胃腺癌ACRG分型的臨床意義及基于活檢病理組織學的p53表達預測模型的建立

[中圖分類號] R735.2 [文獻標志碼] A

The clinical significance of the ACRG classification in gastric adenocarcinoma and the establishment of a p53 expression prediction model based on biopsy histopathology LIU Xinyu，LIU Yinbo，LIU Shunli ， ZHAO Han ， SONG Yaolin ， XING Xiaoming （Department of Pathology，The Afiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao ，China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the clinicopathological significanceof the Asian Cancer Research Group（ACRG） clasification ingastricadenocarcinomaandtodevelopa predictive modelforp53proteinexpressionin gastricadenocarcinoma. MethodsAtotalof137patientsdiagnosed withgastricadenocarcinomawhounderwentsurgeryattheAfiliated Hospitalof QingdaoUniversitybetween2O15and2023wereincludedinthisstudy.Postoperativepathologicalspecimenswerecolectedandimmunohistochemicallystained todetermine the ACRGclasification.Patients were grouped according to ACRG subtypes.These groups werecomparedintermsofage，sex，surgicalaproach，tumorlocation，diferentiationstatus，pathologicaltype，prechemotherapyBormann classfication，clinical stage，tumor markerlevels，tumorrecurence，and metastasis.Preoperative hematoxylinand eosin-stainedendoscopic biopsyslidesfromallpatientsweredigitizedbyscanningandrandomlydividedintoatrainingset（09cases）andavalidation set（28cases）.Self-supervisedlearning andfeature extraction wereperformedonthe training setimages using SimCLRwithResNet-18asthebackbonenetwork.Subsequently，theimages wereinputintoafeatureaggregation-basedclassificationnetwork toestablishapredictive modelforp53proteinexpresioningastricadenocarcinoma.Themodelperformancewasevaluatedinthevalidationset.Receiveroperatingcharacteristiccurves were plotedforboththetrainingandvalidationsets，andthe areaunder thecurve，accuracy，sensivity，specificity，positive predictivevalue，and negative predictive value werecalculated. ResultsThe ACRG classification of gastric adenocarcinoma was significantly asociated with clinical stage （ χ²=13.049，Plt; 0.05）.Inthetrainingset，theareaunderthecurve，accuracy，sensitivity，specificity，positive predictivevalue，andnegativepre dictive valueof thep53 protein expressionprediction model were0.920，0.719，0.896，0.724，0.875，and0.763，respectively; thesevaluesinthevalidationsetwere0.890，0.643，0.938，0.250，0.625，and0.750，respectively.ConclusionTheACRGclas sificationofgastricadenocarcinomaissignificantlycorelatedwithclinicalstage.Thep53proteinexpresionpredictionmodelcan assistin preoperativeACRGclasification，thereby improving theaccuracyofdiagnosisand treatmentof gastric adenocarcinoma.

所有惡性腫瘤中的發病率和死亡率均居第三位[]本病癥狀隱匿，確診時大多處于進展期，需要采用手術切除為主，結合放化療及靶向治療的綜合治療方式[2-3]。胃癌是一種高度異質性的惡性腫瘤，傳統組織病理分型難以滿足個體化診療需求，2015年亞洲癌癥研究組織（ACRG）基于基因靶向測序和全基因組拷貝數微陣列技術將胃癌在分子層面分為微衛星不穩定（MSI型、微衛星穩定/上皮間質轉化（MSS/EMT）型、微衛星穩定/p53活性 （MSS/p53+） 型和微衛星穩定p53無活性 （MSS/p53-） 型4型。研究表明ACRG分型在指導胃癌的靶向治療及預后評估方面具有重要意義[4]。

目前ACRG分型對實驗室平臺以及生信分析的要求比較高，難以廣泛開展。有研究發現p53免疫組化染色與TP53二代基因測序結果的一致性為88.0%～92.1%^[5-6] ，通過免疫組化染色判讀錯配修復（MMR）蛋白、E-Cadherin及p53蛋白的表達，可作為一種便捷、經濟、準確的方法替代分子檢測對胃腺癌患者進行ACRG分型[。當前通過免疫組化染色判斷p53蛋白表達并輔助腫瘤分子分型在婦科腫瘤中已有明確共識]，但其對胃腺癌ACRG分型的預測價值鮮有研究。近年來，基于組織病理學圖像構建的人工智能（AI深度學習模型在多項研究中被證實能夠輔助臨床病理醫師進行診斷和鑒別診斷，并具有良好性能[9-11]。本研究首先分析了AC-RG分型對胃腺癌患者的臨床病理學意義，并基于術前胃癌活檢HE染色切片構建了胃腺癌p53蛋白表達預測模型，以期輔助胃腺癌患者術前進行AC-RG分型。

1資料與方法

1.1 資料收集

選擇2015—2023年于青島大學附屬醫院診斷為胃腺癌并接受手術的患者137例，收集患者的年齡、性別、手術方式，腫瘤的位置、分化程度、病理類型，化療前的Borrmann分型、臨床分期、腫瘤標志物水平，以及復發/轉移情況等信息，并獲取患者術前胃鏡活檢HE染色切片和術后胃腺癌組織病理標本蠟塊?；颊呒{入標準： ① 病理診斷為胃腺癌，且胃鏡活檢HE染色切片和術后胃腺癌組織病理標本蠟塊保存完好者； ② 臨床及隨訪信息完整者； ③ 接受胃腺癌根治性手術者； ④ 術前接受氟尿嘧啶化療，療程為 2～8 個周期者。排除標準： ① 合并其他原發惡性腫瘤患者； ② 術前胃鏡活檢組織中無明確癌組織者。

1.2術后胃腺癌組織病理標本的免疫組化染色

采用PV-6000法對術后胃腺癌組織病理標本進行MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、E-Cadherin和p53蛋白的免疫組化染色。將病理標本蠟塊經脫蠟、水化后，制作成厚 3μm 的切片，使用體積分數0.03過氧化氫溶液滅活標本組織中內源性過氧化物酶 10min ，使用檸檬酸鹽緩沖液（ Φ_pH6.0 高壓修復切片 2min ;向切片內滴加一抗 ！MLH1（1：200）、PMS2（1：200）、MSH2（1：200）、MSH6（1：200）、E-Cadherin （1：200） ，以PBS作為陰性對照， 4^°C 孵育過夜后，滴加通用型二抗， 孵育 30min ;使用DAB顯色 3min ，并使用蘇木精復染后脫水、封片。

1.3免疫組化染色結果判讀及ACRG分型

免疫組化染色切片由兩位具有10年以上工作經驗的病理醫師共同閱片，有爭議的切片由第三位具有15年以上工作經驗的病理醫師進行判讀并得出最終患者ACRG分型的結論。將MLH1、PMS2、MSH2、MSH6蛋白的細胞核表達丟失判定為MSI型[12-13]，其余歸類為 MSS 型;將E-cadherin 蛋白細胞膜表達丟失或者細胞質異常表達判定為MSS/EMT型[14]；p53免疫組化染色的判讀依據不同克隆號p53蛋白抗體在胃腺癌中表達[15]及子宮內膜癌判讀標準[8共同確定，分為p53突變型（ p53+） 和野生型（p53一）表達。

1.4胃腺癌p53蛋白表達預測模型的建立

將所有患者的術前胃鏡活檢HE染色切片經數字切片掃描儀（Pannoramic，3DHISTECH）掃描，獲得全切片數字化圖像（WSI）。采用分層隨機抽樣方法，將所有的患者分為訓練集（109例）以及驗證集（28例）。將所有患者的WSI放大4O0倍后截圖，并裁剪為 224×224 像素大小的圖像塊，每個圖像塊被賦予與WSI相同的p53蛋白分型標簽，最終獲得55341個有效圖像塊，包含訓練集患者的49807個90.1% ）有效圖像塊（用于模型訓練）以及驗證集患者的5534個 （9.9%） 有效圖像塊（用于模型驗證）。隨后采用以ResNet-18為骨干網絡的SimCLR方法[16]對訓練集圖像塊進行特征提取，輸入裁剪好的圖像塊，輸出為該圖像塊的512維特征向量。最后使用基于特征聚合的分類網絡進行判讀結果輸出，完成p53蛋白表達的判讀，從而構建出胃腺癌 p53蛋白表達預測模型。將模型在訓練集中進行調試以達到最佳性能，并輸人驗證集圖像塊對模型性能進行檢驗。

1.5 統計學處理

采用SPSS22.0軟件對數據進行統計學分析。計數資料以例（率）表示，組間比較采用 X² 檢驗或Fisher確切檢驗，以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。采用Python軟件繪制模型在訓練集及驗證集中的受試者工作特征（ROC）曲線，并計算曲線下面積（AUC）、準確度、靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值。

2結果

2.1 胃腺癌ACRG分型的臨床病理學意義

137例胃腺癌患者中，ACRG分型為MSI型者7例 （5.1% ）， MSS/p53+ 型者65例 （47.4% ），MSS/p53－型者61例 （44.5% ），MSS/EMT型者4例0 3.0%） 。見圖1。 χ² 檢驗結果顯示，四種ACRG分型患者的化療前臨床分期差異具有顯著性（ χ²= 13.049，Plt;0.05） 。見表1。

2.2 胃腺癌p53蛋白表達預測模型的性能評價

ROC曲線結果顯示，胃腺癌p53蛋白表達預測模型在訓練集中的AUC、準確率、靈敏度、特異度、陽性預測值以及陰性預測值分別為0.920、0.719、0.896、0.724、0.875、0.763，在驗證集中上述指標分別為0.890、0.643、0.938、0.250、0.625、0.750。見圖2。在驗證集28例患者的p53蛋白表達預測中，有18 例被正確預測，包括15例突變型和3例野生型；10例被錯誤預測，包括1例突變型和9例野生型。

3討論

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均居高不下[1]。隨著胃癌個體化治療研究的不斷深入，傳統的組織病理學分型已經難以全面指導臨床決策。在此背景下，基于基因組學的胃癌分子分型的確立逐漸成為該病精準診療的重要前提。近十幾年，不少學者均對胃癌的分子分型進行了相關研究， TAN^[17]"將胃癌分為腸型基因型和彌漫型基因型，LEI等[18]將胃癌分為間質型、增殖型和代謝型，而癌癥基因組圖譜（TCGA）則將胃癌分為EBV感染型、MSI型、基因組穩定型和染色體不穩定型[19]。2015年ACRG基于DNA的MMR狀態、細胞表型的EMT特征及p53通路功能狀態將胃癌在分子層面分為四型[4]，該分型在揭示腫瘤異質性，預測患者復發風險、轉移傾向及預后方面均表現出較高價值，并且在亞洲人群中具有較高的適用性和臨床參考意義[20]。

A：MLH1陽性表達，B：MLH1陰性表達，C：PMS2陽性表達，D：PMS2陰性表達，E：MSH2 陽性表達，F：MSH2陰性表達，G：MSH6陽性 表達，H：MSH6陰性表達，I：E-cadherin陽性表達，G：E-cadherin陰性表達，K：p53蛋白突變型表達，L：p53蛋白野生型表達；上述放大倍數均 為400倍

本研究首先采用免疫組化染色法對137例胃腺癌進行了ACRG分型，并探討了ACRG分型的臨床意義，結果發現ACRG分型與胃腺癌患者化療前臨床分期顯著相關。ACRG分型中，MSS/P53十型常伴隨TP53突變，已有研究表明TP53突變不僅影響細胞周期調控，還可能通過促進細胞外基質的降解、增強遷移能力等機制加速腫瘤進展與遠處轉移[21]。MSI型由于DNA 錯配修復缺陷導致基因組高頻突變，產生大量新抗原，這些新抗原可被免疫系統識別，激活強烈的抗腫瘤免疫反應，從而抑制腫瘤進展和轉移[22]。MSS/EMT型因啟動子高甲基化導致部分基因表達沉默，腫瘤細胞獲得間質表型（如E-cadherin丟失），從而增強了腫瘤的遷移和腹膜種植能力[23]。這可能是使得ACRG分型與患者臨床分期顯著相關的潛在機制。此外，本研究中ACRG分型與腫瘤部位、Borrmann分型等臨床病理特征以及復發、轉移之間未呈現顯著相關性，這與既往一些報道存在差異[4，20]。我們認為該差異可能與研究所聚焦的人群構成不同有關，本研究納入患者多為臨床 I～N 期的晚期病例，其癌組織的腫瘤生物學特征和疾病演變路徑可能與早中期患者存在差異，因而導致ACRG分型在本研究中展現的臨床意義不同于上述研究。

目前ACRG分型的臨床應用仍面臨一定挑戰，例如在評估p53蛋白表達狀態時，結果常受病理科醫師主觀性影響且缺乏統一判讀標準。因此，開發一種基于胃腺癌活檢組織的p53蛋白表達預測模型，對于提高ACRG分型質量及推進其臨床應用具有重要意義。近年來AI在病理學診斷方面的使用逐漸成熟，KATHER等[24]以及MUTI等[25]均通過AI深度學習建立了基于病理HE染色切片的胃腸道腫瘤MSI狀態預測模型。此外，本研究團隊基于術前胃鏡活檢HE切片及胃癌化療前增強CT圖像構建的AI模型，也被證實可有效預測胃癌術前化療效果[26]。為解決胃腺癌組織中p53蛋白判讀困難且標準不一問題，本研究利用術前胃癌活檢HE染色切片圖像構建了一個p53蛋白表達預測模型。ROC曲線結果顯示，該模型在訓練集和驗證集中AUC均較高，表明模型具有良好的整體預測效能。此外，該模型在驗證集中的靈敏度為0.938，提示模型在識別p53突變型表達方面具有較強能力，但特異度僅為0.250，提示其識別p53野生型表達的能力不足。這一偏差一方面可能源于AI所能捕捉到的p53突變型表達的組織學特征更為明顯；另一方面該結果與模型設計策略相關，即對表達模式不明確的病例傾向于判定為突變型，以優先保證突變型病例的檢出率，發揮分子檢測前的初步篩查作用，從而篩選出可能具有TP53基因功能異常的患者。本研究后續在對誤判的野生型樣本進行分析時發現，其組織病理圖像常伴有顯著壞死、炎細胞浸潤及腫瘤成分較少等特征，提示非腫瘤區域的干擾可能降低了模型的判別能力。為提升模型在此類復雜樣本中的預測性能，后續研究將嘗試引入人工標注腫瘤區域或者結合語義分割模型，以精準地識別腫瘤組織區域，從而減少非特異性背景對模型預測結果的干擾。

總之，本研究結果顯示ACRG分型與胃腺癌患者化療前的臨床分期呈顯著相關，同時基于胃鏡活檢胃腺癌組織HE染色切片圖像構建了p53蛋白表達預測模型，該模型在輔助預測胃腺癌組織中p53蛋白的表達方面具有一定的潛力，未來有望作為病理醫師的輔助診斷工具在臨床進行推廣應用，以解決ACRG分型臨床應用困難的問題，從而更準確地指導該病的診斷與治療。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYEC2024-29）。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

作者聲明：劉新宇、邢曉明、宋瑤琳、劉順利、劉胤伯參與了研究設計；劉新宇、邢曉明、宋瑤琳、趙涵參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）