1：200 ，最佳封閉液 5% 為BSA，最佳封閉時間為 ，最佳血清孵育時間為 90min ，最佳二抗稀釋倍數為 1：8 000 ，最佳二抗孵育時間為 30min 最佳顯色時間為 15min 。

對本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法進行性能驗證，結果顯示，批內、批間CV均小于10% ，表明該方法具有良好的重復性；陽性患者血清樣本稀釋度為 1：3 200 時的吸光度值為0.591，仍高于臨界值0.360，表明該方法具有良好的靈敏度；檢測HSV-1型、HSV-2型及EBV 陽性患者血清樣本的吸光度值均小于臨界值，表明該方法不會與其他皰疹病毒發生交叉反應，有良好的特異度。

本研究建立的HCMV間接ELISA檢測方法與臨床上廣泛使用的巨細胞病毒IgGELISA試劑盒的總體符合率為 94.0% ，此結果表明兩種方法具有較高的符合率。兩種方法在檢測患者HCMV感染情況過程中存在部分檢測結果不一致，其可能原因如下： ① 患者正處于HCMV早期感染，還未產生與巨細胞病毒 IgG ELISA試劑盒包被的晚期蛋白特異性結合的HCMV抗體，從而造成假陰性； ② 巨細胞病毒 IgG ELISA試劑盒包被蛋白與血清中的抗體發生了非特異性結合，從而導致假陽性； ③ 患者免疫應答較弱，產生的抗體未達到最低檢測限從而導致假陰性。還有其他的因素會影響HCMV間接ELISA檢測方法的結果，如檢測樣本是否溶血、人工洗板時是否造成各孔間污染、酶標板使用前是否進行校準等。

綜上所述，本研究成功建立了一種以HCMVIE1/pp65/pp150 重組蛋白為包被抗原的HCMV間接ELISA檢測方法，該方法具有良好的重復性、靈敏度、特異度和符合率，有望應用于大規模人群HCMV感染的檢測中，以提高HCMV感染的檢出效率。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學科學倫理委員會的審核批準（文件號QDU-HEC-2024442）。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：李旭、王珊、黃歡參與了研究設計；李旭、錢冬萌、王斌參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 李京蔓 厲建強）