丁酸鈉對EB病毒陽性胃癌細胞EB病毒活化的影響及其機制

[中圖分類號] R394；R735.2 [文獻標志碼] A

Effect and mechanism sodium butyrate on the activation Epstein-Barr virus in Epstein-Barr virus-positive gastric cancer cellsTIAN ， CHEN ，LIU （ ， ， ， ，）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate theeffectand mechanism sodium butyrate（NaB）ontheactivation EpsteinBarr virus（EBV）inEBV-positivegastriccancercells.MethodsEBV-positivegastriccancercells（AGS-EBVcells）weredivided nto groups A，B，andC，and thecels in groupA were culturedroutinelyfor12 hours，while those in groups Band C were treated withNaBfor12and 24hoursrespectively.Transcriptomesequencingwas performedforthe genes AGS-EBVcelsand theEBV genes，and groups A，B，andCwerecomparedinterms therelative expressionlevelskeylatent genes and keylytic genes EBVincels.Dierentiallyexpressed genes（DEGs）were identifiedbetweengroupsA，B，andC，andthe top5upregulated DEGs and the top 5 downregulated DEGs with smaller P values were considered significant DEGs，while RT-qPCR was used to measuretherelativeexpresionlevels significantDEGs.TheGOfunctionalenrichmentanalysisandthe KEGG pathwayenrichmentanalysis were performed forallDEGs identified，andthe proteins enriched in significant pathways（the pathways with Plt;0.05 in the KEGG pathway enrichment analysis）were considered key pathway proteins，while Western blotting was used to mea-sure therelative expression levels key pathway proteinsin groups A， B，and C.TheDEGs in groupsA，B，andCwere comparedwith the transcription factors in the AnimalTFDB/PlantTFDB database，and the top5 transcription factors with smaler P values were se lectedascoretranscriptionfactors，whileRT-qPCR wasused tomeasuretherelativeexpresionlevelscoretranscriptionfactors in groups A，B，andC.ResultsCompared with group A，groups Band Chad significantincreases in therelative expresionlevels key latent genes（EBNA-1，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA- 3C ，EBNA .LP LMP-I ，LMP-2A，LMP-2B and RPMS1） and lytic period genes（BZLF1，BRLF1 and BHLF1）（ ：t=2.67-14.36，Plt;0.05） ，and group C had significantly higher expression levels these genes than group B （t=2.21-6.97，Plt;0.05） .Compared with group A，groupB had significant increases in the relative expression levels SCN1A，RFPL4AL1， RORB ，and CACNG7 in cells （t=2.81-13.93，Plt;0.05） and significant reductions in the relative expression levels MIR205HG ， PLAAT4 ， and OAS2 （t=4.47-623.30，Plt;0.05） ; compared with group A，group C had significant increases in the relative expression levels NLRP5 ，SCN1A，RFPL4AL1，RORB，CACNG7，and PLA2G2E Ω_t=4.32-7.43 Plt;0.05 ）and significant reductions in the relative expresson levels RS17P11，MIR205HG， PLAAT4 ，and OAS2 .Compared with group A in terms the core transcription factors，groups B and C had significant increases in the relative mRNA expression levels EGR1， PGR ，and SOX2 （ t=3.22-16.60，Plt;0.05） and significant reductions in the relative mRNA expression levels CEBPD andE2F3（ t=4.18-28.59，Plt;0.05） .Compared with group A，group B had significant reductions in the relative expression levels p65，p-p65，AKT，and p-AKT 0.05），and compared withgroupA，groupChadsignificantreductions intherelativeexpresionlevels p65，p-p65，AK，and p-AKT and a significant increase in the expression level p -ERK ?t=5.72-8.92，Plt;0.05） .ConclusionNaB promotes the activation EBV inEBV-positive gastric cancercels byactivating the MAPK signaling pathwayand inhibiting the NF- κB pathway， andthecoretranscriptionfactorEGRlpromotestheactivationthevirusbyfacliatingthetranscriptiontheEBVlyticgenes BZLF1 and BRLF1.

[KEY WORDs]Herpesvirus 4，human; Butyric acid; Virus activation;Gene expression regulation; Stomach neoplasms； In vitro techniques

EB病毒相關胃癌（Epstein-Barr virus-associa-tedgastriccancer，EBVaGC）是胃癌的一種獨特的分子亞型[1-2]。EB 病毒（EBV）主要感染口咽部上皮細胞和B細胞，并在外周血記憶B細胞中建立長期潛伏感染狀態[3]。EBV處于潛伏感染狀態時復制被抑制，僅有少數潛伏期基因表達，以維持其潛伏狀態[4-5]。在某些特定條件下，如機體免疫功能減弱或受到某些物理化學因素刺激后，病毒基因的啟動子可能會被重新活化，啟動病毒進人裂解期，并表達大量的裂解期基因[]。丁酸鈉（NaB）是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，屬非細胞毒類抗癌化合物，可影響細胞內多種表觀遺傳調控機制，包括組蛋白的超乙酰化、DNA的甲基化及非組蛋白的修飾等過程]有研究顯示，NaB能夠誘導EBV從潛伏期進入裂解期[8-10]。但目前關于NaB誘導EBV活化的具體機制尚不明確。本研究通過對NaB處理不同時間點的EBV陽性胃癌細胞進行轉錄組測序，篩選出差異表達基因（DEGs）并進行生物信息學分析，同時對分析的結果進行初步驗證，以全面了解NaB誘導EBV裂解復制的分子機制。

1材料與方法

1.1 細胞的分組和處理

將EBV陽性胃癌AGS-EBV細胞（中山大學第三附屬醫院贈予）置于含有 10% 胎牛血清、青霉素（0.1U/L） 和鏈霉素 （100mg/L） 的DMEM培養基（完全培養基）中，于 、含體積分數 0.05CO₂ 的濕潤環境中培養，當細胞密度約達 70% 時分為 A～ C組，每組均設置3個復孔。A組細胞在完全培養基中常規培養 12h ；分別于B組和C組的完全培養基中加入 3mmol/L 的NaB后，B組細胞繼續培養12h，C 組細胞繼續培養 24h 。

1.2 A～C 組細胞中EBV基因的檢測、轉錄組測序 和DEGs的富集分析

各組細胞處理結束后，使用胰蛋白酶進行消化，離心后收集至凍存管中。委托北京和元生物技術有限公司對AGS-EBV細胞基因以及EBV基因進行轉錄組測序，獲得原始測序數據。測定 A～C 組細胞中的EBV關鍵潛伏期基因（EBNA-1、EBNA-3A，EBNA-3B+EBNA-3C，EBNA-LP，RPMSl， LMP-2A、LMP-2B和LMP-1）以及關鍵裂解期基因 （BZLF1+BRLF1 和BHLF1）的相對表達量，對A組與B組、A組與C組、B組與C組間病毒基因的相對表達量進行統計學分析。其中EBNA-3B與 EBNA–3C，BZLFI 與BRLF1有部分重疊序列，因此檢測的是它們合并后基因的相對表達量，分別用 EBNA-3B+EBNA-3C 和 BZLF1+BRLF1 表示。收集 A～C 組AGS-EBV細胞的轉錄組測序結果，并篩選出A組與B組、A組與C組細胞間的DEGs，按照 P 值從小到大排序，分別選取表達上調和下調的前5個DEGs為顯著DEGs，作為后續實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測的目標基因。對于上述篩選出的所有DEGs進行GO功能分析、KEGG通路分析，將富集于顯著通路（KEGG通路分析中 Plt;0.05 的通路）中的蛋白（關鍵通路蛋白）作為后續Westernblotting檢測目標蛋白。將 A～ C組細胞中所有的DEGs與AnimalTFDB/Plant-TFDB數據庫中收錄的轉錄因子基因進行比對，分析獲得DEGs涉及的所有轉錄因子基因及轉錄因子家族，將轉錄因子基因按照 P 值從小到大排序，選取前5個轉錄因子基因為核心轉錄因子基因，作為后續RT-qPCR檢測的目標基因。

1.3RT-qPCR檢測 A～C 組細胞中顯著DEGs和核心轉錄因子基因的表達

將處理結束后的 A～C 組細胞，經胰蛋白酶消化并離心后，使用TRIzol法從各組細胞當中提取總RNA。測定RNA濃度及純度后，使用湖南艾科瑞生物有限公司的反轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，通過LightCycler96序列檢測系統進行PCR反應，反應條件為： 95°C 預變性 10min ；然后 95°C 變性 10s，60^°C 退火 10s，72^°C 延伸 15s ，共40個循環。根據試劑盒說明書上的要求配制反應體系，以 β actin作為內參，使用 2^-ΔΔCT 公式計算各樣本中目標基因相對表達量。引物名稱及其序列見表1。

1.4Westernblotting實驗檢測細胞中關鍵通路蛋白的表達

將處理結束后的 A～C 組細胞，經胰蛋白酶消化離心。用含有 1%PMSF 和 1% 磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液充分裂解細胞后，采用BCA法測定蛋白質濃度；使用SDS-PAGE法進行電泳、轉膜；將膜以 5% 脫脂牛奶室溫封閉 ^2h ，加入目的蛋白一抗后4°C 孵育過夜；第2天加入二抗室溫孵育 后，加入增強型化學發光顯色液，置于蛋白曝光儀中顯示蛋白條帶。以 β? -actin為內參，使用ImageJ軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學處理

采用GraphPadPrism軟件對數據進行統計。實驗重復3次。計量資料以 x±s 表示，兩組間比較采用Student Ψ_t 檢驗。以 Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

2結果

2.1AGS-EBV細胞中EBV關鍵潛伏期基因和關 鍵裂解期基因的表達情況

B組與A組、C組與A組比較，細胞中EBV關鍵潛伏期基因（EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B+EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B和 RPMSl ）以及關鍵裂解期基因 （BZLF1+ BRLF1和BHLF1）的相對表達量均顯著上調（ ?_t= 2.67～14.36，Plt;0.05），C 組上述基因相對表達量顯著高于B組 （t=2.21～6.97，Plt;0.05） 。見表2。

2.2各組間DEGs的GO功能分析、KEGG通路分析和轉錄因子基因分析

轉錄組測序分析結果顯示，A、B組細胞間的DEGs共4843個，其中上調基因3001個，下調基因1842個；GO功能分析顯示，這些DEGs主要富集于多細胞生物體過程、細胞分化、細胞信號等過程；KEGG通路分析顯示，這些DEGs主要參與細胞因子與細胞因子受體的相互作用、 NF-κB 通路、MAPK通路和PI3K-AKT通路。A、C組細胞之間的DEGs共6577個，其中4761個上調，1816個下調；GO功能分析顯示，這些DEGs主要富集于多細胞生物體過程、細胞分化、細胞發育過程等；KEGG通路分析顯示，這些DEGs主要參與蛋白質消化與吸收、胰島素分泌、MAPK通路和PI3K-AKT通路。按照 P 值從小到大排序后， A～C 組細胞中上調的前5個顯著DEGs為NLRP5、SCN1A、RF-PL4AL1、RORB和CACNG7；下調的前5個顯著DEGs分別為RS17P11、PLA2GRE、MIR205HG、PLAAT4和OAS2。

轉錄因子基因分析結果顯示，A、B組細胞之間DEGs所涉及的轉錄因子基因共358個，其中178個上調，180個下調；A、C組細胞之間DEGs所涉及的轉錄因子基因共414個，其中273個上調，141個下調。上述所有轉錄因子基因主要屬于zf-C2H2、Homeobox和bHLH轉錄因子家族。 P 值最小的前5個核心轉錄因子基因為CEBPD、EGR、E2F3、PGR和 SOX2。

2.3 A～C 組細胞中顯著DEGs以及核心轉錄因子 基因表達量比較

RT-qPCR檢測結果顯示，B組與A組比較，細胞中SCN1A、RFPL4AL1、RORB以及CACNG7的相對表達量均顯著上調 （t=2.81～13.93，Plt; 0.05），MIR205HG、PLAAT4以及 OAS2 的相對表達量顯著下調 （t=4.47～623.30，Plt;0.05），NL^- 建RP5、PLA2GRE以及 RSl7PlI 無顯著差異（ Pgt; 0.05）;C組與A組相比較，NLRP5、SCN1A、RF-PL4AL1、RORB、CACNG7以及PLA2GRE的相對表達水平顯著上調 Ω：t=4.32～7.43，Plt;0.05） RS17P11、MIR205HG、PLAAT4和OAS2相對表達量下調（ 。見表3。

與A組相比較，B組、C組中核心轉錄因子基因EGR1、PGR和 的相對表達量顯著上調 （t=3.22～16.60，Plt;0.05），CEBPD 和 E2F3 mRNA的相對表達量則顯著下調（ t=4.18～28.59 .Plt;0.05） 。見表4。

2.4 A～C 組細胞中關鍵通路蛋白相對表達量比較

Westernblotting檢測結果顯示，與A組相比，B組中 p65，p-p65 、AKT和p-AKT的相對表達量顯著下調 Ω^′t=2.87～5.93 ， Plt;0.05 ），ERK 和pERK的表達無顯著差異 （Pgt;0.05） ;C組與A組比較，p65、p-p65、AKT、p-AKT相對表達量顯著下調，p-ERK相對表達量顯著上調 （t=5.72～8.92，Plt; 0.05），ERK相對表達量差異無顯著性 （Pgt;0.05） 。見圖1和表5。

3討論

本研究在NaB處理AGS-EBV細胞 12，24h 時，對AGS-EBV細胞內的EBV基因進行轉錄組測序。研究結果顯示，隨著NaB處理時間的延長，細胞中EBV關鍵潛伏期基因（EBNA-1、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2A、LMP-2B和RPMS1）以及關鍵裂解期基因（BZLF1、BRLF1和BHLF1）表達量均顯著上調。EBV重新活化時BZLF1和BRLF1編碼的即早蛋白Zta和Rta發揮關鍵調控作用。研究表明，這兩種病毒轉錄因子通過啟動下游病毒基因的轉錄級聯反應，促進 EBV 從潛伏期進入裂解性復制周期[14]。EBV活化期間，BHLF1基因的表達水平顯著上調，成為病毒基因組中表達最為豐富的基因之一。因此，目前BHLF1表達水平已被用作臨床上診斷EBV 是否處于活化狀態的指標[15]。本研究同時對NaB處理 ^12，24h 的AGS-EBV細胞進行轉錄組測序，篩選出A、B組和A、C組細胞之間所有DEGs，并進行GO功能分析和KEGG通路分析，并對A、B組和A、C組間細胞的顯著DEGs進行RT-qPCR檢測。結果顯示，B組與A組比較，細胞中SCN1A等基因表達顯著上調， MIR205HG 等基因表達水平顯著下調;C組與A組相比較，NLRP5等基因表達水平顯著上調，RS17P11等基因表達水平顯著下調。GO功能分析結果顯示，這些顯著DEGs主要富集于多細胞間相互作用、細胞分化、細胞發育過程等，提示NaB可以顯著影響參與信號轉導與DNA復制的 DEGs表達水平。

KEGG通路分析顯示，A、B組和A、C組細胞之間所有DEGs主要參與了 NF?RB 通路、MAPK通路和PI3K-AKT通路等。通過Westernblotting實驗對關鍵通路蛋白的檢測結果顯示，與A組相比，B組中 NF-κB 通路的效應蛋白 p65.p-p65 以及PI3K-AKT通路的效應蛋白AKT和p-AKT的相對表達量顯著下調，MAPK通路相關蛋白ERK以及p-ERK的表達無顯著性差異;C組與A組比較，（20號 p65.p7p65 、AKT和 -AKT相對表達量顯著下調，p-ERK的表達量顯著上調，ERK的表達無顯著差異。上述結果提示NaB激活了MAPK通路，并抑制 NF-κB 通路和PI3K-AKT通路。目前，研究報道MAPK通路的激活能夠促進EBV的活化。LI等[16]研究發現，在AGS-EBV 細胞中EBV所編碼的潛伏期蛋白LMP1通過上調 p -ERK等MAPK通路效應蛋白，誘導p53磷酸化并增強其穩定性，從而促進EBV進入裂解期；在EBV陽性的淋巴瘤細胞系中EBV編碼蛋白BGLF2可以誘導MAPK通路的激活，增強EBV裂解復制[17」。 NF-κB 通路的抑制也被證實與EBV的復制密切相關。研究報道，NF-κB 通路抑制劑BAY11-7082和Z-LLF-CHO以劑量依賴性的方式激活EBV的復制[18-19]。MORI等[20]研究表明在EBV陽性的伯基特淋巴瘤細胞系中，PI3K-AKT通路抑制劑可以降低EBV衣殼抗原表達，并且抑制EBV裂解基因BRLF1的表達，提示PI3K-AKT通路可能促進了EBV的活化。然而NaB活化EBV的同時又抑制了PI3K-AKT通路，表明NaB介導的EBV激活可能與PI3K-AKT通路并無顯著關系。綜上，EBV的活化可能受到MAPK通路激活以及 NF-κB 通路抑制的協同調控，而關于PI3K-AKT通路在EBV復制過程中的作用目前研究較少，本研究結果為后續研究提示了新的研究方向。

本研究結果顯示，與A組相比，B、C組中核心轉錄因子基因EGR1、PGR和SOX2的相對表達量顯著上調，CEBPD和E2F3的相對表達量顯著下調。其中，EGR1以及PGR編碼的蛋白均是屬于bHLH家族，SOX2編碼的蛋白屬于HMG家族，CEBPD以及E2F3編碼的蛋白屬于zf-C2H2家族。目前，關于zf-C2H2家族在人類中的研究報道較少。有研究通過磷酸化蛋白質組學技術在人類卵巢癌樣本中鑒定出了該家族相關的轉錄因子；同時有研究結果表明，bHLH轉錄因子家族成員在鼻咽上皮細胞中的表達水平與EBV編碼的蛋白LMP1存在顯著相關性[21-23]。然而，還尚未見 zf-C2H2 和bHLH這兩個轉錄因子家族與EBV活化過程之間潛在關聯的研究報道。既往研究表明HMG家族成員HMGB1能夠增強EBV即早蛋白Rta介導的BHLF1轉錄，進而參與EBV的活化過程[24]。在上述5個核心轉錄因子基因中，EGR1和SOX2已被證實與EBV的活化相關。EGR1是EBV陽性B細胞中EBV活化所需的轉錄因子之一，EGR1與B細胞表面受體結合以后，在MAPK通路的誘導下，可以通過上調EBV裂解基因BZLF1以及BRLF1的表達，從而激活EBV的復制[25-27]。除此之外，WANG等[28]通過對EBV活化的鼻咽癌細胞進行轉錄組測序，結果發現，細胞中SOX2的表達水平相較未活化的鼻咽癌細胞顯著上調，但SOX2在EBV活化中的作用機制尚需進一步研究明確。

綜上所述，NaB通過復雜的細胞內調控網絡，激活EBV由潛伏期進入裂解期，其可能通過抑制NF-κB 通路并激活MAPK-ERK通路來實現的；同時，核心轉錄因子基因EGR1通過上調EBV裂解基因BZLF1和BRLF1的表達進一步活化EBV，而SOX2可能與EBV的活化存在關聯，但需要進一步實驗驗證。

作者聲明：田昭鑫、陳鈺英參與了研究設計；田昭鑫、劉雯參與了論文的寫作與修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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